第二章微生物實驗室常用試劑、培養(yǎng)基

……………最新資料推薦………………最新資料推薦…………………202112121:54:02微生物學實驗室常用試劑與培養(yǎng)基一、診斷用紙片⑴桿菌肽紙片（0.04U/片）：抑菌圈>10mmDA⑵SMZ（1.25μg/片、μg/片）：出現抑菌圈即為敏感。質D群鏈球菌陽性，A群鏈球菌陰性。（5.0μ片）：16mm為敏感。質控菌株：表皮葡萄球菌陽性，腐生葡萄球菌陰性。⑷O129紙片、奧普托欣（Optochin）紙片：參見第五節(jié)《生化試驗培養(yǎng)基》。二、診斷用血清沙門菌屬診斷血清⑴A-FOO的有O2O4O7O9O10診斷血清。HHa，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、因子診斷血清。志賀菌屬診斷血清志賀菌屬4種多價血清：痢疾志賀菌Ⅰ、Ⅱ血清，福氏志賀菌多價血清及分型血清（1～6型），菌診斷血清，鮑氏志賀菌多價血清及分型血清。致病性大腸埃希菌診斷血清腸致病性大腸埃希菌（EPEC）診（ETEC）診斷血清，腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）診斷血清，腸出血性大腸埃希菌（EHEC）診斷血清O157：7。O1、O139

O139血清腦膜炎奈瑟菌多價血清及分群血清鏈球菌分類診斷血清肺炎鏈球菌診斷血清三、常用染色液革蘭染色液⑴結晶紫溶液A液：結晶紫20g，95%乙醇20ml；B液：草酸銨0.8g，蒸餾水80ml。24hAB濾后裝入試劑瓶內備用。⑵碘液:碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。毫升蒸餾水,使其逐漸溶解,然后研磨,繼續(xù)加入少量蒸餾水至碘、碘化鉀完全溶解。最后補足水量。也可用少量300ml。⑶脫色液：95%乙醇⑷復染液：沙黃2.5g，95%乙醇100ml為貯存液，取貯存液10ml，加蒸餾水90ml為應用液?？顾崛旧孩艍A性復紅染色液：①萋納石炭酸復紅溶液：堿性復紅乙醇飽和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。②脫色液：濃鹽酸3ml，95%乙醇97ml。③復染液(呂弗勒美藍液)：美藍乙醇飽和溶液30ml，100g/L氫氧化鉀溶液0.1ml，蒸餾水100ml。O-BBB0.1g100ml。②1g/LOO0.1g加蒸餾水95ml,再加入純石炭酸5ml,混勻。③3%鹽酸乙醇。④稀釋美藍液：呂弗勒美藍液100ml,加蒸餾水90ml,混勻。

100ml。乙液：碘2g，碘化鉀3g，蒸餾水300ml。先將碘化鉀加入少許蒸餾水 (約鞭毛染色液(改良Ryu法) 2ml),充分振搖,待完全溶解,再加入碘,A：5%10ml，10ml；BA10,B1異染顆粒染色液甲液：甲苯胺藍0.15g，孔雀綠2g/L，95%乙醇2.0ml，蒸餾水

使完全溶解后,加蒸餾水至300ml。莢膜染色液⑴印度墨汁或50g/L黑色素水溶液⑵5g/L苯胺藍水溶液。第二節(jié)基礎培養(yǎng)基一、液體基礎培養(yǎng)基1.蛋白胨水[用途]養(yǎng)和傳代。[配法]蛋白胨（或胰蛋白胨）10g5g，1L。

3.牛肉浸液培養(yǎng)基[用途]細菌培養(yǎng)最基礎的培養(yǎng)基，除用于一般細菌的培養(yǎng)外，又可以作營養(yǎng)瓊脂及其它培養(yǎng)基的基礎。[配法]新鮮除脂牛肉500g，10g，1L。將上述成分溶于水中，校正pH 先將牛肉清洗，除脂肪、肌腱，至7.2,分裝試管，每管2~3ml12115min[質量控制]大腸埃希菌生長良好，靛基質陽性；傷寒沙門菌生長良好，靛基質陰性。2.營養(yǎng)肉湯[用途]一般細菌的增菌培養(yǎng)，加入1%的瓊脂粉亦可作營養(yǎng)瓊脂。[配法]蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1L。將上述成分稱量混合溶解于水中，校正pH7.412115min，作無菌試驗后冷藏備用。[質量控制]金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、化膿性鏈球菌生長良好。[保存]置冰箱3周內用完。

并切塊絞碎。稱取500g置容器加入蒸餾水1L，攪勻后置冰箱過夜，次日煮30min，布或麻布進行粗過濾，再用脫脂棉過10g5gpH7.6~7.8，10min，充蒸餾水至1L，最后用濾紙過濾，呈121℃15min[用法]根據用途不同可以制成營養(yǎng)肉湯，以此為基礎制成其它培養(yǎng)基。如制作固體培養(yǎng)基，加入瓊脂15~20g/L即可。[質量控制]金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌等均生長良好。[保存]置4℃冰箱內可以使用較長時間。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量為3～5g/L。 [用途]二、固體基礎培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂[用途]一般細菌和菌株的純化及傳種。[配法]蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂粉（優(yōu)質）12g，蒸餾水1L。將上述成分(除瓊脂外)溶于水中，校正pH7.2～7.4后加入瓊脂，煮沸溶解，根據用途不同進行分裝，經121℃滅菌15min，傾注平板或制成斜面，冷藏備用。[質量控制]

主要用于嗜血桿菌的分離培養(yǎng)，亦可用于奈瑟菌的增殖培養(yǎng)。[配法]1L，5g，12g，100ml。將上述成分（除兔血外）加熱溶pH7.2，121℃15min滅菌，待冷至約85℃，以無菌方式加入兔血，搖勻后置85℃水浴中，維持10min，置室溫冷至約50℃，傾注平板或制成斜面?zhèn)溆谩＝瘘S色葡萄球菌菌落呈淺黃色； [質量控制]痢疾志賀菌菌落無色；銅綠假單胞菌 流感嗜血桿菌ATCC10211、肺炎菌落無色或淺綠色。[保存]置4℃冰箱保存，2周內用完。血瓊脂培養(yǎng)基[用途]一般病原菌的分離培養(yǎng)和溶血性鑒別及保存菌種。[配法]pH7.7.6100m。121℃15min50℃加入羊血，搖勻后立即傾注滅菌平皿內，待凝固后，經無菌實驗冷藏備用。[質量控制]化膿性鏈球菌ATCC19615生長良好，β-溶血；肺炎鏈球菌ATCC6303生長良好，α-溶血；表皮葡萄球菌ATCC12228生長良好,不溶血。[保存]置4℃冰箱，1周內用完。巧克力瓊脂培養(yǎng)基

鏈球菌ATCC6305生長良好，菌落典型。[保存]置4℃冰箱，1周內用完。胱氨酸胰化酪蛋白瓊脂[用途]常用于測定腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及營養(yǎng)要求較高細菌的糖發(fā)酵試驗。[配法]0.5g,20g,5g，?0.3g，0.0175g，1L。將上述成分（酚紅除外）混合溶pH7.2，分裝試管，115℃15min。[用法]用于測定糖發(fā)酵時，按需要加入各種糖溶液，將待檢標本直接種于培養(yǎng)基管內，置35℃孵箱，18~24h觀察結果。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色為陽性，不變色為陰性。第三節(jié) 保存和增菌培養(yǎng)基一、菌種保存培養(yǎng)基[配法]蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉3g2g4.5g，1L。將上述成分混合于水中，加熱溶pH7.4~7.6，121℃高壓滅菌15min，成為半固體培養(yǎng)基，備用。[質量控制]培養(yǎng)基呈淡黃色半固體狀。大腸埃希菌(ATCC25922)生長良好,動力陽性；福氏志賀菌(ATCC12022)25923

