齊魯細(xì)胞治療CTL細(xì)胞資料及回輸注意事項

齊魯細(xì)胞治療CTL細(xì)胞資料及回輸注意事項CTL(CytotoxicTLymphocyte)ffl介CTL(CytotoxicTLymphocyte)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其表面標(biāo)志是CD8。這些細(xì)胞的功能就像一個"殺手”，它們可以直接攻擊帶有特殊抗原的靶細(xì)胞，在抗病毒感染和抗腫瘤免疫中具有極其重要的用，細(xì)胞毒性T細(xì)胞也被稱為殺手T細(xì)胞。體內(nèi)T細(xì)胞經(jīng)過胸腺的陽性選擇和陰性選擇，分化成CD8+T細(xì)胞，在機(jī)體被感染時，經(jīng)過抗原遞呈細(xì)胞將特異性抗原遞呈給CD8+T而使其激活，發(fā)揮免疫清除、免疫調(diào)節(jié)的作用。體外CTL誘導(dǎo)培養(yǎng)首先抽取患者外周血，分離得到外周血單個核細(xì)胞(PBMC),分別培養(yǎng)DC及T細(xì)胞，DC細(xì)胞可以顯著刺激初始型T細(xì)胞(naiveTcell)增殖。將抗原負(fù)載DC細(xì)胞，抗原致敏誘導(dǎo)成熟的DC細(xì)胞與T細(xì)胞混合培養(yǎng)，通過TCR與抗原肽-MHC分子復(fù)合物結(jié)合提供T細(xì)胞活化的第一信號，DC表面的共刺激分子提供第二信號(見圖1),通過DC細(xì)胞強(qiáng)大的抗原遞呈功能激活初始CD8+T細(xì)胞，激活的CTL細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)，發(fā)揮強(qiáng)大的免疫清除及免疫調(diào)節(jié)作用，殺傷帶有特殊抗原的靶細(xì)胞，達(dá)到治療感染性疾病及腫瘤的目的。圖1CTL的殺傷特點:a.殺傷力強(qiáng)；b.直接、連續(xù)、特異性反復(fù)殺傷靶細(xì)胞，而且在殺傷靶細(xì)胞的過程中本身不受損；c.MHC限制性。CTL的作用機(jī)理CTL對靶細(xì)胞的殺傷過程可以分為三個時相：a.接觸相：CTL通過TCR特異性識別靶細(xì)胞表面的抗原-MHCI類分子復(fù)合物，在粘附分子輔助下與靶細(xì)胞緊密接觸。此過程只需要幾分鐘。b.分泌相：CTL與靶細(xì)胞緊密結(jié)合后，CTL活化并使細(xì)胞顆粒性內(nèi)容物呈現(xiàn)極化分布，隨即啟動胞吐機(jī)制，分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)，作用于靶細(xì)胞，這些毒性物質(zhì)包括穿孔素(perforin\顆粒酶(granzyme\顆粒溶解素(granulysin)及淋巴毒素等。c.裂解相：靶細(xì)胞死亡過程。一是CTL分泌的穿孔素在靶細(xì)胞膜聚合，形成跨膜通道，使靶細(xì)胞膜出現(xiàn)大量的小孔，水分子進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致滲透壓發(fā)生改變，細(xì)胞因滲透性溶解而死亡。顆粒酶經(jīng)穿孔素形成的跨膜通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)激活半胱天冬蛋白M-10(caspase10)，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。顆粒溶解素進(jìn)入靶細(xì)胞，亦可直接殺滅靶細(xì)胞內(nèi)的病原體。二是CTL細(xì)胞通過高表達(dá)的FasL與靶細(xì)胞表面的Fas結(jié)合，經(jīng)Fas/FasL途徑激活半胱天冬蛋白酶-8(caspase8)，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。3CTL與W瘤腫瘤免疫主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫，體液免疫以B細(xì)胞為主，在抗感染中起主要作用。腫瘤免疫主要以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答為主。T細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)主要有兩種基本形式：一是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞裂解作用。二是超敏反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的、以單個核細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)。其中以CTL對腫瘤細(xì)胞的裂解作用最為重要。