木薯酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 生物121班 翁振耀

PAGE實(shí)驗(yàn)名稱木薯酒精發(fā)酵院系生物與化學(xué)工程學(xué)院專業(yè)生物工程班級(jí)生物121學(xué)號(hào)201200606029姓名翁振耀指導(dǎo)老師趙東玲二〇一五年七月十二日 目錄 1緒論 11.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?11.2實(shí)驗(yàn)原理 12材料與方法 22.1實(shí)驗(yàn)材料 22.1.1菌種 22.1.2培養(yǎng)基 22.1.3主要藥品與試劑 22.1.4主要儀器設(shè)備 32.1.5其他輔助儀器 32.2方法與步驟 42.2.1試劑配制 42.2.2培養(yǎng)基配制 42.2.3釀酒酵母GGSF16培養(yǎng) 52.2.4分析方法 53實(shí)驗(yàn)記錄與計(jì)算 73.1記錄發(fā)酵時(shí)間流程 73.2稱重?cái)?shù)據(jù) 83.3計(jì)算方法 83.3.1還原糖的計(jì)算 93.3.2總糖的計(jì)算 93.3.3測(cè)酒精度 113.3.4發(fā)酵效果的判定指標(biāo) 114結(jié)果與討論 124.1結(jié)果 124.1.1計(jì)算結(jié)果 124.1.2發(fā)酵效果指標(biāo) 124.1.3CO2失重作圖 124.2 討論 134.2.1結(jié)果討論 134.2.2誤差分析 134.2.3實(shí)驗(yàn)收獲 13致謝 14參考文獻(xiàn) 14附錄 14木薯酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)PAGE151緒論1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握木薯淀粉液化、糖化原理。2.掌握酒精發(fā)酵的基本原理。3.掌握總糖、還原糖及酒度的測(cè)定原理和方法。1.2實(shí)驗(yàn)原理酒精發(fā)酵是在厭氧條件下，己糖分解為乙醇并釋放出二氧化碳。酒精發(fā)酵的類型有3種：即通過(guò)EMP途徑的酵母菌酒精發(fā)酵、通過(guò)HMP途徑的細(xì)菌酒精發(fā)酵和通過(guò)ED途徑的細(xì)菌酒精發(fā)酵[4]。酵母菌通過(guò)EMP途徑分解己糖生成丙酮酸，在厭氧條件和微酸性條件下，丙酮酸則繼續(xù)分解為乙醇。如果在堿性條件或者培養(yǎng)基中加有亞硫酸鹽時(shí)，則發(fā)酵的主要產(chǎn)物是甘油，這也是工業(yè)的甘油發(fā)酵。因此，如果要用酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，就必須控制發(fā)酵液的微酸性條件。2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1菌種釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）GGSF162.1.2培養(yǎng)基（1）YPD液體培養(yǎng)基：用于種子培養(yǎng)。（2）木薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基：用于酵母發(fā)酵。2.1.3主要藥品與試劑表2-1主要藥品與試劑Table2-1Mainchemicalsandreagents產(chǎn)品名稱規(guī)格產(chǎn)地/廠家葡萄糖AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司酵母浸膏BR廣東環(huán)凱微生物科技有限公司細(xì)菌學(xué)蛋白胨BR廣東環(huán)凱微生物科技有限公司磷酸二氫鉀AR廣東光華化工廠有限公司無(wú)水氯化鈣AR廣東汕頭市西隴化工廠氯化銨AR廣東光華化學(xué)廠有限公司七水硫酸鎂AR廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司氫氧化鈉AR廣州化學(xué)藥劑廠鹽酸AR廣東汕頭市西隴化工股份有限公司硫酸AR廣東汕頭市西隴化工股份有限公司酒石酸鉀（C4H4O6KNa·4H2O）AR天津市大茂化學(xué)試劑廠硫酸銅(CuSO4·5H2O)AR天津市大茂化學(xué)試劑廠亞甲基（C16H18ClN3S·3H2O）AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司表2-2酶制劑Table2-2Enzymepreparation