少應作兩次分離培養(yǎng)。注:⑴枸櫞酸鈉為抗凝劑，可使血液加入培養(yǎng)基中不凝固。⑵對氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。⑶硫酸鎂主要抑制血液中存在的四環(huán)素、金霉素、新霉素、多粘菌素及鏈霉素的抑菌作用。⑷本培養(yǎng)基近年來有許多改良配方，如加入0.3%～0.5%酵母浸膏以增加營養(yǎng)；加0.2%核酸刺激細菌生長；加0.1能被覆于細菌的表面，保護細菌免受抗體破壞；加入聚茴香腦磺酸鈉（SPS）能中和補體的抗藥作用從而提高檢出率。2.血液增菌培養(yǎng)基[用途]二、增菌培養(yǎng)基 血液和骨髓液病原菌的增菌培1.葡萄糖肉湯 養(yǎng)。[用途] [配法]用于血液增菌。 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏[配法] 3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸櫞蛋白胨(或示胨)10g，氯化鈉鈉3g，磷酸氫二鉀2g，5g/L對氨基5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖甲酸溶液5ml1mol/L硫酸鎂溶液3g，枸櫞酸鈉3g，5g/L對氨基苯甲酸20ml，4g/L酚紅溶液6ml，青霉素水溶液10ml，1mol/L硫酸鎂溶液50U，聚茴香腦磺酸鈉(SPS)0.3g20ml，青霉素酶1000U。 蒸餾水1L。將蛋白胨、氯化鈉混合于肉浸液 將上述成分（除酚紅指示劑、青中加熱溶解，再加入葡萄糖、枸櫞酸 霉素酶外）混合加熱溶解，校正pH鈉、對氨苯甲酸及硫酸鎂，繼續(xù)煮沸 7.4，再加酚紅，過濾分裝每瓶 30～5min，并補足失水，調整pH至7.8。 50ml，經121℃滅菌15min和過濾分裝，每瓶50ml，高壓滅菌 無菌試驗備用。臨用時每瓶加入115℃20min后，每瓶加入青霉素酶50 2.5U青霉素酶。U，經無菌試驗合格后，冷卻備用。 [質量控制][用法] 傷寒沙門菌ATCC50096、白色念將采取的血液標本，以無菌手續(xù) 珠菌ATCC10231、化膿性鏈球菌注入培養(yǎng)瓶中（1ml19615、肺炎鏈球菌ATCC630510ml），35℃1次色葡萄菌ATCC25923、銅綠假單胞菌取出觀察結果。如有細菌生長，可出ATCC27853現數種不同的表現，應隨時作分離培3.?硒酸鹽增菌培養(yǎng)基養(yǎng)，可選用血瓊脂、伊紅美藍瓊脂及 [用途]巧克力瓊脂平板等。無細菌生長表現 沙門菌增菌培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶，需連續(xù)觀察7d，仍無細菌 [配法]生長方可棄去。在觀察的過程中，至 蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氫二鈉4.5g，磷酸二氫鈉5.5g，?硒酸氫鈉4g，蒸餾水1L。先將?硒酸鹽加到200ml蒸餾水中，充分搖勻溶解。其它成分稱量混合，加入蒸餾水800ml，加熱溶解，待冷卻后兩液混合，充分搖勻，校正pH7.0~7.1(通過調整磷酸鹽緩沖對的比例來校正pH值)。最后分裝于15×150mm的試管內，每管10ml。置水浴隔水煮沸10~15min，立即冷卻，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。[用法]取新鮮標本1g或棉拭子采樣直種于該培養(yǎng)管內。搖動后置35℃培養(yǎng)過夜。如發(fā)現均勻混濁，管底有紅色沉淀物，表示細菌生長。然后取培養(yǎng)物分離在選擇性培養(yǎng)基上，如 SS脂、麥康凱瓊脂平板等，進行培養(yǎng)。[質量控制]培養(yǎng)基應呈淡黃色或無色，透明×10-5，鼠傷寒及副傷寒沙門菌1×10-7。[保存]4℃保存，1注：⑴?硒酸鹽，包括?硒酸鈉、?硒酸氫鈉均可使用，但以?硒酸氫鈉效果為好。⑵磷酸鹽緩沖對中，兩者的用量比例與?硒酸鹽及蛋白胨的品種有關。制備前應進行調試，其總量為10g/L。⑶在制備過程中，?硒酸鹽不能直接加熱。隔水煮沸時間亦不能超過規(guī)定時間，否則?硒酸鹽會變質，生成紅色沉淀物。⑷培養(yǎng)基應呈淡黃色，有紅色沉淀物出現時不可再用。SS[用途][配法]2g，蛋白胨8g，牛肉膏3.5g2g，2g，鐵10g，硫代硫酸鈉10g，?硫酸鈉0.7g5.5g，4g，酸二氫鉀0.1g

1.5g，煌綠0.005g，蒸餾水1L。至7.1，分裝試管（15×150mm），每5~7ml，5min[用法]取糞便標本1g直接種于增菌液內，35℃16~18h離培養(yǎng)基即可。[質量控制]培養(yǎng)基應呈淡黃色或略呈淡綠色。傷寒沙門菌ATCC50096、福氏志賀菌ATCC12022生長良好；大腸埃ATCC25922生長抑制。注：⑴切勿高壓，隔水煮沸時間不超過5min。⑵煌綠用量應根據不同產品批號酌情增減。堿性蛋白胨水[用途][配法]蛋白胨20g，氯化鈉5g，蒸餾水100ml。將上述成分溶解于水中,校正8.6，8~10ml15min[用法]將待檢標本接種到堿性胨水中，356~8h，濁生長，表面有菌膜出現。取表面菌液一白金環(huán)移種到堿性瓊脂、慶大瓊TCBS次增菌。[質量控制]有條件的實驗室可用標準菌株，01養(yǎng)后生長良好者方可使用?；魜y弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生長良好（6h）；ATCC25922長（6h）。[保存]置4℃冰箱，2周內用完。注：若在每升堿性胨水中加入1%?碲酸鉀溶液0.5~1.0ml，則成為?碲酸鉀堿性胨水，其增菌效果更為理想。第四節(jié)分離培養(yǎng)基一、革蘭陽性桿菌分離培養(yǎng)基羅-琴改良培養(yǎng)基[用途][配法]2.4g0.24gg3.6g12ml，600ml，30g，1L，2%20ml。先將磷酸鹽、硫酸鎂、枸櫞酸鎂、天門冬素及甘油，加熱溶解于600ml60℃及孔雀綠溶液20ml，充分混勻后，用無菌操作分裝于滅菌試管，每支5~6ml，塞緊橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器內制成斜面，85℃1h2115℃20min)，待凝固后經無菌試驗，4℃冷藏備用。[用法]取晨咳痰或其它體液標本，經消0.1ml（2）晃，置35℃5%~10%二氧化碳溫箱內培1~41現生長的菌落，一般不可能是結核分枝桿菌；在2周后生長的菌落，奶油狀，略呈黃色，粗糙突起，不透明，即取菌進行涂片染色鏡檢及鑒定。[質量控制]用結核分枝桿菌菌株作陽性培養(yǎng)試驗。[保存]4℃2~4注：⑴本培養(yǎng)基由Lowenstein-Jenden設計的基礎上改良。

本培養(yǎng)基pH約為6.0無須校正。90℃。血清斜面培養(yǎng)基(呂氏血清斜面)[用途][配法]1(pH7.6)100ml，無300ml。將上述成分混合后，分裝于試管內，每管約4~5ml。斜插在血清凝固內（或蒸籠）加熱80~85℃30min，使血清凝固成斜面，冷卻后放 4℃冰箱內。取出后采用間歇滅菌法，85℃滅菌30min，連續(xù)3天，經無菌試驗證無雜菌生長即可應用。[用法]將喉拭子直接接種于上述斜面上，置35℃16~24h上述培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，表面光滑、完整，9g/L氯化鈉溶液中易乳化，用阿爾培脫染色，兩極異染顆粒明顯。注：⑴所用血清不能含有防腐劑。⑵該培養(yǎng)基不能高熱滅菌，以防破壞其中營養(yǎng)成分。⑶配制時所有器皿、棉塞等均應高壓滅菌。?碲酸鉀血瓊脂[用途][配法]蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉浸膏3g，葡萄糖2g，胱氨酸0.05g，1%?碲酸鉀45ml，脫纖維羊血100ml，瓊脂2g，蒸餾水900ml。先將蛋白胨、氯化鈉、牛肉浸膏、葡萄糖和胱氨酸加水加熱溶解，調pH至7.6，加入瓊脂，高壓滅菌115℃15min備用。待冷至50℃左右，用無菌操作加入已滅菌的?碲酸鉀溶液及羊血，混勻傾注平板。[用法]將標本直接接種于?碲酸鉀平板35℃24~48h察結果。白喉桿菌能使?碲酸鉀還原成金屬碲而形成黑色和灰黑色的菌落。二、革蘭陰性桿菌分離培養(yǎng)基(一)弧菌分離培養(yǎng)基1.堿性瓊脂[用途][配法]蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，脂20g，蒸餾水1L。將前4種成分混合于水中，加熱pH8.4，15min，傾注平板。[用法]凡急性患有水樣便標本做增菌培養(yǎng)的同時，應直接取標本接種到堿性瓊脂平板或?碲酸鉀瓊脂平板上。置35℃培養(yǎng)12~16h，觀察結果。霍亂弧菌生長較快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑濕潤。在?碲酸鉀瓊脂上菌落呈灰黑色。[質量控制]各實驗室凡自配培養(yǎng)基或商品培EL-Tor弧菌生長良好；大腸埃希菌ATCC25922 生長抑制[保存]置4℃冰箱，1周內用完。堿性膽鹽瓊脂[用途][配法]

蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化納5g~10g，瓊脂20g，膽鹽（牛、豬）2.5g，蒸餾水1L。將上述成分稱量混合于水中加熱pH8.4，121℃15min，傾注平板。[用法]取糞便標本或增菌培養(yǎng)物1接種3516~18h?；魜y弧菌迅速生長，其它細16~18h菌的菌落，直徑可達2mm左右，呈扁平，青灰色，半透明，光滑濕潤，易挑起。其它細菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。[質量控制]同堿性瓊脂。[保存]置冰箱，1周內用完。慶大霉素瓊脂[用途][配法]蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化鈉5g，枸櫞酸鈉10g，無水?硫酸鈉3g，蔗糖(或白糖)10g，15~20g，慶大霉素、多粘菌素B2ml，1L。pH8.4，121℃15min，50℃后，每100ml內加“雙抗液”0.2ml，另加5g/L?碲酸鉀溶液0.1ml，再傾注平板。最后每毫升培養(yǎng)基內含有慶大霉素0.5U，多粘菌素B6U。[用法]將糞便標本或增菌培養(yǎng)物劃線接35℃16~18h由于該培養(yǎng)基抑制性強，其它非弧菌科細菌被抑制，而霍亂弧菌生長16h菌落可達2mm色，半透明，扁平，光滑濕潤。若培養(yǎng)時間長，菌落略黃色、隆起，中心厚而不透明。[質量控制]霍亂弧菌(小川、稻葉)生長良好，培養(yǎng)18~24h菌落直徑2.5~3.0mm；大腸埃希菌和變形桿菌生長抑制。[保存]4℃冰箱內，1注：⑴該培養(yǎng)基國內有商品出售，多數產品已加入慶大霉素，使用時，應詳閱說明書。⑵“雙抗液”配制：98ml滅菌蒸餾水中加慶大霉素(25000U/ml)1ml,多粘菌B或抗敵E(300000U/ml)1ml。4℃冰箱保存，1月用完。四號瓊脂[用途][配法]蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉浸膏3g，?硫酸鈉(無水)3g，枸櫞酸鈉10g5g20g，利凡諾（雷佛奴爾）3g，瓊脂粉12g，慶大霉素?碲酸鉀混合液1ml，蒸餾水1L。將前8種成分放入玻璃或搪瓷容器內(嚴禁用鋁制容器等金屬容器)，加入蒸餾水，加熱溶解混合后，調整pH8.0,1.2至瓊脂溶化后，冷至60℃左右，按每100ml液(1ml40000U79ml0.8g合即成，每毫升含500U慶大霉素和10g/L)0.1ml板。[用法]取待檢標本劃線接種平板，置35℃培養(yǎng)過夜。8h后即可初步觀察結果。24h培養(yǎng)后，霍亂弧菌呈中心黑色、較大而扁平的菌落。[質量控制]配成的培養(yǎng)基呈亮黃色透明；EL-Tor弧菌稻葉型生長良好；EL-Tor弧

菌小川型生長良好；大腸埃希菌ATCC25922注：⑴慶大和?碲酸鉀混合液應新鮮配制并置冰箱保存。⑵雷佛奴爾應避光保存，而且每批均應預試后方可使用。成品培養(yǎng)基應避光保存。(二)腸桿菌分離培養(yǎng)基中國藍瓊脂[用途][配法](pH7.4)1L，10g/L中國藍溶液(滅菌)10ml10g10g/L薔薇紅酸乙醇溶液10ml。取乳糖10g置于已滅菌的肉膏湯瓊脂瓶內，加熱溶解瓊脂并混勻。待冷卻至50℃左右，加入中國藍、薔薇紅酸乙醇溶液混勻，立即傾注平板，凝固后備用。[用法]將標本接種平板，置351824h。分解乳糖產酸的細菌，其菌落呈藍色；不分解乳糖的細菌，菌落為淡紅色的透明菌落。[質量控制]ATCC25922ATCC13313傷寒沙門菌ATCC13311菌落呈淡紅色。[保存]4℃冰箱保存，1注：中國藍溶液需煮沸或 115℃滅15min后應用。薔薇紅酸乙醇溶液無需滅菌，但加熱時應避開火焰。薔薇紅酸能抑制革蘭陽性細菌生種量不宜太多。此培養(yǎng)基pH7.4，過堿呈鮮紅色，過酸則呈藍色，均不適用。木糖、賴氨酸、去氧膽酸鹽(XLD)培養(yǎng)基[用途]為腸道菌選擇性培養(yǎng)基。[配法]3g,L5g,氯化鈉5g,D3.75g,7.5g,2.5g,6.8g,枸櫞酸鐵銨0.8g,瓊脂13.5g,1%酚紅溶8ml,1L。pH7.2,液混勻。121℃高壓滅菌15min，傾注平板備用。[用法]將標本劃線接種平板，置35℃培養(yǎng)18～24h。大腸埃希菌、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬細菌可形成黃色、不透明菌落；大多數沙門菌屬細菌因不利用糖類，為半透明紅色或無色菌落。[質量控制]大腸埃希菌呈黃色菌落；宋內志賀菌呈無色菌落；傷寒沙門菌 呈紅色菌落有黑心；金黃色葡萄球菌 制生長。[保存]貯存于4℃有效期5天。SS[用途]沙門菌屬和志賀菌屬(Salmonella-Shigella)的分離培養(yǎng)。[配法]胨5g，5g，瓊脂15~20g，膽鹽(No.3)3.5g，枸櫞8.5g，8.5g，鐵1g1%中性紅溶液2.5ml，0.1%0.33ml，1L。將上述成分(除中性紅、煌綠外混合于水中，加熱煮沸溶解，校正至7.0~7.1，然后加入中性紅和煌綠液，充分混勻冷卻至 50℃時傾注平板。[用法]將標本接種平板，置35℃培養(yǎng)18~24h。沙門菌屬菌落呈無色半透明，產生硫化氫者菌落中心呈黑色；

志賀菌屬的菌落呈無色半透明；大腸菌屬呈紅色渾濁；宋內志賀菌能延緩發(fā)酵乳糖，培養(yǎng)24h后可以出現紅色菌落。腸道致病菌的菌落直徑均可達1.5mm以上。[質量控制]大腸埃希菌菌落呈紅色；痢疾志賀Ⅰ型、福氏志賀菌和傷寒沙門菌生長良好，菌落無色；腸炎或豬霍亂沙門菌菌落呈黑色；糞腸球菌、金黃色葡萄球菌不生長。[保存]避光，3天內用完。注：煌綠要新配，中性紅要優(yōu)質。麥康凱瓊脂[用途](Maconkeyagar)腸道致病菌的分離培養(yǎng)和非發(fā)酵細菌鑒別。[配法]蛋白胨20g5g(豬、牛、羊)5g10g15~20g，1%中性紅溶液5ml，蒸餾水1L。pH加入中性紅溶液，分裝滅菌11520min，50℃左右時傾注平板。[用法]取標本或增菌培養(yǎng)物接種平板，3518~24h道細菌呈無色菌落，直徑約2.0mm右，光滑半透明。[質量控制]大腸埃希菌菌落呈桃紅色；痢疾志賀菌菌落呈無色；傷寒沙門菌菌落無色；金黃色葡萄球菌不生長。[保存]置4℃冰箱(避光)，1周內用完。注非發(fā)酵細菌在該平板上是否生長，是臨床鑒定某些非發(fā)酵細菌的指標之一。伊紅美藍瓊脂[用途]用于腸道致病菌及大腸菌群分離培養(yǎng)。[配法]10g，10g，鉀2g20g/L伊紅Y溶液20ml6.5g/L10ml，17g，1L。將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂稱量混合于水中，并加熱煮沸溶解，校正7.1，121℃15min臨用時加熱溶化瓊脂加入乳糖，冷至50~55℃時加入伊紅和美藍溶液，搖勻傾注平板。[用法]取糞便標本或增菌培養(yǎng)物接種平35℃18~24h的不同，挑取無色菌落或挑選紫紅色及有金屬光澤的菌落轉種克氏雙糖或三糖鐵瓊脂進行鑒定。[質量控制]大腸埃希菌菌落呈紫紅色，有時2.3mm；傷寒沙門1.8mm色葡萄球菌不生長。[保存]置4℃冰箱，1周內用完?？耸想p糖鐵瓊脂[用途]克氏雙糖鐵瓊脂(Kligeragar)用于腸桿菌科細菌的初步鑒定。[配法]20g,3g,10g,1g,50g,0.5g,0.5g,0.2%5ml,12ml1L。將前8種成分稱量混合于水中，pH7.5，脂和酚紅溶液，煮沸溶解分裝試管，4ml，115℃20min，制成高層斜面，待凝固后經無菌試驗備用。[用法]取待檢菌純培養(yǎng)物，用接種針作

