2022毒素-抗毒素系統(tǒng)改變恥垢分枝桿菌對環(huán)境脅迫的適應(yīng)(全文)

2022毒素-抗毒素系統(tǒng)改變恥垢分枝桿菌對環(huán)境脅迫的適應(yīng)（全文）研究背景毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)廣泛存在于原核生物基因組中，包括細菌和古細菌。根據(jù)抗毒素滅活毒素的機制，TA模塊被分為七類，即I至VII型。TA系統(tǒng)參與維持質(zhì)粒穩(wěn)定性、細菌持久性、生物膜動力學(xué)、抗噬菌體感染和基因表達的調(diào)節(jié)。然而，TA對細菌的益處尚不清楚，因為TA基因座的缺失通常對細菌的適應(yīng)性沒有影響。此外，大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和惡臭假單胞菌中多個TA的缺失可能不會改變病原體對環(huán)境壓力或藥物的抵抗力。相比之下，幾項研究也表明，多種TA系統(tǒng)協(xié)同改變細菌的應(yīng)激耐受性。例如，MazF3、MazF6和MazF9的缺失損害了暴露于氧化應(yīng)激和營養(yǎng)限制條件下的結(jié)核分枝桿菌的存活。3個TA基因座相繼缺失后，恥垢分枝桿菌無法在復(fù)雜培養(yǎng)基中存活，這進一步說明病原體可能需要多個TA系統(tǒng)來適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境。結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）是結(jié)核?。═B）的病原體，編碼至93個TA系統(tǒng)。多種TA系統(tǒng)可在不同條件下表達，導(dǎo)致抑菌和轉(zhuǎn)錄重編程。VapC22系統(tǒng)的過度表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組改變，與M.tuberculosis暴露于營養(yǎng)限制和低氧條件時觀察到的轉(zhuǎn)錄組相似。此外，幾種毒素的過度表達導(dǎo)致形態(tài)變化和生長停滯，這可能促進藥物耐受。據(jù)報道，VapC4的過表達模擬了M.tuberculosis中的氨基酸饑餓，激活了氧化和銅應(yīng)激反應(yīng)。盡管對TA在M.tuberculosis中的功能進行了多項研究，但關(guān)于TA在抵抗環(huán)境壓力中的作用的數(shù)據(jù)仍然很少。研究方法本文選擇使用非致病性恥垢分枝桿菌（M.Smegmatis）作為研究對象（易于操作且翻代時間短）。首先，應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)連續(xù)敲除M.Smegmatismc2155染色體編碼的8個假定TA。檢測Δ8TA菌株在抵抗?fàn)I養(yǎng)匱乏、氧化應(yīng)激、藥物處理和噬菌體感染的能力。隨后，在Δ8TA菌株中表達每一對功能性TA并分析其在抵抗環(huán)境脅迫中的能力。最后，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析MazEF在抵抗?fàn)I養(yǎng)匱乏、藥物耐受和噬菌體感染的具體機制。研究結(jié)果一、假定TA系統(tǒng)的實驗確認Rv0207c-0208c是Ms0251-0252的同源物，是結(jié)核分枝桿菌中預(yù)測TA系統(tǒng)。為了驗證Ms0251-0252是否是一個功能性TA系統(tǒng)（圖1A），將毒素編碼基因Ms0251克隆到無水四環(huán)素（ATc）的誘導(dǎo)載體中,Ms0251的誘導(dǎo)表達抑制了M.smigmats的生長（圖1B），這種抑制可以通過共表達抗毒素Ms0252來挽救。這些結(jié)果表明Ms0251-0252作為TA發(fā)揮作用，表明M.smegmats編碼至少6個功能性TA模塊（圖1A）。1恥垢分枝桿菌中的毒素-抗毒素系統(tǒng)。（A）恥垢分枝桿菌mc2155基因組中八個假定TA對的基因組圖譜。（B）不同TA基因誘導(dǎo)表達的恥垢分枝桿菌生長曲線。二、八個TA缺失突變體的表型分析為了確定多個TA系統(tǒng)的適應(yīng)性成本，從M.smegmatismc2155染色體上順序刪除了8個假定的TA位點。