但患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞通過多種方式逃避CTL對它的殺傷，例如腫瘤細(xì)胞表面低表達(dá)MHC-I類分子，腫瘤細(xì)胞協(xié)同刺激信號異常，腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的FasL而誘導(dǎo)表達(dá)Fas的T細(xì)胞的凋亡等。體外誘導(dǎo)激活的CTL細(xì)胞脫離體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，獲得強(qiáng)大的抗腫瘤活性，回輸至患者體內(nèi)，可以發(fā)揮高效的殺傷活性，清除體內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞，有效治療腫瘤。CTL細(xì)胞治療腫瘤方案O 配合手術(shù)使用術(shù)前采血培養(yǎng)，術(shù)后第7天回輸，提高免疫力，機(jī)體恢復(fù)快，清除殘留腫瘤細(xì)胞和組織，防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。O 配合化療使用化療前采血培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)期間進(jìn)行一次低劑量化療，化療療程結(jié)束后第3-7天回輸（可根據(jù)化療藥物的半衰期調(diào)整，一般化療藥物半衰期過后回輸，免疫細(xì)胞回輸完后，間隔至少7天再進(jìn)行下個療程的化療），提高機(jī)體免疫力，降低藥物毒副作用，進(jìn)一步抑制或殺傷癌細(xì)胞。O 配合放療使用放療前采血，放療療程間歇期回輸（例如，周五放療后給細(xì)胞，周一開始放療），或采血后凍存種子細(xì)胞，待放療療程結(jié)束后回輸免疫細(xì)胞（放療結(jié)束后當(dāng)天即可回輸免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞回輸完后，間隔至少7天再進(jìn)行下個療程的放療），提高機(jī)體免疫力，提高化療敏感性，降低放療毒副作用，進(jìn)一步抑制或殺傷癌細(xì)胞。O 與靶向藥物聯(lián)合使用提前采血，靶向藥物使用后的第2天回輸，利用ADCC效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞。O 單獨使用采血培養(yǎng)，14天左右回輸，首次使用最好連續(xù)回輸兩個周期。O 綜合治療手術(shù)、放化療、微創(chuàng)治療、靶向藥物治療、免疫細(xì)胞治療等治療手段的聯(lián)合治療，首先手術(shù)，然后采用放化療、微創(chuàng)治療、靶向治療等手段降低腫瘤負(fù)荷，腫瘤負(fù)荷降低后回輸免疫細(xì)胞殺傷殘留腫瘤細(xì)胞，起到防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用。治療效果1） 提高患者對放化療的敏感性；2） 清除體內(nèi)的殘留腫瘤細(xì)胞；3） 防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移4） 回輸后可改善機(jī)體免疫環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能；5）改善患者的生活質(zhì)量，延長生存期4CTL與肝炎乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）引起的一種世界性疾病。HBV是一種嗜肝DNA病毒，非直接致細(xì)胞病變，HBV引起的肝損傷是免疫應(yīng)答介導(dǎo)的。HBV的免疫清除對促進(jìn)肝功能恢復(fù)、防止和減少肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生有著最根本的意義。慢性丙型肝炎（CHC）是由丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）引起，嚴(yán)重威脅人類健康，HCV是除了HBV感染引起肝細(xì)胞癌的主要致病因素之一。CHC的治療目前尚無理想藥物，干擾素是目前唯一有效的抗病毒藥物，但是其治療尚難令人滿意，治愈率低且停藥后約一半病例復(fù)發(fā)。近年來研究證明，利用HBV抗原肽刺激急性HBV感染者的外周血單個核細(xì)胞，能夠引起特異性HLA-I類分子限制的CTL應(yīng)答。HCV感染所誘發(fā)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞在清除HCV和控制HCV感染中起重要作用。干擾素聯(lián)合利巴韋林是目前公認(rèn)的治療慢性丙肝的方法，但療效欠滿意，尤其是治療過程中出現(xiàn)的嚴(yán)重副作用，使不少患者無法耐受。