底層穿刺和斜面劃線接種，置35℃培養(yǎng)18～24h，觀察結果。斜面變黃，底層變黃，產氣者或不產氣者多屬大腸埃希菌群及發(fā)酵乳糖的菌株。斜面變紅，底層變黃，為不發(fā)酵乳糖菌株。產硫化氫菌株可使底層或全管產生黑色反應。[質量控制]奇異變形桿菌K/A硫化氫陽性；大腸埃希菌A/A；志賀痢疾桿菌K/A；傷寒沙門菌K/A硫化氫陽性；銅綠假單胞菌K/K。[保存]置4℃冰箱，2周內用完。注:該培養(yǎng)基pH值尤為重要，pH7.5時使用效果最佳。三糖鐵瓊脂[用途]用于腸桿菌科細菌初步生化鑒定。[配法]蛋白胨15g胨5g，牛肉膏3g，3g，10g，葡萄糖1g5g硫酸?鐵2g/L，硫代硫酸鈉0.3g，0.2%酚紅溶5ml，12g，1L。10pH7.4，及酚紅溶液，加熱煮沸溶解。分裝試4ml，115℃立即置高層斜面，待凝固后，經無菌試驗備用。[用法]取待檢菌純培養(yǎng)物，用接種針作底層穿刺和斜面劃線接種，置35℃培養(yǎng)18~24h觀察結果。發(fā)酵乳糖或蔗糖的菌可使斜面及底層均變黃色。不發(fā)酵乳糖和蔗糖的細菌僅發(fā)酵葡萄糖時使底層變黃，斜面變紅。產生硫化氫的菌株可使底層或整個培養(yǎng)基呈黑色。分解乳糖或蔗糖后產氣時有些菌株還能使培養(yǎng)基斷裂。[質量控制]傷寒沙門菌K/A，硫化氫陽性；副傷寒沙門菌K/A，硫化氫陽性；痢疾K/A；A/A；桿菌A/A，硫化氫陽性；銅綠假單胞菌K/K。[保存]置4℃冰箱，2周內用完。該培養(yǎng)基pH7.5時使用效果最佳。山梨醇麥康凱瓊脂[用途]用于致病性、侵襲性和產毒性大腸埃希菌分離培養(yǎng)。[配法]蛋白胨5g胨3g5g，膽鹽（豬、牛、羊）5g，山梨醇10g，瓊脂粉12g，0.1g/L結晶紫溶液1ml，5g/L5ml，將前4種成分混合于水中，加熱溶解，校正pH至7.2，再加入瓊脂粉加熱煮沸溶解。分裝三角燒瓶100ml。經121℃15min滅菌備用。臨用時，加熱溶解，再加山梨醇、結晶紫及中性紅溶液，搖勻傾注平板。[用法]將標本或增菌液接種平板，置35℃培養(yǎng)18～24h。與麥康凱瓊脂不同之處是挑取致病性大腸埃希菌菌落時，以無色菌落為主，同時兼取紅色菌落，如EPEC遲緩分解山梨醇，菌落呈紅色。EHECO157﹕H7菌落無色。[質量控制]參照麥康凱瓊脂。[保存]置4℃冰箱，1周內用完。(三)非發(fā)酵細菌用培養(yǎng)基1.金氏培養(yǎng)基(甲)[用途]金氏培養(yǎng)基(KingsMedium)用于檢測假單胞菌產生的青膿素。[配法]蛋白胨20g，無水氯化鎂1.4g，無水硫酸鉀10g15g10ml1L。將上述成分加熱、溶解，調pH

至7.2118~12115min，制成斜面和高層備用。[用法]取待檢菌劃種于上述斜面上，35℃培養(yǎng)過夜。觀察斜面上產色素情況。2.氧化-發(fā)酵試驗培養(yǎng)基[用途][配法]Hugh-Leifson培養(yǎng)基(革蘭陰性桿菌用)：蛋白胨2g10g，磷酸氫二鉀0.3g，氯化鈉5g，溴麝香草酚藍（BTB）0.03g2.5g，1L。O/F(葡萄球菌和微球菌鑒別用)：胰蛋白胨10g，酵母浸10g，20g，1L，10g。至7.1，分裝于試管中，每支試管5ml，121℃15min，高層，備用。[用法]從斜面上挑取少許培養(yǎng)物，同時穿刺接種兩支培養(yǎng)基，其中一支接種后，滴加液體石蠟于培養(yǎng)基表面，高1cm35℃24~48h培養(yǎng)基變黃表示細菌分解葡萄糖而產酸，顏色不變?yōu)椴环纸馄咸烟恰質量控制]金黃色葡萄球菌ATCC25923ATCC25922ATCC27853菌、糞產堿桿菌不利用。注：有些細菌不能在上述培養(yǎng)基上生長，需在該培養(yǎng)基中加入2%血清或酵母浸膏，重做試驗。指示劑不能用乙醇配制，因有些細結果判斷。（四）其它革蘭陰性桿菌用培養(yǎng)基軍團菌培養(yǎng)基緩沖活性炭酵母瓊脂培養(yǎng)基（BCYE）[用途][配法]10g，活性（NoritSG）2g，L-0.4g，可溶性0.25g，17g，N-2-（ACES）10g,

10mlB2500U5mg70ml，蒸餾水930ml。除血和抗生素外，其余成分混合pH121℃15min50℃時加入7ml0.5ml，無菌平板。[用法]將標本接種平板，置25℃或43℃蒸餾水80ml。 微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48h，菌落直徑達上述成分除半胱氨酸及焦磷酸鐵15min滅菌，放水浴中冷卻到50℃。另外分別配新鮮L-半胱氨酸溶液（10ml0.4g）溶液（10ml含0.25g），分別過濾除菌，再加入已滅菌瓊脂中，加入1mol/L氫氧化鉀溶液4～5ml使培養(yǎng)

1~2mm，為不溶血的菌落。[質量控制]ATCC25922和糞腸球ATCC33186不生長；空腸彎曲菌胎ATCC29424生長良好。注：62mg(2100mlTMP100mg100℃5ml，基的最終pH為6.9～7.0，可用 再加萬古霉素100mg和多粘菌素B1mol/L鹽酸溶液校正，傾注平板，冷 0.38mg，搖勻后即可。卻后置4℃冰箱備用，亦可制成斜面，用于保存菌種。該培養(yǎng)基為黑色。[用法]

彎曲菌屬系微需氧菌，培養(yǎng)時可提供5%氧氣及10%二氧化碳。高濃度氧不利于細菌生長，尤其是幽門螺桿菌。因此標本液體標本可直接接種培養(yǎng)基， 采集后，應盡快接種培養(yǎng)，或置運送培養(yǎng)基肺、肝、脾等固體標本須制成100g/L

中運送。彎曲菌運送可用布氏菌湯培養(yǎng)基。懸液后再接種培養(yǎng)基，接種后的培養(yǎng) ⑵Campy-BAP培養(yǎng)基基置35℃需氧環(huán)境培養(yǎng)，培養(yǎng)箱需保持一定的濕度。每天用解剖鏡檢查平100照明。在BCYE平板上，培養(yǎng)4～天，菌落直徑約1～2mm，并出現亮藍和切削玻璃樣的構造；繼續(xù)培養(yǎng)后菌落增大呈黃綠色，較光滑。[保存]在室溫、暗室中可保存1周彎曲菌選擇性培養(yǎng)基

10g10g，葡萄糖10g3g5g，重?900ml100ml10mg25005mgB2mg將上述成分（除羊血和抗菌補充

養(yǎng)基 劑外），加入900ml蒸餾水，加熱溶用途] 解，調pH至7.2后分裝，121℃滅菌用于空彎及幽門螺桿菌分離培 15min，加入羊血和抗菌藥物添加劑養(yǎng)。 充分混勻后傾注于無菌平皿內。配法] 用法]蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母膏 取標本接種于平板，置25℃或5g，氯化鈉5g，瓊脂粉12g，萬古霉 43℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48h，菌落直1~2mm大腸埃希菌ATCC25922不生長；

