SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件

、SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用、SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用1SNP的概念單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于單個(gè)核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。它包括單堿基的轉(zhuǎn)換,顛換、插入及缺失等形式。SNP的概念單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleot2SNP的特點(diǎn)（1）密度高SNP在人類(lèi)基因組的平均密度估計(jì)為1\1000bp,在整個(gè)基因組的分布達(dá)3×106個(gè)。（2）富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平,因此,它們可能代表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素。（3）遺傳穩(wěn)定性與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比,SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化SNP標(biāo)記在人群中只有兩種等位型(allele)。這樣在檢測(cè)時(shí)只需一個(gè)“+\-”或“全\無(wú)”的方式,這使得基于SNP的檢測(cè)分析方法易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

SNP的特點(diǎn)3種族遺傳學(xué)Tang等研究了來(lái)自世界五個(gè)地區(qū)(中國(guó)、馬來(lái)、高加索、印度和非洲)人群的MDR1基因的單倍體和連鎖不平衡特征,發(fā)現(xiàn)具有e12/1236T2e21/

2677T2e26/3435T亞型的單倍型mh5在非洲人群以外的四種人群中高度表達(dá),而具有e12/1236C2e21/2677G2e26/3435C亞型的單倍型mh7在非洲人群中占了1/3以上,進(jìn)一步證明了種族間的表形差異。SNP的應(yīng)用

種族遺傳學(xué)SNP的應(yīng)用4疾病易感性研究原理：SNPs被認(rèn)為是一種穩(wěn)定遺傳的早期突變,與疾病有著穩(wěn)定的相關(guān)性。當(dāng)一個(gè)遺傳標(biāo)記的頻率在患者明顯超過(guò)非患者時(shí),即表明該標(biāo)記與疾病關(guān)聯(lián),通過(guò)比較分析兩者的單倍型和研究連鎖不平衡性,可將基因組中任何未知的致病基因定位。Horikawa等應(yīng)用SNPs作為遺傳標(biāo)記通過(guò)基于連鎖不平衡的相關(guān)分析,在墨西哥裔美國(guó)人群和北歐人群中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)DM易感基因,該基因第三個(gè)內(nèi)含子上的A/G多態(tài)性(SNP43)同2型糖尿病(2型DM)連鎖,該位點(diǎn)為純合子G的個(gè)體患2型DM的風(fēng)險(xiǎn)增加,這是目前為止所發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與2型DM相關(guān)的SNP,預(yù)示了SNP在DM相關(guān)基因研究中的重要作用。疾病易感性研究5藥物基因組學(xué)研究SNPs可以精細(xì)地反映個(gè)體的遺傳差異,SNPs位點(diǎn)與個(gè)體的藥物反應(yīng)進(jìn)行相關(guān)分析,從而確定基因在藥物作用中的功能和意義。這樣既可以根據(jù)患者的遺傳特性設(shè)計(jì)治療方案,實(shí)現(xiàn)“個(gè)性化治療”,提高藥效，降低藥物的毒副作用,又可以在臨床試驗(yàn)階段為特定的藥物選擇合適的受試者,提高效率,減少費(fèi)用。藥物基因組學(xué)研究6遺傳育種的應(yīng)用檢測(cè)水稻SNP，研究?jī)?yōu)良性狀與SNPs的關(guān)聯(lián)關(guān)系，指導(dǎo)育種。遺傳育種的應(yīng)用7SNP的檢測(cè)方法基于以下9種基本原理:以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ);1.1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法（RFLP）;1.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性法（SSCP）;1.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）;等位基因特異PCR（AS-PCR）;RT-PCR;等位基因特異性雜交;

引物延伸法--單堿基延伸法;