用HCV多肽抗原在體外誘導(dǎo)、增殖、活化丙肝患者的單個核細(xì)胞，獲得體外激活的CTL細(xì)胞回輸體內(nèi)后可在體內(nèi)繼續(xù)增殖并聚集在其他靶細(xì)胞部位引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)而清除丙肝病毒的作用。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能殺滅表達(dá)特異性抗原的靶細(xì)胞，在機(jī)體抵抗各類病毒感染禾％或?qū)е旅庖卟±頁p傷中起著極為重要的作用。CTL的殺傷作用是抗原特異性的，初始CD8+T細(xì)胞識別抗原后，進(jìn)行程序性克隆擴(kuò)增并分化為CTL,一方面通過CTL表面表達(dá)的Fas配體和分泌的TNF-a與靶細(xì)胞上的Fas受體（CD95）和TNF受體結(jié)合，誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡；另一方面介導(dǎo)細(xì)胞溶解機(jī)制，成熟CTL胞質(zhì)釋放大量穿孔素（PF）和顆粒酶等，殺傷感染細(xì)胞。此外，活化的CTL還可分泌IFN-y和淋巴毒素等細(xì)胞因子而IFN-y一方面可以直接抑制病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和增殖，另一方面可以激活干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferonregulatorfactor-1,TRF-1）和轉(zhuǎn)錄激活子-1（signaltransducersandactivatorsoftranscription-1，STAT-1）,繼而活化巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生廣譜抗病毒效應(yīng)，清除病毒。目前，CTL細(xì)胞免疫生物療法以其高效的抗病毒能力、穩(wěn)定的療效成為國際多個權(quán)威醫(yī)學(xué)機(jī)構(gòu)共同推薦的慢性丙肝患者治療首選方案，該方案得到了歐洲肝病學(xué)會、美國肝臟病學(xué)會、亞太地區(qū)肝病學(xué)會等多家權(quán)威醫(yī)學(xué)機(jī)構(gòu)的一致認(rèn)可。CTL細(xì)胞生物免疫療肝炎的四大優(yōu)勢（1） 免疫調(diào)節(jié)，減時增效CTL細(xì)胞免疫生物療法以誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，來協(xié)助清除病毒，同時有效調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活性，以達(dá)到有效降低免疫損傷的目的。（2） 綜合治療，兼容性強(qiáng)CTL細(xì)胞免疫生物療法是抗病毒、調(diào)免疫、促恢復(fù)的全方位治療方法，抗乙丙肝病毒作用較單一療法高出5倍以上。此外，CTL細(xì)胞免疫生物療法有很強(qiáng)的兼容性，肝炎患者使用其他治療方法無效時，可改用CTL細(xì)胞免疫生物療法，調(diào)整免疫狀態(tài)，扭轉(zhuǎn)抗病毒進(jìn)程。（3） 特效制劑，一并治療合并癥一般如果丙肝合并肝硬化、脂肪肝、糖尿病、心臟病、膽道感染等，都難以治療。如許多難治性丙肝病人血清鐵較高，肝細(xì)胞內(nèi)含鐵也多，影響療效°CTL細(xì)胞免疫生物療法采用體外導(dǎo)入的特效制劑能夠與過多的鐵進(jìn)行結(jié)合，排出體外，同時還起到免疫調(diào)節(jié)作用。（4） 療效穩(wěn)定，愈不復(fù)發(fā)CTL細(xì)胞免疫生物療法產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子可有效阻斷乙/丙肝病毒的Fas表達(dá)，減少產(chǎn)生膜蛋白分子；同時激活細(xì)胞免疫誘導(dǎo)，二者結(jié)合導(dǎo)致病毒凋亡。CTL細(xì)胞生物免疫療法可聯(lián)合聯(lián)合利巴韋林、免疫促進(jìn)劑一起使用，對干擾素及傳統(tǒng)治療無效的疑難病情可采用聯(lián)合療法，聯(lián)合療法突破傳統(tǒng)干擾素單一治療局限，提高免疫細(xì)胞的活性，不斷增加細(xì)胞濃度，進(jìn)而實現(xiàn)對丙肝病毒的長效抑制和清除，真正實現(xiàn)了對丙肝的標(biāo)本兼治。5CTL細(xì)胞的適應(yīng)征與禁忌征CTL細(xì)胞的適應(yīng)癥a） 各種免疫原性較強(qiáng)的腫瘤，如：肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌、惡性黑色素瘤等；b） 原發(fā)灶去除后（手術(shù)、放療等），免疫力低下，恢復(fù)慢，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。