糞腸球菌ATCC33186不生長；空腸彎曲菌胎兒?種ATCC29424生長良好。第五節(jié)生化試驗培養(yǎng)基一、糖發(fā)酵試驗培養(yǎng)基1.糖醇發(fā)酵試驗培養(yǎng)基[用途]檢查細菌對不同糖(醇)類的發(fā)酵能力，達到鑒定細菌的目的。[配法]蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，安德烈(Andrade10ml，1L，各種糖(醇)類5~10g。將上述成分混合后，加熱溶解。矯正pH至7.2。根據需要，分別再相應的糖和醇。分裝于 13mm×100mm的試管，每管約3ml，115℃滅15min。如需觀察產氣，可在試管內加小倒管1只。將分離的純菌接種到糖（醇）發(fā)酵管中，置35℃培養(yǎng)18～24h。接種菌若能分解培養(yǎng)基中的糖（醇）類而生成酸，使指示劑呈酸性反應，若產生氣體，則可使液體培養(yǎng)基中的倒管(Durham管)內出現氣泡；若接種菌不分解糖（醇）則無反應。血清菊糖試驗培養(yǎng)基[用途]用于肺炎鏈球菌與其它鏈球菌鑒別。[配法]血清(兔血清或牛血清)25ml1g/L2ml，1g，75ml。先取血清25ml、蒸餾水75ml混15min，pH7.4，1.0g、1g/L搖勻。分裝于13mm×100mm的試管，2ml320min。[用法]將被檢菌接種培養(yǎng)基，置35℃培

養(yǎng)18~24h。分解菊糖的菌株使培養(yǎng)基變黃；不分解菊糖的菌株，培養(yǎng)基不變色。[質量控制]肺炎鏈球菌ATCC10015陽性；化膿性鏈球菌ATCC19615陰性。膽汁七葉苷試驗培養(yǎng)基[配法]5g，3g，40g，七葉苷1g，枸櫞酸鐵0.5g，瓊15g，1L。將上述成分混合加熱溶解，調至7.211515min。將待測菌種接種到七葉苷培養(yǎng)基的斜面上，置35℃孵育18～24h，觀察結果。培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃厣邽殛栃裕徊蛔兩邽殛幮?。[質量控制]糞腸球菌ATCC29212陽性；化膿性鏈球菌ATCC19615陰性。[保存]置4℃冰箱，2周內用完。二、酶類測定培養(yǎng)基和試劑氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基[用途]檢查細菌使氨基酸脫羧基形成胺使培養(yǎng)基變堿的能力。常用的氨基酸有賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸。[配法]5g,5g,0.1g,甲酚紅0.005g,吡多醛(VB)0.005g,0.5g,1L。6加熱慢慢溶解，按10g/L濃度加pH6.0，2ml，管(不加氨基酸)，高壓滅菌12115min,4℃冷藏備用。[用法]將試驗菌接種培養(yǎng)基，同時接種熱溶解，校正pH至7.2~7.4，分裝三對照管1支。并用滅菌的液體石蠟覆角燒瓶，經115℃滅菌15min，傾注滅蓋，置35℃培養(yǎng)18~24h。陽性菌初期菌平皿，4℃冷藏備用。由于細菌發(fā)酵葡萄糖產酸呈黃色，若 [用法]繼續(xù)孵育，氨基酸經脫羧產生胺類使 將待檢菌作點狀穿種在平板上，培養(yǎng)基變堿，指示劑改變顏色，呈紫 置35℃培養(yǎng)24h。待細菌生長成集落色或紫紅色。陰性呈黃色或不變色。 菌苔后，在其菌苔上及周圍滴加[質量控制] 0.1mol/L鹽酸溶液數毫升，待片賴氨酸脫羧酶:遲緩愛德華菌陽 后，如待檢菌DNA酶陽性，可在菌苔性，弗勞地枸櫞酸菌陰性；鳥氨酸脫 的周圍出現明顯的透明圈；而陰性羧酶:產氣腸桿菌陽性，弗勞地枸櫞酸 則無透明圈出現。菌陰性;精氨酸脫羧酶:鼠傷寒沙門菌 [質量控制]陽性，普通變形桿菌陰性。 金黃色葡萄球菌ATCC25923和粘耐熱DNA[用途]用于檢測細菌所產生的耐熱脫氧核糖核酸酶。[配法]

質沙雷菌ATCC274陽性;表皮葡萄球菌ATCC14990和大腸埃希菌25922[保存]置4℃冰箱1周內用完。4.氧化酶試驗胰蛋白胨1.5g,植物蛋白胨0.5g, [用途]氯化鈉0.5g,DNA2g/L,瓊脂1.5g,蒸 區(qū)別假單胞菌與氧化酶陰性的餾水100ml,2g/L甲苯胺藍溶液 桿菌科細菌。0.25ml。 [配法]將前6種成分徐徐加熱溶解后， 鹽酸二甲基對苯二胺（或四甲調pH至7.4，加入甲苯胺藍溶液，分 對苯二胺）0.1g加蒸餾水10ml。裝試管，121℃滅菌15min后備用。 [用法][用法] 取白色潔凈濾紙一角，沾取試上述瓊脂傾注于載玻片上，凝固 菌落少許，加試劑一滴。陽性者立后，打孔，孔徑2cm，孔內加入經 顯粉紅色，并于5～10s內呈現深紫100℃15min隔水加熱處理后的肉湯培 反應。若用四甲基對苯二胺則陽性為養(yǎng)物。將載玻片孵育于35℃濕盒內4h, 藍色。取出觀察結果。陽性反應在孔周圍出 [質量控制]現不小于4mm直徑粉紅色圈，陰性反 銅綠假單胞菌ATCC27853陽性應培養(yǎng)基的顏色無改變。 大腸埃希菌ATCC25922陰性。[質量控制] [保存]金黃色葡萄球ATCC25923陽性； 置棕色瓶內可用一周，4℃冰箱表皮葡萄球菌ATCC12990陰性。 存，或分裝于棕色瓶內密封。DNA酶試驗培養(yǎng)基 5.尿素酶試驗培養(yǎng)基[用途] [用途]供細菌DNA酶測定用。 用于細菌尿素酶測定。[配法] [配法]DNA2g，胰酪胨15g，大豆胨 蛋白胨1g,葡萄糖1g,氯化鈉5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水 磷酸二氫鉀2g,4g/L酚紅溶液3ml,。 脂18~20g,200/L尿素溶液100ml,蒸餾將5種成分混合于蒸餾水中，加 水1L。將前5種成分混合于蒸餾水中，pH7.0，100ml，滅菌15min解，冷卻至55℃左右，加入無菌的尿素溶液10ml，搖勻立即無菌分裝于滅2ml，菌試驗后備用。[用法]取培養(yǎng)物接種斜面，3524h。尿素酶陽性者斜面變紅色,陰性者顏色無變化。[質量控制]普通變形桿菌ATCC13315(8h)個培養(yǎng)基變紅、肺炎克雷伯菌27236僅斜面變紅(24h)；大腸埃希菌ATCC25922為陰性(24h)。[保存]置4℃冰箱，2周內用完。磷酸酶試驗培養(yǎng)基[用途]測定細菌產生磷酸酶的能力。用于區(qū)別葡萄球菌有無致病性，致病性葡萄球菌呈陽性。還有助于克雷伯菌屬與腸桿菌屬的鑒定。[配法]含磷酸酚酞的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。將上述瓊脂加熱溶化，待冷卻至45℃時，加入濾過除菌的10g/L磷酸酚酞溶液1ml，搖勻后傾注平板。[用法]3518~24h。在平皿蓋上滴加濃氨水滴，熏蒸片刻。如有酚酞釋出，菌落即變?yōu)榉奂t色為陽性；不變色為陰性。注：⑴亦可用液體法進行試驗：經培養(yǎng)后在培養(yǎng)基內滴加氫氧化鈉溶液，觀察結果，顯紅色為陽性。⑵以上為酸性磷酸酶的試驗方法。如果作堿性磷酸酶試驗，可將磷酸對硝基酚加入pH10.5、0.04mol/L的甘氨酸氫氧化鈉緩沖液內。觀察結果時不必另行加堿。⑶酚酞指示劑產生的顏色隨其pH而