DNA直接測(cè)序法;飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè);變性高效液相色譜(DHPLC)法；SNP的檢測(cè)方法基于以下9種基本原理:81.1RFLP法原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長(zhǎng)度和數(shù)量則會(huì)出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點(diǎn)。1.1RFLP法原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，91.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)原理：?jiǎn)捂淒NA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)在電泳中會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于堿基的組成，單個(gè)堿基的改變也會(huì)影響其構(gòu)象，最終會(huì)導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測(cè)SNP。特點(diǎn)：由于該方法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測(cè)。這種方法的弊端在于不能確定突變類(lèi)型和具體位置。1.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)原理：?jiǎn)捂淒NA在中性條101.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理：是利用長(zhǎng)度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過(guò)梯度變性膠將DNA片段分開(kāi)的電泳技術(shù)。1.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理：是利用長(zhǎng)度相同的雙112.等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3′末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同),另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì),因此,AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú),從而確定基因型的SNP。2.等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)S123.RT-PCR實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(RT-PCR)一種通過(guò)檢測(cè)PCR過(guò)程中和PCR之后產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分等位基因類(lèi)型的SNP檢測(cè)技術(shù),同時(shí)基于熒光能量轉(zhuǎn)移原理(FRET)。每檢測(cè)一個(gè)SNP位點(diǎn)需要一條探針,其3‘端連有淬滅劑基團(tuán),5’端連有熒光劑基團(tuán),最終與SNP位點(diǎn)完全匹配時(shí)探針結(jié)構(gòu)被破壞,從而發(fā)出熒光而被檢測(cè)。3.RT-PCR實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(RT-PCR)一13SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件14定量分析高靈敏TaqMan?GeneExpressionMasterMix定性分析高特異性TaqMan?GenotypingMasterMixAB——NewMasterMix定量分析定性分析AB——NewMasterMix154.等位基因特異性雜交等位基因特異性雜(Allelespecifichybridization,ASH)根據(jù)核苷酸探針和互補(bǔ)的目的片段進(jìn)行雜交，完全匹配和有錯(cuò)配兩種情況下雜交復(fù)合體穩(wěn)定性的不同而將SNP位點(diǎn)檢測(cè)出來(lái)。等位基因特異核苷酸片段分析(ASO)，基因芯片和動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)等。4.等位基因特異性雜交等位基因特異性雜(Allelesp16SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件175.引物延伸法--單堿基延伸法5.引物延伸法--單堿基延伸法18單重SNaPshot數(shù)據(jù)單重SNaPshot數(shù)據(jù)19多重SNaPshot反應(yīng)原理多重SNaPshot反應(yīng)原理20SNaPshot操作流程SNaPshot操作流程21SNaPshot?Multiplex試劑盒SNaPshot?MultiplexReadyReactionMix一管做10個(gè)位點(diǎn)對(duì)照:30個(gè)反應(yīng)6條對(duì)照引物:20A,28G/A,36G,44T,52C/T,60C對(duì)照模板DNA:AmpliconfromCEPHDNA0.01~0.4pmol純化的PCR模板MatrixStandardDS-02[dR110,dR6G,dTAMRA?,dROX?,LIZ?]SNaPshot?Multiplex試劑盒SNaPshot?22質(zhì)粒SNaPshotPCR純化電泳樣本制備電泳PCR產(chǎn)物純化軟件分析質(zhì)粒SNaPshotPCR純化電泳樣本制備電泳PCR產(chǎn)物純23SNaPshotPCRSNaPshotPCR24SNaPshotPCR產(chǎn)物純化Sealplate&incubate乙醇沉淀法:11個(gè)步驟,>1小時(shí)AddreagentsCentrifugeEmptyplateAddreagentsSealplate&incubateAnalyzeRe-suspendDryCentrifugeEmptyplateSealplateSNaPshotPCR產(chǎn)物純化Sealplate&i25加樣震蕩30分鐘分析離心封口BigDye?XTerminator?PurificationKit加樣震蕩30分鐘分析離心封口BigDye?XTermi266.DNA測(cè)序法直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法。原理:通過(guò)對(duì)不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測(cè)序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達(dá)100%。特點(diǎn)：可以得到SNP的類(lèi)型及其準(zhǔn)確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù)。6.DNA測(cè)序法直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法。27SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件287.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè)原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過(guò)與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后,在硅芯片上進(jìn)行引物的退火,延伸反應(yīng),突變部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測(cè)SNP。7.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè)原理29SNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具，通過(guò)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測(cè)?；贛assARRAY?分子量陣列平臺(tái)的iPLEXGOLD技術(shù)可以設(shè)計(jì)最高多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常靈活，分型結(jié)果準(zhǔn)確性高。特別適合于對(duì)全基因組研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，或者是有限數(shù)量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況。SNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術(shù)是30MassARRAY技術(shù)原理:先通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在