如胃癌術(shù)后、肺癌術(shù)后、肝癌術(shù)后等；c） 腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移，無法進(jìn)行手術(shù)者，可與化療配合使用；d） 對放化療不敏感或者無法耐受的腫瘤患者；e） 常規(guī)治療后（手術(shù)及放化療）需要提高身體免疫力者；f） 腫瘤臨床康復(fù)后的腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)防；g）乙/丙型肝炎患者。患者必須同時符合下列條件h） 生活自理，卡氏體力狀況評分標(biāo)準(zhǔn)60分以上；i） 預(yù)期生存期＞3個月的患者；j） 實驗室檢查必須符合下列條件：淋巴細(xì)胞絕對值〉0.8*109/L，血小板＞50*109/L,血紅蛋白〉70g/L；k） 病人有自知能力，能簽署知情或志愿同意書；l） 通過手術(shù)或其他方式能夠獲得一定數(shù)量的腫瘤組織的患者，可以制備個體特異性的腫瘤抗原。CTL細(xì)胞的禁忌癥a） 臟器移植者；b） T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞白血病，由于本身即是免疫細(xì)胞的病變，所以亦不適用；c） HIV陽性，或者有其他嚴(yán)重的自身免疫性疾病者；d） 不可控制的感染性疾?。籩） 對細(xì)胞培養(yǎng)過程中所用生物制劑過敏者，以及4周內(nèi)大量使用過糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑者；f） 懷孕或哺乳期婦女；g） 肝、腎、心臟等主要器官功能不全者，具體器官標(biāo)準(zhǔn)如下：肝臟：達(dá)到國內(nèi)肝功能分級C級以上腎臟：腎功能衰竭及尿毒癥肺：出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸衰竭癥狀，累及到其他臟器，如肝、腎功能腦：腦轉(zhuǎn)移并伴意識障礙者6采血及注意事項6.1采血前工作6.1.1抽血前檢查1）進(jìn)行患者篩查：包括乙肝、丙肝、艾滋病毒、梅毒等感染。極晚期患者需進(jìn)行血培養(yǎng)檢查，以排除患者患菌血癥。（艾滋病陽性患者不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；菌血癥患者不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)）?；颊咝杼峁┮韵聶z查結(jié)果：a）血常規(guī)（患者未經(jīng)其他治療時，7天內(nèi)有效），此結(jié)果必須提供；b）感染篩查（患者未經(jīng)其他治療時，30天內(nèi)有效），此結(jié)果必須提供；c） 腫瘤標(biāo)志物（患者未經(jīng)其他治療時，30天內(nèi)有效），此結(jié)果建議提供；以進(jìn)行治療評價；d） CT或X光片、B超（患者未經(jīng)其他治療時，30天內(nèi)有效），此結(jié)果建議提供，以進(jìn)行治療評價；e） 病毒拷貝數(shù)檢測（患者未經(jīng)其他治療時，7天內(nèi)有效），對慢性病毒感染患者，此結(jié)果建議提供，以進(jìn)行治療評價；f）血生化全項（患者未經(jīng)其他治療時，7天內(nèi)有效），此結(jié)果建議提供；以進(jìn)行治療評價。2） 檢查患者血常規(guī)，根據(jù)淋巴細(xì)胞比例和淋巴細(xì)胞絕對值決定患者抽血量。抽血量（mL）=（80/淋巴細(xì)胞絕對值）x109（計算取血■超過100mL原則上不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)）注：淋巴細(xì)胞絕對值二人外周血白細(xì)胞數(shù)X人外周血淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)健康人外周血淋巴細(xì)胞絕對值正常范圍：0.8-4X109/L健康人外周血淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)正常范圍：0.2-0.4（20%-40%）健康人外周血白細(xì)胞數(shù)正常范圍：4-10X109/L3） 腫瘤患者抽血前沒有任何感染、發(fā)熱（腫瘤熱除外）以及心、肝、肺、腎功能異常。由醫(yī)生據(jù)患者病情提出CTL細(xì)胞治療并填寫患者信息表，患者簽署知情同意書。6.1.3醫(yī)生提供其它治療安排a） 目前無其它治療；b） 手術(shù)時間安排；c） 化療時間安排；d） 放療時間安排；e） 靶向治療時間安排；f） 抗病毒治療時間安排。