酶制劑規(guī)格液化酶40000U/mL糖化酶100000U/mL2.1.4主要儀器設(shè)備表2-3主要儀器設(shè)備Table2-3Maininstrumentsandequipments儀器名稱規(guī)格產(chǎn)地/廠家恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-2112C上海智城分析儀器制造有限公司電子天平T－500美國(guó)雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司全溫度恒溫調(diào)速搖床柜HWY-2112上海智城分析儀器制造有限公司電子天平JJ200常熟市雙杰測(cè)試儀器廠電子分析天平AB104－N梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司酒精濃度計(jì)MC冀州市耀華器械儀表廠全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱ZFD－5230上海智城分析儀器制造有限公司立式壓力蒸汽滅菌器LS-B35L-I江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司立式壓力蒸汽消毒器628B-2鐵嶺市醫(yī)療器械總廠不銹鋼電熱蒸餾水器15KW－20L上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠光波爐YS－A007B廣東省茂名市亞洲電器有限公司垂直流超凈工作臺(tái)2HJH-1112C上海智城分析儀器制造有限公司2.1.5其他輔助儀器（1）40目篩：篩木薯粉（2）紗布及脫脂棉：總糖測(cè)定發(fā)酵液預(yù)處理過(guò)濾用及還原糖測(cè)定過(guò)濾（3）500mL三角瓶：20個(gè)（包扎滅菌），用于發(fā)酵（4）紗布及牛皮紙、保鮮膜：用于三角瓶包扎（5）200mL量筒：2個(gè)，要包好滅菌，用于分裝發(fā)酵培養(yǎng)基（一用一備）（6）玻璃棒：2根，包好滅菌，用于調(diào)發(fā)酵液pH值（一用一備）（7）200mL燒杯：2個(gè)，包好滅菌，用于分裝發(fā)酵培養(yǎng)基（一用一備）（8）100mL量筒：2個(gè)，用于量取發(fā)酵液，收集酒精（9）酒精計(jì)：一個(gè)，規(guī)格0-10%，用完要用水洗好，擦干（10）水銀溫度計(jì)：測(cè)酒精時(shí)量溫度，用完要用水洗好（11）250mL三角瓶：4個(gè)，用于總糖消化和測(cè)還原糖（12）105cm回流管：帶塞（13）電爐：用于滴糖加熱（14）pH試紙：用于測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基pH(4.5)值，測(cè)總糖調(diào)pH(微酸性)（15）電子天平：規(guī)格0-500克，用于測(cè)搖瓶總重（二氧化碳失重）（16）精餾裝置：包括500mL精餾瓶，用于酒精測(cè)定（17）250mL容量瓶：用于總糖及還原糖測(cè)定的試樣制備（18）5L三角瓶:一個(gè)，木薯粉液化和糖化（19）注射器及過(guò)濾除菌膜（20）25mL滴定管2.2方法與步驟2.2.1試劑配制（1）2.5g/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：配取3L，分三次配，每次配1L。先稱取20.0g瓶裝葡萄糖放入稱量瓶?jī)?nèi)于105℃烘4h后，置于干燥器中冷卻，再分三次稱量，每次準(zhǔn)確稱取烘干樣品2.5000g于小燒杯中，加適量水溶解，再加5mL濃鹽酸，攪拌混勻后引流，加水定容至1000mL。再重復(fù)配兩次。（提前2-3天配好備用。）（2）NH4Cl：使用時(shí)終濃度為0.6g/L。稱取1.8gNH4Cl固體，用適量無(wú)菌水溶解后，在超凈臺(tái)中用注射器和過(guò)濾膜操作，將溶解液過(guò)濾除菌待用。（3）菲林甲液：配3L，分三次配制，每次配1L。每次稱取69.3g硫酸銅（含5個(gè)結(jié)晶水）加蒸餾水定容至1000mL。再重復(fù)配兩次。（4）菲林乙液：配3L，分三次配制，每次配1L。每次稱346.0g酒石酸鉀鈉加100.0g氫氧化鈉，混溶于適量蒸餾水后，加蒸餾水定容至1000mL。再重復(fù)配兩次。（5）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的HCl溶液(總糖的測(cè)定-消化)：量取36%-38%濃鹽酸556.0mL于1L容量瓶，加蒸餾水定容至1000mL。（6）2mol/LH2SO4溶液(調(diào)發(fā)酵液pH)：吸取濃硫酸（18M）11.1mL緩慢加入裝有適量水的小燒杯中，冷卻后引流到100mL容量瓶，加蒸餾水定容至100mL。