研究表明，Δ8TA和野生型菌株在7H9和LB-T復(fù)雜培養(yǎng)基中的細胞存活沒有顯著差異（圖2A和B）。然而，在PBS-T營養(yǎng)匱乏培養(yǎng)基中觀察到明顯的存活缺陷（圖2C）。在7H9和Sauton培養(yǎng)基中，Δ8TA菌株對200mg/mL鏈霉素更敏感，對5%H2O2氧化應(yīng)激和16mg/mL異煙肼更耐受（圖2D和E）。此外，Δ8TA菌株比野生型菌株更容易被噬菌體D29和TM4殺死，這一表型在Sauton固體培養(yǎng)基中進一步增強（圖2F）。噬菌體敏感性的這種介質(zhì)依賴性差異可以通過TA系統(tǒng)在不同培養(yǎng)條件下的差異表達來解釋。綜上所述，我們的結(jié)果表明，TA在對環(huán)境應(yīng)激、藥物暴露和噬菌體感染的抵抗中起著重要而不同的作用。2野生型和8TA菌株對應(yīng)激條件的敏感性。（A至C）在7H9（A）、LB-T復(fù)雜培養(yǎng)基（B）和PBS-T營養(yǎng)匱乏培養(yǎng)基（C）中培30天。（D和E）不同壓力刺激后野生型和Δ8TA菌株的敏感性測定。（F）在7H10或Sauton固體培養(yǎng)基中進行噬菌斑分析。三、TA編碼的蛋白質(zhì)在不同的應(yīng)激條件下有不同的功能Ms4448-4447和Ms5634-5635在抵抗饑餓中起著重要作用（圖3A）。在7H10和Sauton固體培養(yǎng)基中，Ms0251-0252的表達增加了對H2O2和INH的敏感性，但增加了對鏈霉素的抗性。在7H10培養(yǎng)基中，Ms1278-1277或Ms4448-4447的表達降低了對SDS和H2O2處理的抗性，但增加了對INH處理的抗性。有趣的是，Ms5634-5635的表達顯著降低了INH耐藥性（圖3B），表明TA模塊不僅導(dǎo)致耐藥性增加，而且降低了耐藥性。Ms4448-4447的表達略微增加了7H10平板上對噬菌體感染的抗性，并大大增強了Sauton培養(yǎng)基平板上對噬菌體感染的抗性（圖3C）。綜上所述，這些結(jié)果表明TA系統(tǒng)在暴露于各種壓力條件下執(zhí)行不同的功能。3TA系統(tǒng)在暴露于應(yīng)力條件下執(zhí)行不同的功能。（A）在PBS-T培養(yǎng)基中生長10天并計數(shù)CFU。（B）不同壓力刺激后野生型，Δ8TA和TA表達菌株的敏感性測定。（C）Δ8TA和TA表達菌株在7H10或Sauton固體培養(yǎng)基上進行噬菌斑分析。四、轉(zhuǎn)錄組分析揭示了MazEF在鐵代謝中的作用我們發(fā)現(xiàn)在MazEF表達后408個基因的轉(zhuǎn)錄顯著不同，其中129個被誘導(dǎo)，279個被抑制，這表明，MazEF的表達改變了約10%的M.smigmatis基因組（圖4A）。通過實時定量PCR（qRT-PCR）進一步驗證了五個高度上調(diào)和三個下調(diào)基因的差異表達，這證實了mRNA水平的變化與RNA測序（RNA-seq）所見的變化相當(dāng)（圖4B）。接下來，我們根據(jù)Mycobrowser提供的功能分類對這些差異表達的基因進行了注釋(https://mycobrowser.epfl.ch/)。我們在MazEF表達后上調(diào)4.0倍的基因中發(fā)現(xiàn)了Mbt基因簇，這些基因編碼“鐵載體基團非核糖體肽生物合成”途徑的關(guān)鍵成分，該途徑負責(zé)合成鐵螯合鐵載體。此外，除其他鐵調(diào)節(jié)基因外，參與鐵獲取、運輸和儲存的基因MazEF表達下也被上調(diào)（圖4C）。為了進一步表征MazEF在鐵獲取中的作用，我們分析了在限鐵的環(huán)境中M.smegmatis菌株的生長（圖4D）。MazEF在限鐵的環(huán)境中強烈抑制了M.smegmatis的生長，但不影響細菌在富鐵培養(yǎng)基中的生長。這些結(jié)果表明，MazEF調(diào)節(jié)了M.smegmatis中的鐵代謝。4MazEF表達對恥垢分枝桿菌Δ8TA菌株轉(zhuǎn)錄組的影響。（A）火山圖顯示了在Δ8TA菌株中表達MazEF后的差異基因。（B）通過RNA-seq和qRT-PCR測定MazEF表達菌株中差異表達基因的比較分析。（C）熱圖顯示MazEF表達后鐵調(diào)節(jié)基因表達水平的倍數(shù)變化。（D）限鐵環(huán)境中表達MazEF菌株的生長曲線。研究結(jié)論本研究首次系統(tǒng)