6.1.4采血時間的確認(rèn)醫(yī)生結(jié)合實驗室檢查結(jié)果和臨床安排確認(rèn)采血時間并通知業(yè)務(wù)人員（最好根據(jù)手術(shù)、放化療的療程同時制定好回輸計劃及采血時間。主管醫(yī)生收到患者繳費相應(yīng)單據(jù)后安排人員進(jìn)行采血操作。6.1.6病人采血前注意事項a） 盡量空腹抽血，若抽血時間較晚也可適當(dāng)進(jìn)食，但勿食用油膩食物或進(jìn)食過量，且最好在進(jìn)食2-3小時后抽血；b） 抽血前不能輸液；c） 手術(shù)病人應(yīng)術(shù)前取血;化療病人應(yīng)在化療療程開始前取血或化療后血象恢復(fù)正常后取血；放療病人應(yīng)在放療療程開始前取血或放療后血象恢復(fù)正常后取血；d） 連續(xù)兩個療程治療時，取血和回輸細(xì)胞在時間上會有交叉，取血必須在細(xì)胞回輸之前。6.2采血用具的準(zhǔn)備6.2.1細(xì)胞制備中心提供材料：一次性使用真空采血針組件（BloodCollectionSet）；肝素抗凝管；采血袋。6.2.2臨床科室自備材料：棉簽、碘伏、膠帶和止血帶。6.2.3采血見附件中《采血操作規(guī)程》。7回輸及注意事項7.1回輸日期的通知和確認(rèn)7.1.1業(yè)務(wù)員在采血后一周內(nèi)以E-MAIL形式通知主管醫(yī)生下周回輸安排，并以電話、短信形式提醒醫(yī)生查看E-MAIL。7.1.2確定本次回輸不受其他治療因素，尤其是患者感染、發(fā)燒、放療、化療、轉(zhuǎn)院、出院等的影響。如果因為患者自身或其他原因，需要改變回輸時間，一般只能上下浮動1-2天。7.1.3細(xì)胞制備中心如發(fā)現(xiàn)因細(xì)胞增長原因，培養(yǎng)時間需要延長，將及時告知主管醫(yī)生。CTL細(xì)胞的包裝和質(zhì)量檢驗單7.2.1標(biāo)準(zhǔn)回輸袋100mLCTL細(xì)胞懸液，細(xì)胞回輸袋外標(biāo)注有患者姓名、細(xì)胞編號、患者所在醫(yī)院、產(chǎn)品出庫時間：即當(dāng)天日期的標(biāo)簽。7.2.2接收產(chǎn)品者還應(yīng)同時獲得產(chǎn)品驗收單，包括：a） 細(xì)胞質(zhì)量報告單（包括微生物檢測、內(nèi)毒素檢測和產(chǎn)品細(xì)胞數(shù)量，并有報告人和審核人姓名，同時加蓋質(zhì)檢章）；b） 細(xì)胞回輸簽收單。CTL細(xì)胞的運(yùn)輸7.3.1細(xì)胞儲存于細(xì)胞運(yùn)輸箱，箱內(nèi)放冰袋，保持箱內(nèi)溫度在10-20度，通過專人運(yùn)輸或快遞的方式送至醫(yī)生指定地點。7.3.2由主管醫(yī)生或護(hù)士a）簽收產(chǎn)品和產(chǎn)品質(zhì)量報告；b）在CTL細(xì)胞回輸簽收單上簽名。CTL細(xì)胞回輸7.4.1所需物品：a） 生理鹽水、治療盤及相關(guān)物品（由醫(yī)院提供；b） 輸血器、7號或更大號套針管（由公司提供X7.4.2操作人員：醫(yī)院相關(guān)醫(yī)務(wù)人員7.4.3回輸前首先核對CTL細(xì)胞袋標(biāo)簽姓名與患者姓名是否一致7.4.4回輸方法：a）連接100mL生理鹽水與輸血器，將輸血器原裝所帶大號針頭換成套管針并排氣；b）將針頭與病人血管連接固定，觀察生理鹽水點滴情況；c）預(yù)處理：一般不需任何預(yù)處理，但若患者為過敏體質(zhì)或其它情況需根據(jù)醫(yī)囑加入相應(yīng)處理，比如回輸前提前15分鐘肌肉注射非那根25mg；d）如果生理鹽水點滴通順，換上細(xì)胞轉(zhuǎn)輸袋，調(diào)節(jié)速度為30-40滴/分；e）一般病人觀察10分鐘后如沒有特殊反應(yīng)，將滴速改為60-80滴/分，直至輸完；若患者有心血管方面疾病應(yīng)按醫(yī)囑控制滴速?；剌斶^程中可叮囑家屬或護(hù)士每隔5-10分鐘輕輕擠壓轉(zhuǎn)輸袋底部，使沉淀細(xì)胞重新懸??；f） 細(xì)胞回輸完畢后將輸血器連接上剩余的生理鹽水，沖洗輸血器內(nèi)剩余的細(xì)胞；g） 管內(nèi)細(xì)胞沖洗干凈后回輸完成。7.4.5回輸時要保持室內(nèi)環(huán)境空氣流通，注意保暖。在細(xì)胞回輸后的48小時內(nèi)，患者要保持休息狀態(tài)，放松情緒，保證足夠的睡眠，不宜做劇烈運(yùn)動，不要長途奔波勞累；8其他注意事項8.1知情同意書書面證明患者本人或家屬已了解CTL細(xì)胞治療的情況并同意接受治療，由醫(yī)院保留。8.2回輸方案的制定單獨使用CTL細(xì)胞時，一般在采血后第14天開始第一次回輸，具體回輸計劃在采血后7天內(nèi)告知主管醫(yī)生；如CTL細(xì)胞配合手術(shù)、放化療使用，需要醫(yī)生提供手術(shù)、放化療