（7）200g/LNaOH溶液(總糖的測(cè)定-消化)：稱取100.0g氫氧化鈉于小燒杯中溶解，引流到500mL容量瓶，加蒸餾水定容到500mL。（8）2mol/LNaOH溶液(酒精度測(cè)定)：稱取8.0g氫氧化鈉于小燒杯中溶解，引流到100mL容量瓶，加蒸餾水定容到100mL。（9）亞甲基蘭溶液（1%，w/v）:稱取1.0g亞甲基藍(lán)，在小燒杯中加水溶解，引流到100mL容量瓶并定容至100mL。2.2.2培養(yǎng)基配制（1）YPD液體培養(yǎng)基：配制500mL。稱?。浩咸烟?0g，酵母膏5g，蛋白胨5g，三者混合煮溶解后定容到500mL。自然pH，分裝到三個(gè)250mL三角瓶（每瓶150mL）和4支試管（每支5mL）。115℃滅菌20min。（2）YPDAgar:量取50mL液體YPD，加入1g瓊脂，混合后裝入100mL三角瓶，115℃滅菌20min。冷卻到適合溫度后趁熱倒試管斜面。（3）木薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取過(guò)40目篩的木薯粉429.6g加入5L三角瓶，以料水比1：3的比例混合于60℃的自來(lái)水中，添加相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)鹽為MgSO4·7H2O1.35g，KH2PO44.5g，CaCl20.6g，調(diào)漿定容到3L,按10U/g木薯粉的量加入液化酶，攪拌混勻后60℃下保溫30min糊化，然后迅速升溫到97℃，保溫液化1.5h后，115℃滅菌30min.冷卻到室溫（30℃左右），添加過(guò)濾除菌的NH4Cl全部溶液（用1.8g固體NH4Cl配成），搖勻，滴加2mol/LH2SO4調(diào)pH至4.5，按150U/g木薯粉加入糖化酶。攪拌均勻后，取發(fā)酵液60mL置于三角瓶中分別取樣測(cè)定初總糖和初還原糖。2.2.3釀酒酵母GGSF16培養(yǎng)酵母菌種培養(yǎng)流程：實(shí)驗(yàn)室保藏菌種→斜面活化→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→接種發(fā)酵（1）斜面活化：無(wú)菌操作將實(shí)驗(yàn)室保存的酵母GGSF16接種到斜面培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)1d-2d。（2）一級(jí)種子培養(yǎng)：挑取活化后健壯的菌種取一環(huán)，接種（二級(jí)種子接種前8-10小時(shí)接）到液體試管培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)。（3）二級(jí)種子培養(yǎng)：（接種發(fā)酵液前8小時(shí)）將一級(jí)種子按體積比1%接種到三角瓶中。（4）接種發(fā)酵：按接種量為10％，接種釀酒酵母GGSF16至液化糖化后的木薯培養(yǎng)基中。攪拌混勻后分裝到19個(gè)500mL三角瓶。每瓶加150mL，用透氣膜、保鮮膜封口，第一次稱重，于33℃，轉(zhuǎn)速為120r/min，搖床培養(yǎng)24h，培養(yǎng)期間定時(shí)間隔稱重。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定酒精度，殘總糖和殘還原糖。2.2.4分析方法（1）還原糖的測(cè)定[3]①試樣的制備：稱取木薯發(fā)酵液試樣10mL于250mL容量瓶定容至250mL，用紗布夾脫脂棉過(guò)濾，濾液搖勻備用。②斐林試劑所消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積標(biāo)定A.預(yù)備試驗(yàn)：分別吸取費(fèi)林甲液、乙液及標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶?jī)?nèi)，加20mL蒸餾水，搖勻，加入數(shù)顆玻璃珠，在電爐上加熱沸騰，加入亞甲基蘭溶液（1%，w/v）2滴，蓋住表面皿，保持沸騰以避免空氣中氧氣的干擾，在沸騰狀態(tài)下用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失為止。記錄標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液消耗的總體積。B.