變化，試劑的量要準確，太少或太多的堿均可引起假陽性或假陰性結果。馬尿酸鹽試驗培養(yǎng)基[用途]測定細菌水解馬尿酸鈉能力。該培養(yǎng)基常用方法有2種。⑴三氯化鐵法[配法]馬尿酸鈉1g，肉湯100ml。三氯化鐵試劑：三氯化鐵12g溶于2%鹽酸100ml中。將馬尿酸鈉和肉湯（pH7.8）加熱溶解后分裝于試管中，每管4ml，121℃滅菌15min。冷卻后用玻璃蠟筆記錄培養(yǎng)基液面，置冰箱中備用。[用法]取純菌接種培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)基液面。如液面下降時以蒸餾水補充之。離心沉淀，取上清液0.8ml加入三氯化鐵試劑0.2ml，立即混勻。經10～30min觀察結果，出現穩(wěn)定沉淀物為陽性。反之為陰性。2.茚三酮法：甘氨酸在茚三酮的作用下，經氧化脫氨基反應，生成氨、二氧化碳和相應的醛。而茚三酮則生成還原型茚三酮。反應過程中形成的氨和還原型茚三酮，與殘留的茚三酮起反應，形成紫色化合物。觸酶試驗培養(yǎng)基[用途]用于鏈球菌及革蘭陽性球菌初步分群。[用法]⑴玻片法：取18~24h培養(yǎng)物，置于清潔玻片上，加13%溶液，如產生大量氣泡為陽性。⑵試管法：取瓊脂斜面（不含血液的）18~24h培養(yǎng)物，接種于試管內，加入3%過氧化氫溶液1ml生大量氣泡為陽性。[質量控制]金黃色葡萄球菌ATCC25923陽性；無乳鏈球菌ATCC13813陰性。(ONPG)養(yǎng)基[用途]用于乳糖遲緩發(fā)酵菌和不發(fā)酵菌的鑒別。[配法]0.01mol/LpH7.0100m1；3g，1.5g300m1，pH7.0。將試劑甲、乙分別置121℃滅菌15min，冷至40~50℃左右，試劑乙加入0NPG0.6g，置56℃水浴中加熱溶解，無菌過濾，將過濾液與試劑甲液2m1，后備用。[用法]將標本接種培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)4~18h。培養(yǎng)基呈黃色者為陽性，不變黃色為陰性。[質量控制]ATCC25922ATCCl3315ONPG溶液不穩(wěn)定，若培養(yǎng)基呈黃色即不可使用。苯丙氨酸試驗培養(yǎng)基[用途]苯丙氨酸脫氨酶是變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬所特有，可與腸桿菌科及其它細菌區(qū)別。也有助于種的鑒別，如苯丙酮酸莫拉菌呈陽性，其它莫拉菌屬的菌種呈陰性。[配法]DL-2g5g，酵3g，1g，1L。除瓊脂外其它的成分加熱溶解，pH7.3，4m1，121℃15min4℃存，備用。[用法]18~24h18~24h

100g/L4~5轉動使試劑布滿斜面，陽性者呈綠色，陰性者呈黃色。[質量控制]ATCCl3315ATCC25922[保存]置4℃冰箱保存，2周內用完。試劑可保存3月。注：苯丙氨酸試驗須在加入三氯化鐵試劑后立即觀察，因綠色易很快褪去，無陽性或陰性結果都必須在 5min內作出斷。劑流動，可使反應較快顏色亦較明顯。淀粉培養(yǎng)基[用途]用于鏈球菌和白喉棒狀桿菌的分型鑒定。[配法]蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，瓊脂(肉場培養(yǎng)基中不加)20g，1L，20g，小牛血清50ml。4500ml餾水，緩慢加熱溶解制成基礎培養(yǎng)20g250m1lL，pH7.2，121℃15min，平板備用。附：Lugol碘液配制⑴貯存液：將碘化鉀10g5g蕩直至溶解，裝入棕色瓶中。1∶511次，溶液呈深黃色。[用法]18~24h35℃孵育。18~24hLugol圍有透明圈為陽性，菌落周圍無透明圈為陰性。[質量控制]無乳鏈球菌陽性；產氣腸桿菌陰性。[保存]4℃冰箱保存，2液易于褪色，使用前應進行質量控制。注：⑴傾注好的淀粉瓊脂平板不宜放冰箱判斷。建議將培養(yǎng)基置螺旋帽的試管中保存，臨用時加熱溶解傾注平板，冷卻后使用。⑵淀粉酶在pH低于4.5時不穩(wěn)定。⑶配制時，避免過熱，否則淀粉顆粒自動分解導致假陽性結果。⑷培養(yǎng)時間應不少于36h。三、碳源和氮源利用試驗培養(yǎng)基粘液酸利用試驗培養(yǎng)基[用途]用于無動力不產氣不發(fā)酵乳糖的大腸埃希菌與志賀菌屬的鑒別。前者多數為陽性，后者均為陰性。[配法]10g，10g，1L，2g/L12ml。pH7.43~4m1，經121℃15min，4℃[用法]18~24h環(huán)接種培養(yǎng)基。35℃l~2[質量控制]大腸埃希菌ATCC25922IATCCl3313陰性。丙二酸鹽試驗培養(yǎng)基[用途]主要用于下述菌屬的鑒定：陽性菌有糞產堿桿菌、?利桑那菌、克雷

伯菌；陰性菌有不動桿菌屬、沙門菌屬、放線菌屬；特別是枸櫞酸桿菌，用于屬內種的鑒定如弗勞地、異型枸櫞酸桿菌呈陽性，而丙二酸鹽陰性枸椽酸桿菌呈陰性。[配法]1g，2g，磷酸氫0.6g，磷酸二氫鉀0.4g，2g，3g，0.25g，溴0.025g，1L。pH6.7,3m1，121℃滅菌15min，冷卻后置冰箱保存。取純培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基中，35℃24~48h。培養(yǎng)基由綠色變藍色為48h告。[質量控制]ATCC27236丙二酸鹽陰性桿菌陰性。[保存]置4℃冰箱，1周內用完。醋酸鹽試驗培養(yǎng)基[用途]用于腸桿菌科的鑒定。[配法]2g，5g，硫酸鎂2g/L，1g，20g，1L。pH6.8，2g/L12ml，121℃15min，備用。[用法]將試驗菌接種到斜面上，35℃培7d，1變?yōu)樗{色為陽性。[質量控制]大腸埃希菌(ATCC25922)陽性；宋內氏志賀菌(ATCCll060)陰性。[保存]置4℃冰箱，2周內用完。注：⑴試驗菌株要新鮮。⑵陰性菌要觀察至第7天，方可報告。葡萄糖酸鹽試驗培養(yǎng)基[用途]幫助屬間鑒別、種間鑒別和沙雷菌屬菌種的鑒定。[配法]1.5g,1g,1g,40g,37.25g,1L。pH7.02m1，115℃15min，冷卻備用。取待檢菌大量接種培養(yǎng)基，35℃24~48h,1ml，充分混勻，隔水加熱10min，觀察結果。產生黃—橙色沉淀為陽性，藍色沉淀為陰性。[質量控制]ATCC27236ATCC25922枸櫞酸鹽試驗培養(yǎng)基[用途]利用能力。[配法1(Simmons)]0.2g，1g，磷1g，5g，5g,2g/L溴麝香草酚藍溶液40m11L(pH6.8)。[配法2(Christensen)]3g，0.2g，酵母0.5g，0.1g，枸櫞0.4g，1g，硫代硫0.08g，5g，5g，蒸餾水lL（pH6.9）先將鹽類溶解于水內，調整pH，再加入瓊脂，加熱溶化后，加入指示劑，混合均勻后分裝試管，高壓滅菌121℃15min，放成斜面。將待檢菌濃1~4Simmons(西蒙)枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上有細菌生長，培養(yǎng)基由綠變成藍

色為陽性，無細菌生長，顏色不變藍色為陰性；Christinsen(鹽培養(yǎng)基斜面呈紅色為陽性，顏色不變?yōu)殛幮?。[保存]4℃冰箱，2[質量控制]肺炎克雷伯菌陽性；大腸埃希菌ATCC25922陰性。注：⑴當挑取同一培養(yǎng)物接種一組生化試驗管時，在接種枸椽酸鹽培養(yǎng)基前，接種針或環(huán)要用火焰滅菌，或先接種枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。因培養(yǎng)基上若存在葡萄糖或其它營養(yǎng)物質可導致假陽性。⑵接種時菌量應適宜，過少可導致假陰性結果，接種物過量可導致假陽性結果。24h48hpH碳源利用試驗培養(yǎng)基[用途][配法]磷酸氫二銨0.5g，磷酸二氫鉀1.3g，磷酸氫二鈉3.2g，硫酸鈉0.8g,硝酸鈉1g，待測物質2~10g，蒸餾水1L。7.2，分裝，116℃15min。[用法]9g/L鈉溶液菌懸液，接種培養(yǎng)基，于適當24~48h。若有細菌生長即為陽性，反之為陰性。[質量控制]菌液不可太濃，否則結果不易觀可用多種含碳化合物試驗同一種細菌。注：⑴使用的含碳化合物主要為各種糖類和有機酸類。⑵不能用一支培養(yǎng)管做多項試驗。四、其它生化試驗培養(yǎng)基硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基[用途]腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為?硝酸鹽，如銅綠假單胞菌能還原硝酸鹽并可產生氮氣等，而有些細菌則無此特性，故可以此鑒別。[配法]10g，硝酸鉀(分析純1L。pH7.4121℃15min附：試劑配制甲液：對氨基苯磺酸0.8g，5mol/L冰醋酸100ml。乙液：ɑ0.5g，5mol/L液100m1。[用法]35℃l~41ml，加2[質量控制]大腸埃希茵ATCC25922陽性；硝酸鹽陰性不動桿菌ATCC15038陰性。注：⑴因?硝酸鹽在自然界中分布很廣，制備此培養(yǎng)基時所用器皿均要清洗干凈。⑵硝酸鹽試驗很敏感，未接種的硝酸鹽培養(yǎng)基應以試劑進行檢查，確定培養(yǎng)基中是否存在?硝酸鹽，從而排除假陽性結果。⑶本試驗在判定結果時，必須在加試劑后立即觀察，否則可因培養(yǎng)液迅速褪色而影響判定。⑷沙門菌屬、假單胞菌屬的某些菌株，不但能還原硝酸鹽為?硝酸鹽，而且還能使?硝酸鹽繼續(xù)分解，生成氨和氮導致假陰性結果。⑸若加入硝酸鹽試劑不出現紅色，需檢查硝酸鹽是否被還原。可于原試管內再加入少許鋅粉，如出現紅色證明產生芳基肼，表示硝酸鹽仍然存在；如仍不產生紅色，表示硝酸鹽已被還原為氨和氮。亦可在培養(yǎng)基內加1只小倒管，若有氣泡產生，表示有氮氣生成?？梢耘懦訇幮?。?硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基