SNP

位點(diǎn)上，延伸

1個(gè)堿基，在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止。根據(jù)SNP位點(diǎn)的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)強(qiáng)激光激發(fā)，核酸分子解吸附為單電荷離子，電場(chǎng)中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過(guò)檢測(cè)核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測(cè)出SNP位點(diǎn)信息。?MassARRAY技術(shù)原理:先通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加31SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件32SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件33SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件34SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件35SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件36SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件37優(yōu)勢(shì)（1）質(zhì)譜儀檢測(cè)的是分子最本質(zhì)的特征之一——分子量，不涉及熒光標(biāo)記、凝膠電泳等，就能檢測(cè)一個(gè)堿基的差異，準(zhǔn)確性高，機(jī)器本身出錯(cuò)的概率非常低；（2）質(zhì)譜儀的靈敏度非常高，檢測(cè)窗口內(nèi)，任何pmol級(jí)別的物質(zhì)都能被檢測(cè)出來(lái)；（3）通量高：幾秒就能檢測(cè)完一個(gè)反應(yīng)孔；（4）操作簡(jiǎn)單，儀器要求簡(jiǎn)單，除質(zhì)譜儀外，都是常規(guī)PCR儀器；（5）靈活：每天可以完成幾個(gè)反應(yīng)至上萬(wàn)個(gè)反應(yīng)；（6）便宜：引物不帶熒光標(biāo)記，普通長(zhǎng)度（3條引物總長(zhǎng)80bp左右），此外在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)能完成4個(gè)或更多的反應(yīng)，即通常所說(shuō)的4重反應(yīng)；（7）兼容性強(qiáng)：質(zhì)譜儀還能在核酸的其它方向，以及蛋白質(zhì)組學(xué)、微生物鑒定等領(lǐng)域也能應(yīng)用。（8）質(zhì)譜技術(shù)是“一管式操作”，即反應(yīng)體系在生化學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終在一個(gè)試管內(nèi)反應(yīng)，沒(méi)有多次轉(zhuǎn)移，這樣就減少被污染的概率。優(yōu)勢(shì)（1）質(zhì)譜儀檢測(cè)的是分子最本質(zhì)的特征之一——分子量，不涉388.變性高效液相色譜(DHPLC)原理：目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增，部分加熱變性后，含有突變堿基的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈。因包含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對(duì)的同源配對(duì)區(qū)和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來(lái),從而達(dá)到分離的目的。SNPs的有無(wú)最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異,依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基。特點(diǎn)：使用高效液相色譜檢測(cè)SNPs具有檢測(cè)效率高，便于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)未知SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。但DHPLC檢測(cè)對(duì)所用試劑和環(huán)境要求較高,容易產(chǎn)生誤差,不能檢測(cè)出純合突變。8.變性高效液相色譜(DHPLC)原理：目標(biāo)核酸片段PCR39SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件40SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件41SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件42、SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用、SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用43SNP的概念單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于單個(gè)核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。它包括單堿基的轉(zhuǎn)換,顛換、插入及缺失等形式。SNP的概念單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleot44SNP的特點(diǎn)（1）密度高SNP在人類(lèi)基因組的平均密度估計(jì)為1\1000bp,在整個(gè)基因組的分布達(dá)3×106個(gè)。（2）富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平,因此,它們可能代表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素。（3）遺傳穩(wěn)定性與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比,SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化SNP標(biāo)記在人群中只有兩種等位型(allele)。這樣在檢測(cè)時(shí)只需一個(gè)“+\-”或“全\無(wú)”的方式,這使得基于SNP的檢測(cè)分析方法易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