正式試驗(yàn)：吸取費(fèi)林甲液、乙液及標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶?jī)?nèi)，加水20mL，加入少于預(yù)備試驗(yàn)1毫升的2.5g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，加入玻璃珠數(shù)顆，置電爐上沸騰2min，滴入亞甲基蘭2滴，沸騰狀態(tài)下1min內(nèi)以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定，至溶液藍(lán)色剛好消失。記錄標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液消耗的總體積，并做平行試驗(yàn)，使兩次滴定結(jié)果之差在0.1mL之內(nèi)。③試樣還原糖的測(cè)定A.預(yù)備試驗(yàn)：吸取費(fèi)林甲液、乙液及待測(cè)液各5mL于250mL三角瓶?jī)?nèi)，加20mL水，搖勻，加入數(shù)顆玻璃珠，在電爐上加熱沸騰，加入亞甲基蘭溶液2滴，蓋住表面皿，保持沸騰以避免空氣中氧氣的干擾，在沸騰狀態(tài)下用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失為止。記錄標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液消耗的總體積。B.正式試驗(yàn)：吸取費(fèi)林甲液、乙液及待測(cè)液各5mL于250mL三角瓶?jī)?nèi)，加水20mL，加入少于預(yù)備試驗(yàn)1毫升的2.5g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，加入玻璃珠數(shù)顆，置電爐上沸騰2min，滴入亞甲基蘭2滴，沸騰狀態(tài)下1min內(nèi)以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定，至溶液藍(lán)色剛好消失。記錄標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液消耗的總體積，并做平行試驗(yàn)，使兩次滴定結(jié)果之差在0.1mL之內(nèi)。（2）總糖的測(cè)定[3]試樣制備：量取10mL糖化醪試樣于250mL三角瓶中，加70mL水和20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的HCl溶液，沸水浴中水解60min（用長(zhǎng)為105cm回流管回流），冰水迅速冷卻，以200g/L的NaOH溶液(大約20ml)中和到微酸性，用紗布夾脫脂棉過(guò)濾，濾液定容到250mL，搖勻備用。預(yù)備試驗(yàn)：同還原糖的測(cè)定。正式試驗(yàn)：同還原糖的測(cè)定。（3）酒精度測(cè)定準(zhǔn)確量取發(fā)酵液100mL，再用100mL蒸餾水洗滌至500mL蒸餾瓶中，加入5mL2mol/L的NaOH溶液，消泡劑4滴，玻璃珠數(shù)個(gè)，加熱蒸餾收集酒精于100mL量筒中，待餾出液接近刻度時(shí)（約96mL）取下，加水至刻度，搖勻，降溫，待酒精降溫到20℃左右，用酒精計(jì)和溫度計(jì)測(cè)實(shí)時(shí)溫度和酒精度，并換算成20℃的酒度（％，v/v）。（4）CO2失重測(cè)定方法接種完畢后，分裝包扎封口，用電子天平稱量發(fā)酵瓶，在發(fā)酵過(guò)程中每間隔一段時(shí)間稱重一次，共稱量6次（稱重前應(yīng)先搖晃發(fā)酵瓶，以除去發(fā)酵醪液中的CO2），直至CO2失重＜0.2g，發(fā)酵結(jié)束。（5）附加信息①配置150mL發(fā)酵酒精度為6%(v/v)的發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶需木薯粉21.72g，則19瓶共需木薯粉：19×21.72=412.68g（本小組稱取413.0g配制調(diào)漿）②液化酶（40,000U/mL）：按10U/g木薯粉的量加入加入液化酶的量=10×413/40000=0.10325mL=103.25μL③糖化酶（100,000U/mL）：按150U/g木薯粉的量加入加入糖化酶的量=150×413/100000=0.6195mL=619.50μL④木薯粉的淀粉含量為：71%(w/w)；淀粉變?yōu)槠咸烟荹(C6H10O5)n+nH2O=nC6H12O6]的理論轉(zhuǎn)化率為：111.11%(w/w)；葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇的理論轉(zhuǎn)化率為：51.1%;酒精在20oC的密度為：0.789g/mL。