[用途][配方]10g,?2g,3g,1L.將上述成分混合后，加熱溶解，pH7.04ml，1，121℃15min備用。[用法]將試驗菌接種于?硝酸鹽培養(yǎng)基中，35℃24~48h。24h中有無氣泡出現，若有氣泡則為陽性，無氣泡為陰性。48h如無紅色出現為陽性，說明?硝酸鹽已被還原;反之為陰性，說明培養(yǎng)基中尚有?硝酸鹽存在。[質量控制]銅綠假單胞菌ATCC27853ATCCl5038[注意事項]⑴因?硝酸鹽在自然界中分布很廣，故在制備此培養(yǎng)基時所用器皿均要清洗干凈。⑵未接種的?硝酸鹽培養(yǎng)基應以硝酸鹽試劑進行檢查，出現紅色反應方可使用。3.40％膽汁肉湯培養(yǎng)基[用途]用于鏈球菌屬的鑒別。[配法]10g,5g,5g,新鮮膽汁(豬、牛)400m1,蒸餾水600m1。先將蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉加pH7.6，加入3m1，115℃20min，冷藏備用。取新鮮豬(牛)膽若干只，取膽汁用沙布過115℃20min，冷卻4℃?zhèn)溆?。[用法]35℃培24~48h，菌呈顆粒狀生長，上液澄清，管底有沉淀；陰性菌則不生長。[質量控制]ATCC29212ATCCl9615注：若為初次觀察或培養(yǎng)基本身不易觀察，可轉種血瓊脂平板。CAMP[用途]CAMP能力。[配法][用法]在血瓊脂平板上，先以金黃色葡萄球菌劃一橫線接種，再將被檢的群鏈球菌與上述劃線作垂直劃線接種,兩者不能相交，相距0.5~1.0cm，于35℃培養(yǎng)18~24h。在兩種細菌劃線之交接處出現箭頭形透明溶血區(qū)為陽性;無箭頭狀溶血區(qū)為陰性。[質量控制]ATCCl3813ATCC29212注：⑴CAMP人名。⑵每批要用A、D群鏈球菌作陰性對照，用B群鏈球菌作陽性對照。9g/L35%含量的羊血瓊脂平板效果較好。進行試驗效果亦較佳。硫化氫試驗培養(yǎng)基[用途]觀察細菌產生硫化氫的作用。

的常規(guī)培養(yǎng)基。現將兩培養(yǎng)基分述如下：⑴醋酸鉛培養(yǎng)基[配法]10g,0.1g,0.1g,1LpH4~5cm，115℃20min。將濾紙剪成0.1~1.0cm50醋酸鉛溶液浸透、烘干，置于皿內備用。[用法]35℃24h陽性，無變化為陰性。⑵硫酸?鐵瓊脂[配法]3g,3g,蛋白胨10g,O.2g,5g,0.3g,12g,lL。將上述成分加熱溶解，分裝試管，每管3m1，115℃滅菌20min，備用。[用法]將試驗菌株穿刺接種到培養(yǎng)基35℃24h培養(yǎng)基呈黑色為陽性，不變黑色為陰性。[質量控制]ATCCl3311ATCCll060[保存]置4℃冰箱，2周內用完。奧普托欣敏感試驗紙片（Optochinsensitivity[用途]測定細菌對化學藥品奧普托欣敏感性。[配法]奧普托欣（Optochin，乙基氫化羥基奎寧，ethylhydrocupreinehydrochloride)10mg10m11m1，2006mm37℃烘Optochin5μg8mm1﹕4000[用法]將被檢菌的肉湯培養(yǎng)物用無菌棉棒均勻涂布于血瓊脂平板上，取optochin35~37℃18~24h18mm藥。[質量控制]肺炎鏈球菌(ATCCl0015)陽性;化膿性鏈球菌(ATCCl9615)陰性。注：如果分離物生長稀少，則很難正確判定結果。其判定敏感的最低標準為抑菌15~16mm＜15mm，膽汁溶解試驗來確定。O/129[用途][配法]O/12950mg50ml1ml1006mm37℃烘干備O/12910μg。[用法]將待檢菌的肉湯涂布于堿性瓊脂平板，取O/129紙片貼于平板上，35℃培養(yǎng)18~24h。平板出現抑菌圈為陽性，無抑菌圈為陰性。[質量控制]創(chuàng)傷弧菌陽性；親水氣單胞菌陰性。pH9.6[用途][配法]pH9.6100m12g/L。pH9.6，2~3m1，121℃15min，備用。[用法]將待檢菌接種培養(yǎng)基，置35℃培

養(yǎng)18~24h。培養(yǎng)基有混濁物為陽性。[質量控制]糞腸球菌ATCC29212性鏈球菌ATCCl0389[保存]4℃冰箱保存，2周內用完。氰化鉀試驗培養(yǎng)基[用途]主要用于屬間的鑒別，生長有：弗氏枸櫞酸桿菌、克雷伯菌-腸桿菌菌群、銅綠假單胞菌；不生長：沙門菌-?利桑那菌群、大腸埃希菌、糞產堿桿菌。[配法]10g,5g,鉀0.225g,磷酸氫二鈉4.5g,lL。中，121℃15min，臨用時加入50g/L1.5m1照。[用法]取純培養(yǎng)物接種兩管，1實驗管，135℃培養(yǎng)24~72h。陽性結果為實驗管混濁，對照管混濁；陰性結果(敏感)為實驗管清晰(不生長)，對照管混濁(生長)。[質量控制]ATCC27853福氏志賀菌不生長。[保存]置冰箱內，1周用完。注：⑴氰化鉀抑菌能力與接種菌量及培養(yǎng)基成分有很大關系，所以在試驗時接種菌量不宜過多。⑵氰化鉀劇毒，使用時注意安全。氰化鉀培養(yǎng)基廢棄前(無論是否用過)，應作無害化處理：向每管加400g/L氫氧化鉀溶液0.1m1和米粒大的硫酸?鐵結晶。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基[用途]⑴幫助腸桿菌屬與大腸埃希菌屬，葡萄球菌屬與微球菌屬的屬間鑒別；伯菌間的菌種鑒別；結腸炎耶爾森菌的菌種鑒定。VP[配法]7g5g，5g，1L。pH121℃4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。[用法]18~24h24~48h，有時可能延長數天。有35℃VP25~30℃VP25℃育。觀察方法：奧梅拉(O-Meara)法試劑：氫氧化鉀40g、肌酐0.3g、蒸餾水100m1。首先將氫氧化鉀溶解。然后加肌3~410﹕137℃4h48℃2h，為陽性。貝立脫(Barritt)法試劑甲液：60g/L液；乙液：400g/L2m10.4ml35℃4h奧氏法敏感。[質量控制]大腸埃希菌ATCC25922溝腸桿菌陽性。[保存]4℃冰箱，2試劑易失效，應用前應進行質量控制。