SNP的特點(diǎn)45種族遺傳學(xué)Tang等研究了來(lái)自世界五個(gè)地區(qū)(中國(guó)、馬來(lái)、高加索、印度和非洲)人群的MDR1基因的單倍體和連鎖不平衡特征,發(fā)現(xiàn)具有e12/1236T2e21/

2677T2e26/3435T亞型的單倍型mh5在非洲人群以外的四種人群中高度表達(dá),而具有e12/1236C2e21/2677G2e26/3435C亞型的單倍型mh7在非洲人群中占了1/3以上,進(jìn)一步證明了種族間的表形差異。SNP的應(yīng)用

種族遺傳學(xué)SNP的應(yīng)用46疾病易感性研究原理：SNPs被認(rèn)為是一種穩(wěn)定遺傳的早期突變,與疾病有著穩(wěn)定的相關(guān)性。當(dāng)一個(gè)遺傳標(biāo)記的頻率在患者明顯超過(guò)非患者時(shí),即表明該標(biāo)記與疾病關(guān)聯(lián),通過(guò)比較分析兩者的單倍型和研究連鎖不平衡性,可將基因組中任何未知的致病基因定位。Horikawa等應(yīng)用SNPs作為遺傳標(biāo)記通過(guò)基于連鎖不平衡的相關(guān)分析,在墨西哥裔美國(guó)人群和北歐人群中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)DM易感基因,該基因第三個(gè)內(nèi)含子上的A/G多態(tài)性(SNP43)同2型糖尿病(2型DM)連鎖,該位點(diǎn)為純合子G的個(gè)體患2型DM的風(fēng)險(xiǎn)增加,這是目前為止所發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與2型DM相關(guān)的SNP,預(yù)示了SNP在DM相關(guān)基因研究中的重要作用。疾病易感性研究47藥物基因組學(xué)研究SNPs可以精細(xì)地反映個(gè)體的遺傳差異,SNPs位點(diǎn)與個(gè)體的藥物反應(yīng)進(jìn)行相關(guān)分析,從而確定基因在藥物作用中的功能和意義。這樣既可以根據(jù)患者的遺傳特性設(shè)計(jì)治療方案,實(shí)現(xiàn)“個(gè)性化治療”,提高藥效，降低藥物的毒副作用,又可以在臨床試驗(yàn)階段為特定的藥物選擇合適的受試者,提高效率,減少費(fèi)用。藥物基因組學(xué)研究48遺傳育種的應(yīng)用檢測(cè)水稻SNP，研究?jī)?yōu)良性狀與SNPs的關(guān)聯(lián)關(guān)系，指導(dǎo)育種。遺傳育種的應(yīng)用49SNP的檢測(cè)方法基于以下9種基本原理:以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ);1.1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法（RFLP）;1.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性法（SSCP）;1.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）;等位基因特異PCR（AS-PCR）;RT-PCR;等位基因特異性雜交;

引物延伸法--單堿基延伸法;