3實(shí)驗(yàn)記錄與計(jì)算3.1記錄發(fā)酵時(shí)間流程大概流程：40目篩篩過(guò)的木薯粉(21.72x20=412.68g,取413.0g)→加營(yíng)養(yǎng)鹽→加水定容至3000ml→并加入液化酶→60℃恒溫30min（糊化）→迅速升溫至97℃，保持90min（液化）→115℃滅菌30min→冷卻至室溫→加入過(guò)濾除菌的NH4Cl→用H2SO4調(diào)pH至4.5→加糖化酶→取樣測(cè)初總糖和初還原糖→按10%的接種量（300mL）接種到糖化醪（最終體積大約為3000mL）中→分裝到19個(gè)三角瓶→用保鮮膜代替牛皮紙綁好封口，稱重→搖床培養(yǎng)24h，設(shè)定溫度33℃，轉(zhuǎn)速120r/min→定時(shí)稱重（每4小時(shí)稱一次）→發(fā)酵結(jié)束，測(cè)殘?zhí)?、殘還原糖、酒精度。詳細(xì)時(shí)間流程：2015-7-1（星期五）14:30—清點(diǎn)、清洗實(shí)驗(yàn)儀器15:55—5L、500mL三角瓶及其他儀器121℃空消30min20:00—一級(jí)種子接種2015-7-2（星期六）7:30—滅菌鍋（立式壓力蒸汽消毒器：628B-2）預(yù)熱。燒60℃自來(lái)水3L左右（調(diào)漿用）7:40—稱量429.6g木薯粉，營(yíng)養(yǎng)鹽MgSO4·7H2O1.35g，KH2PO44.5g，CaCl20.6g7:45—灌裝木薯粉、加營(yíng)養(yǎng)鹽7:50—調(diào)漿定容至3000ml7:55—三角瓶稱皮重（皮重是三角瓶重量加上透氣膜、牛皮紙的重量）8:05—加液化酶（規(guī)格：40000U/mL）107.4μL8:07—二級(jí)種子接種8:08—滅菌鍋升溫至60℃，三角瓶入鍋，保持30min（糊化）8:10—二級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)8:38—滅菌鍋繼續(xù)升溫9:15—滅菌鍋升溫至97℃，保持90min（液化）10:51—滅菌鍋繼續(xù)升溫，準(zhǔn)備滅菌（排冷空氣2次）11:30—滅菌鍋升溫至115℃，保持,30min12:00—滅菌結(jié)束,冷卻降壓12:22—三角瓶出鍋，自然冷卻一段時(shí)間后，用冷水冷卻到室溫14:45—木薯培養(yǎng)基冷卻完畢14:49—加入除菌的NH4Cl15:08—調(diào)pH4.6（先取2mL預(yù)滴定，再估算加酸總量。2mol/LH2SO4約10.0ml,3000ml培養(yǎng)基）15:32—加糖化酶（規(guī)格：100000U/mL）800.0μL15:39—發(fā)酵液取樣60mL15:42—接種300ml(種子),提前8-10小時(shí)準(zhǔn)備種子培養(yǎng)液。斜面種要提前活化。15:59—開(kāi)始分裝，每瓶150mL，分一瓶封口一瓶（先蓋一層透氣膜，再蓋一層保鮮膜，用繩子綁緊），然后稱重，對(duì)號(hào)記錄每瓶的稱量時(shí)間和重量。依次分裝完20瓶。16:00—第一瓶第一次稱重16:32—分裝完畢16:34—第一次稱重完畢16:40—搖床（恒溫培養(yǎng)振蕩器：101-3型）培養(yǎng)（33℃、120R/min）18:34—第二次稱重18:42—第二次稱重完畢21:31—第三次稱重21:35—第三次稱重完畢2012-7-3（星期日）0:00—第四次稱重0:05—第四次稱重完畢7:00—第五次稱重7:04—第五次稱重完畢10:07—第六次稱重10:13—第六次稱重完畢12:00—第七次稱重12:04—第七次稱重完畢13:02—第八次稱重13:06—第八次稱重完畢發(fā)酵結(jié)束3.2稱重?cái)?shù)據(jù)表3-118號(hào)搖瓶總重（三角瓶和發(fā)酵液）數(shù)據(jù)記錄稱重次數(shù)稱重時(shí)間重量/g稱重日期116:00352.02015.07.03218:34351.82015.07.03321:31350.92015.07.03424:00349.92015.07.0357:00347.72015.07.04610:07346.92015.07.04712:00346.42015.07.04813:02346.22015.07.043.3計(jì)算方法在本次實(shí)驗(yàn)中，我測(cè)定的是1號(hào)發(fā)酵液，以下是測(cè)定結(jié)果及其相應(yīng)的計(jì)算。測(cè)定：（1）全組測(cè)：初總糖，初還原糖；（2）自己測(cè)：殘總糖，殘還原糖，酒精度；（3）二氧化碳失重（作圖表示）。