注：⑴加入O-Meara試劑后要充分混合，促使乙酰甲基甲醇氧化，使反應易于進行。⑵試劑必須用已知陽性和陰性的標準菌株進行對照檢查。⑶試劑中加入400g/L氫氧化鉀是為了吸收二氧化碳。加入量少于0.2m1，且次序不能顛倒。⑷貝立脫方法是相當敏感的，它可檢出以前認為VP試驗陰性的某些細菌。⑸許多實驗室工作人員有一個錯誤的VPMR數細菌產生相反的反應（MRVP）些細菌如蜂房哈夫尼?菌(哈夫尼腸桿菌37℃MRVP同時陽性反應，后者常延遲出現。⑹α-萘酚乙醇溶液易失效，試劑放室溫暗處可保存1月。氫氧化鉀溶液可長期保存。國內多采用貝立脫法。甲基紅試驗培養(yǎng)基[用途]檢查細菌發(fā)酵葡萄糖產酸的能道桿菌陰性，單核李斯特菌陽性。[配法]⑴葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(見前)。0.1g，95％300m1，200m1。[質量控制]ATCC25922氣腸桿菌陰性。注：⑴試劑和培養(yǎng)基在應用前要用已知陽性菌(如大腸埃希菌)和已知陰性菌(如克雷伯菌)做對照試驗。⑵MR試驗的正確性取決于足夠的孵育時間，接種細菌后至少要孵育24h。通常每毫升培養(yǎng)物滴加1滴指示劑。[保存]4℃2甲基紅試劑置密閉的棕色瓶內，可使用3月。蛋白胨水培養(yǎng)基[用途]用于細菌靛基質試驗。[配法]蛋白胨(或胰蛋白胨)20g，氯化鈉5g，蒸餾水1L。pH7.22~3m1，置121℃15min附：試劑配制5g75ml25ml。1g95%95ml20m1。色氨酸滴板法試劑：L-0.1g100ml（pH6.8）

0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中。[用法]35℃培18~24h，靛基質試劑數滴，陽性者立即出現玫瑰紅色，陰性者呈黃色。[質量控制]大腸埃希菌ATCC25922陽性；肺炎克雷伯菌陰性。[保存]置4℃冰箱，使用期2周。注：⑴靛基質試驗方法還有試紙懸掛法，色氨酸滴板法及斑點法，請參閱有關資料。⑵選用的蛋白胨一定要含有豐富的色氨酸，否則不能應用。⑶國內多采用柯氏試劑。第六節(jié)抗菌藥物敏感試驗培養(yǎng)基抗菌藥物敏感試驗用于測定抗菌藥物或其它抗微生物制劑在體外抑制細菌生長的能力。有瓊脂擴散法和稀釋法兩種。WHOKirby-Bauer藥物敏感試驗，其技術簡單，可重復性好，且特別適合快速生長的致病菌。但其不適用于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和奈瑟菌的抗菌藥物敏感試驗，這些的細菌須在常規(guī)的抗菌藥物敏感試驗培養(yǎng)基內補充特殊的營養(yǎng)成分。一、M-H瓊脂培養(yǎng)基[用途]Kirby-Bauer使用本培養(yǎng)基。M-H(Muller-Hinton5%羊血制成血瓊脂平板或制成巧克力瓊脂平板用于檢測肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。[配法]1L，水解酪蛋白17.5g1.5g，17g

待可溶物完全溶解后，121℃高壓15min50℃左右，吸取25m190mm4mm[質量控制]用質控菌株測定藥物的抑菌環(huán)與NCCLS常用的標準菌株有：金黃色葡萄球ATCC25923；ATCC25922；ATCC27853；腸球菌ATCC2921233186；肺炎鏈ATCC6305；ATCCl0211。[保存]瓊脂平板應新鮮使用，4℃冰箱保存，1周內用完。注：⑴質量控制標準參見NCCLS紙片法藥敏試驗操作標準。⑵在M-H瓊脂培養(yǎng)基添加5%脫纖維羊血，即可用于肺炎鏈球菌的抗菌藥物敏感試驗。⑶在M-H瓊脂培養(yǎng)基上，補充輔酶Ⅰ15mg/ml，牛血紅蛋白15mg/m1，酵母浸5mg/m1，U/m1試驗。NCCLSGC100ml1.1mg，3mg，13mg基苯甲酸，0.01g,0.1g酶，0.25gⅠ,1mg10mgL-谷氨酰胺，100mg葡萄糖，0.02g硝酸鐵。二、M-H肉湯培養(yǎng)基[用途](MICMBC[配法]600m117.5g1.5g，400ml。pH

7.3±0.1，121℃15min如試驗菌對營養(yǎng)要求較高，臨用前按0.5%比例加入羊血。[質量控制]M-H方可使用。[保存]置4℃冰箱2周內用完。注：NCCLSM-HM-H10~25mg/L103.68g100ml10mg/ml8.36g，溶于100ml10mg/ml第七節(jié) L型細菌培養(yǎng)基一、L型細菌增菌培養(yǎng)基(一)高滲液體L型細菌菌增菌培養(yǎng)基[用途]L培養(yǎng)。高滲鹽液體增菌培氧基[配法]500g10g,40g，1L。將新鮮牛肉去除脂肪、筋膜，切500g1L30min，過濾；加入蛋白胨、氯化鈉后加熱溶解，并補足因蒸發(fā)而失去的水分，調pH7.4~7.6；用濾紙過濾后分裝小瓶，121℃15~20min。高滲糖液體增菌培養(yǎng)基[用途]L

型細菌增菌培養(yǎng)。[配法]500g，10g,30g，150g，1L。同上述高滲鹽培養(yǎng)基，唯高壓蒸115℃20min，分解。[用法]5ml35℃培l(xiāng)~7在上述增菌培養(yǎng)基上，L[質量控制]金黃色葡萄球菌L型生長良好。(二)L型增菌培養(yǎng)基[用途]型細菌的增殖培養(yǎng)。[配法]1L,30~40g,蛋白胨(優(yōu)質)20g.1L30g，150g，20g。pH7.4~7.6，分裝培養(yǎng)瓶，每15m1，121℃15min[用法]用無菌操作采集標本，立即接種L11035℃3~7天，逐日觀察。如發(fā)現培養(yǎng)液產生混濁、溶血、絮狀沉淀或瓶壁上附有粘性顆粒等細菌生L[質量控制]L24~72h，生長良好。[保存]置4℃冰箱內使用l~2周。二、L[用途]用于常見L型細菌的分離培養(yǎng)。Kaqan[配法]800m150g瓊脂粉(Oxoid)8g，血漿(人、馬、羊)200m1。將前四種成分稱量混合加熱溶pH7.5±0.1，80m1，121℃15min56℃20ml4℃冰箱備用。注：血漿要預先滅菌處理，并經56℃

水浴滅活30min。85-7[配法]1L，40g，蛋白30g，明膠(生物試劑)30g，5~8g。將上述成分混合，加熱溶解，校pH7.4~7.6，121℃15min4℃用。[用法]將血、腦脊液、尿等標本或增菌0.1m1，L35℃溫箱內啟蓋片刻，除去平板表面水分。在平板的邊端貼一片專用誘導紙片。覆蓋后置35℃103~5LLLLL[質量控制]⑴細菌誘導試驗，在該平板上能CowengLGL稀釋，取0.1ml培養(yǎng)。[保存]置4℃冰箱內，2周用完。第八節(jié)鉤端螺旋體、支原體和衣原體培養(yǎng)基20mg，磷酸二氫鉀120mg，磷酸氫二鈉一、鉤端螺旋體培養(yǎng)基—柯少夫(Korthof)培養(yǎng)基[用途][配法]400mg700mg，10mg，20mg，氯化鈣

440mg，500ml，活)8~10ml。將各成分溶于蒸餾水內煮沸20min，pH7.2，100ml，12l℃滅菌20min；無菌采取兔心血分離血清，置56℃30min100ml8~10m1；混合后，用無菌分裝5m1；56℃水浴30min；37℃2污染者。注:⑴為防止污染，每100m1培養(yǎng)基可加50mg磺胺嘧啶鈉。⑵為了促進鉤端螺旋體生長，可于該培養(yǎng)基中加入維生素B12及煙酸(各1mg/100m1)，并將兔血清量自8%減至5%，培養(yǎng)基中不加氯化鈣，（因氯化鈣對生長無作用，且常形成沉淀物），再以100℃加熱30min。用此法制得培養(yǎng)基清晰，無任何沉淀。二、支原體培養(yǎng)基1.4%PPLO[用途][配法]牛心(去脂絞碎)250g，5g,胰蛋白酶(不含乳糖)2.5g，1g，14g，蒸餾水1L。⑴牛心消化液配制：取去脂絞碎250g，5g900m12.5g，溶解于100ml5g/L50~60℃2h，中間不斷攪拌，消化后5min，用濾紙過濾后，補足水分至原量，然后1g，pH121℃15min⑵支原體基礎瓊脂：取上述牛心消化液(已加氯化鈉)lL，14g，pH7