DNA直接測(cè)序法;飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè);變性高效液相色譜(DHPLC)法；SNP的檢測(cè)方法基于以下9種基本原理:501.1RFLP法原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長(zhǎng)度和數(shù)量則會(huì)出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點(diǎn)。1.1RFLP法原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，511.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)原理：?jiǎn)捂淒NA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)在電泳中會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于堿基的組成，單個(gè)堿基的改變也會(huì)影響其構(gòu)象，最終會(huì)導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測(cè)SNP。特點(diǎn)：由于該方法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測(cè)。這種方法的弊端在于不能確定突變類(lèi)型和具體位置。1.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)原理：?jiǎn)捂淒NA在中性條521.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理：是利用長(zhǎng)度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過(guò)梯度變性膠將DNA片段分開(kāi)的電泳技術(shù)。1.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理：是利用長(zhǎng)度相同的雙532.等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3′末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同),另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì),因此,AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú),從而確定基因型的SNP。2.等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)S543.RT-PCR實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(RT-PCR)一種通過(guò)檢測(cè)PCR過(guò)程中和PCR之后產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分等位基因類(lèi)型的SNP檢測(cè)技術(shù),同時(shí)基于熒光能量轉(zhuǎn)移原理(FRET)。每檢測(cè)一個(gè)SNP位點(diǎn)需要一條探針,其3‘端連有淬滅劑基團(tuán),5’端連有熒光劑基團(tuán),最終與SNP位點(diǎn)完全匹配時(shí)探針結(jié)構(gòu)被破壞,從而發(fā)出熒光而被檢測(cè)。3.RT-PCR實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(RT-PCR)一55SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件56定量分析高靈敏TaqMan?GeneExpressionMasterMix定性分析高特異性TaqMan?GenotypingMasterMixAB——NewMasterMix定量分析定性分析AB——NewMasterMix574.等位基因特異性雜交等位基因特異性雜(Allelespecifichybridization,ASH)根據(jù)核苷酸探針和互補(bǔ)的目的片段進(jìn)行雜交，完全匹配和有錯(cuò)配兩種情況下雜交復(fù)合體穩(wěn)定性的不同而將SNP位點(diǎn)檢測(cè)出來(lái)。等位基因特異核苷酸片段分析(ASO)，基因芯片和動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)等。4.等位基因特異性雜交等位基因特異性雜(Allelesp58SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件595.引物延伸法--單堿基延伸法5.引物延伸法--單堿基延伸法60單重SNaPshot數(shù)據(jù)單重SNaPshot數(shù)據(jù)61多重SNaPshot反應(yīng)原理多重SNaPshot反應(yīng)原理62SNaPshot操作流程SNaPshot操作流程63SNaPshot?Multiplex試劑盒SNaPshot?MultiplexReadyReactionMix一管做10個(gè)位點(diǎn)對(duì)照:30個(gè)反應(yīng)6條對(duì)照引物:20A,28G/A,36G,44T,52C/T,60C對(duì)照模板DNA:AmpliconfromCEPHDNA0.01~0.4pmol純化的PCR模板MatrixStandardDS-02[dR110,dR6G,dTAMRA?,dROX?,LIZ?]SNaPshot?Multiplex試劑盒SNaPshot?64質(zhì)粒SNaPshotPCR純化電泳樣本制備電泳PCR產(chǎn)物純化軟件分析質(zhì)粒SNaPshotPCR純化電泳樣本制備電泳PCR產(chǎn)物純65SNaPshotPCRSNaPshotPCR66SNaPshotPCR產(chǎn)物純化Sealplate&incubate乙醇沉淀法:11個(gè)步驟,>1小時(shí)AddreagentsCentrifugeEmptyplateAddreagentsSealplate&incubateAnalyzeRe-suspendDryCentrifugeEmptyplateSealplateSNaPshotPCR產(chǎn)物純化Sealplate&i67加樣震蕩30分鐘分析離心封口BigDye?XTerminator?PurificationKit加樣震蕩30分鐘分析離心封口BigDye?XTermi686.DNA測(cè)序法直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法。原理:通過(guò)對(duì)不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測(cè)序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達(dá)100%。特點(diǎn)：可以得到SNP的類(lèi)型及其準(zhǔn)確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù)。6.DNA測(cè)序法直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法。69SNP分子標(biāo)記的原理及應(yīng)用解讀課件707.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè)原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過(guò)與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后,在硅芯片上進(jìn)行引物的退火,延伸反應(yīng),突變部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測(cè)SNP。7.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè)原理71SNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具，通過(guò)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測(cè)?；贛assARRAY?分子量陣列平臺(tái)的iPLEXGOLD技術(shù)可以設(shè)計(jì)最高多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常靈活，分型結(jié)果準(zhǔn)確性高。特別適合于對(duì)全基因組研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，或者是有限數(shù)量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況。SNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術(shù)是72MassARRAY技術(shù)原理:先通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在

SNP

位點(diǎn)上，延伸

1個(gè)堿基，在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基