3.3.1還原糖的計(jì)算還原糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）=（A-B）×0.0025×250/5×1/10×100A――――滴定斐林試劑所消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；B――――斐林試劑加入樣品濾液后所消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；0.0025――――標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度，g/mL；250――――樣品稀釋體積，mL；5――――稀釋糖化醪的體積，mL；10――――量取糖化醪的體積，mL。計(jì)算初還原糖含量（左師兄用自己的試劑幫測(cè)定）表3-2初還原糖滴定結(jié)果滴定的溶液預(yù)備試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL正式試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL平均值/mL123菲林試劑（A）23.2023.1023.2023.17菲林試劑+發(fā)酵液（B）17.4017.5017.6017.50初還原糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）=（A-B）×0.0025×250/5×1/10×100=（23.17-17.50）×0.0025×250/5×1/10×100=7.09g/100mL計(jì)算殘還原糖含量（全班統(tǒng)一標(biāo)定菲林試劑，自己測(cè)定18號(hào)瓶）表3-3殘還原糖滴定結(jié)果滴定的溶液預(yù)備試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL正式試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL平均值/mL12菲林試23.2023.1023.2023.17菲林試劑+發(fā)酵液發(fā)酵液21.7022.9022.8022.47殘還原糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）=（A-B）×0.0025×250/5×1/10×100=（23.17-22.47）×0.0025×250/5×1/10×100=0.88g/100mL3.3.2總糖的計(jì)算總糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）=(A-B)×0.0025×250/5×1/10×100A――――滴定斐林試劑消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；B――――斐林試劑加入樣品濾液后消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；0.0025――――標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度，g/mL；250――――樣品稀釋體積，mL；5――――稀釋糖化醪的體積，mL；10――――量取糖化醪的體積，mL。計(jì)算初總糖含量，平行測(cè)三次表3-4初總糖滴定結(jié)果滴定的溶液預(yù)備試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL正式試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL平均值/mL12菲林試劑23.2023.1023.2023.17菲林試劑+發(fā)酵液①16.7616.7616.7216.75初總糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）=(A-B)×0.0025×250/5×1/10×100=（23.17-16.75）×0.0025×250/5×1/10×100=8.07g/100mL計(jì)算殘總糖含量（全班統(tǒng)一標(biāo)定菲林試劑，自己測(cè)定1號(hào)瓶）表3-5殘總糖滴定結(jié)果滴定的溶液預(yù)備試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL正式試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL平均值/mL12菲林試劑23.2023.1023.2023.17菲林試劑+發(fā)酵液21.3021.4021.3021.33殘總糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）=(A-B)×0.0025×250/5×1/10×100=（23.17-21.33）×0.0025×250/5×1/10×100=2.30g/100mL3.3.3測(cè)酒精度表3-6換算成20℃的酒度（％，v/v）編號(hào)溫度酒精度（％，v/v）測(cè)定時(shí)的時(shí)間1號(hào)搖瓶發(fā)酵液實(shí)測(cè)22.0℃6.42015.07.0516:30—17:35折算后20.0℃5.03.3.4發(fā)酵效果的判定指標(biāo)（1）糖的利用率反映總糖在發(fā)酵前后利用的百分率糖的利用率=（初總糖-殘總糖）/初總糖×100%=（8.07-2.30）/8.07×100%=71.50%（2）實(shí)際出酒率反映發(fā)酵醪液酒精質(zhì)量與初總糖的百分比實(shí)際出酒率=酒精度×0.789/初總糖×100%=5.0×0.789/8.07×100%=48.88%（3）發(fā)酵效率反映實(shí)際出酒率與理論實(shí)際出酒率的百分比發(fā)酵效率=酒精度×0.789/（初總糖×0.511）×100%=5.0×0.789/(8.07×0.511)×100%=95.66%（4）糖酒轉(zhuǎn)化率反映菌種發(fā)酵前后利用總糖的能力糖酒轉(zhuǎn)化率=酒精度×0.789/（初總糖-殘總糖）×100%=5.0×0.789/(8.07-2.30)×100%=68.37%4結(jié)果與討論4.1結(jié)果4.1.1計(jì)算結(jié)果表4-1計(jì)算結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果初還原糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）7.09殘還原糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）0.88初總糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）8.07殘總糖含量（以葡萄糖計(jì)，g/100mL）2.30換算成20℃的酒度（％，v/v）5.04.1.2發(fā)酵效果指標(biāo)表4-2發(fā)酵效果計(jì)算結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果糖利用率71.50%實(shí)際出酒率48.88%發(fā)酵效率95.88%糖酒轉(zhuǎn)化率68.37%4.1.3CO2失重作圖圖4-1CO2失重趨勢(shì)圖（發(fā)酵液體積：150mL）CO2失重趨勢(shì)比較明顯：①前3小時(shí)內(nèi)，處在發(fā)酵前期，菌種處在增殖生長(zhǎng)階段，菌體數(shù)量比較少，利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)速度慢，CO2失重趨勢(shì)平緩；②發(fā)酵3小時(shí)—20小時(shí)之間，進(jìn)入主發(fā)酵期，積累了大量菌體，酵母菌代謝活躍，利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較快，CO2失重趨勢(shì)急劇下滑；③發(fā)酵20小時(shí)后，大概進(jìn)入發(fā)酵后期，大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)被消耗，菌體代謝緩慢，隨后CO2失重趨勢(shì)又恢復(fù)平緩。討論4.2.1結(jié)果討論本次初還原糖和初總糖含量較高分別為7.09g/100mL、8.07g/100mL，而殘還原糖和殘總糖含量較多分別為0.88g/100mL、2.30g/100mL。糖利用率較高為71.50%，糖酒轉(zhuǎn)化率高為68.37%，發(fā)酵效率較高為95.88%，實(shí)際出酒率適中為48.88%，酒精的質(zhì)量不高，酒精度較低。綜合可知，本次實(shí)驗(yàn)所用菌種增殖、發(fā)酵過(guò)程明顯，因其利用總糖能力強(qiáng)，所以發(fā)酵能力強(qiáng)。邊糖化邊發(fā)酵效果明顯，開(kāi)始階段低濃度還原糖有利于菌體繁殖積累菌體數(shù)量；隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，糖濃度和菌體數(shù)量都增加，有利于菌體的代謝，有利于提高糖的利用率。4.2.2誤差分析本次實(shí)驗(yàn)存在很多小失誤，這些失誤都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了誤差，影響發(fā)酵結(jié)果。（1）試劑重配、經(jīng)驗(yàn)不足實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段試劑原品稱量出錯(cuò)，導(dǎo)致配制試劑濃度過(guò)高。最終雖然找出了問(wèn)題，重配了試劑，但精神和心情都很低落。后續(xù)操作過(guò)程都小心謹(jǐn)慎進(jìn)行。（2）液化酶加入過(guò)量本次液化酶相當(dāng)于放大了10倍加入，液化程度過(guò)量。最終使發(fā)酵液中的葡萄糖發(fā)生復(fù)合反應(yīng)，生成非發(fā)酵性糖，造成葡萄糖浪費(fèi)，甚至?xí)种凭w生長(zhǎng)。這樣使所得糖液中葡萄糖含量低，總糖卻被消耗了。所以滴定及計(jì)算結(jié)果中總糖利用率較高，但菌種可利用的葡萄糖減少，發(fā)酵效率不高，菌種利用總糖能力偏低。（3）測(cè)定初還原糖和初總糖不及時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分工不明確，導(dǎo)致初還原糖樣品遺失。最終測(cè)定的初還原糖樣品為接種發(fā)酵2小時(shí)后的。經(jīng)糖化一段時(shí)間后，發(fā)酵液中還原糖含量增加，菌種處在增殖生長(zhǎng)期，利用還原糖能力低，所以測(cè)得初還原糖含量高。（4）開(kāi)始測(cè)定殘?zhí)侵禃r(shí)發(fā)酵沒(méi)有結(jié)束本次實(shí)驗(yàn)鑒于時(shí)間關(guān)系，最后一次稱重CO2失重等于0.2g，發(fā)酵沒(méi)結(jié)束，相當(dāng)于提前測(cè)定殘?zhí)侵?。所以最終殘還原糖、殘總糖含量都偏高，酒精度低。4.2.3實(shí)驗(yàn)收獲本次木薯酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果還比較理想，所測(cè)得的各數(shù)據(jù)都比較合適，這次實(shí)驗(yàn)比較成功之處在于菌種的培養(yǎng)，中間包括了培養(yǎng)基的配置和菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程涉及到了這幾年所學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作和理論知識(shí)，在突出我們本身不足之處的同時(shí)，也讓我們重溫舊知識(shí)和掌握新知識(shí)。本次實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練，作為小組成員，使我在綜合能力的培養(yǎng)方面有了很大的提高。短短幾天時(shí)間的能力訓(xùn)練，在嘗試、摸索中，小組成員們分工合作，密切配合。在實(shí)驗(yàn)方案修改、實(shí)踐能力方面都有了進(jìn)一步的提高，拓展了我的理論知識(shí)。致謝本次實(shí)驗(yàn)是在趙東玲老師的指導(dǎo)下完成的。非常感謝趙東玲老師在百忙之中抽出寶貴的時(shí)間來(lái)前后指導(dǎo)我們的實(shí)驗(yàn)，無(wú)論實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)多大難題，趙老師總能親臨耐心指導(dǎo)。感謝趙老師給予的指導(dǎo)與建議！趙老師淵博的知識(shí)和對(duì)問(wèn)題的獨(dú)特見(jiàn)解豐富了我的知識(shí)，拓寬了我的視野。感謝黃翠姬老師。整個(gè)實(shí)驗(yàn)是在黃翠姬老師的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的，除了提供我們必要的實(shí)驗(yàn)材料及藥品外，黃老師總是無(wú)微不至的給我們提供建議，實(shí)驗(yàn)儀器使用中有很多需要特別注意的地方也是在黃老師提出下改正的。除此之外，還要感謝實(shí)驗(yàn)中給予我?guī)椭难芯可鷰熜謳熃悖麄儙椭覀冊(cè)趯?shí)驗(yàn)中做一級(jí)接種和測(cè)初總糖，同時(shí)他們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中指導(dǎo)和傳授操作要點(diǎn)和經(jīng)驗(yàn)，為我們提供部分試劑和儀器。還有小組的全體成員，有了他們的幫助和配合，實(shí)驗(yàn)的分工安排和過(guò)程變得更加的順利。參考文獻(xiàn)[1]郭新華，岳延陸，于文燕等.無(wú)機(jī)及分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第四版.北京：高等教育出版社，2006.7:72-74.[2]郭