層析技術(shù)講義

層析技術(shù)講義層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄國植物學(xué)家M.Tswett首先系統(tǒng)提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，并繼續(xù)以石油醚淋洗，由于CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶或稱色譜圖（Chromatogram）。

當(dāng)時這種方法并沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應(yīng)用到分離復(fù)雜的有機(jī)混合物，人們才發(fā)現(xiàn)了它的廣泛用途。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實踐的需要，層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。為此作出重要貢獻(xiàn)的當(dāng)推英國生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數(shù)基礎(chǔ)上模擬蒸餾理論，以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據(jù)液－液逆流萃取的原理，發(fā)明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠(yuǎn)見卓識的預(yù)言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細(xì)的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數(shù))，這將會大大提高分離效率。前者預(yù)見了氣相色譜的產(chǎn)生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發(fā)性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革；后者預(yù)見了高效液相色譜（HPLC）的產(chǎn)生，在60年代末也為人們所實現(xiàn)，現(xiàn)在HPLC已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的分析分離工具之一。因此,Martin和Synge于1952年被授予諾貝爾化學(xué)獎。如今的色層分析法經(jīng)常用于分離無色的物質(zhì)，已沒有顏色這個特殊的含義。但色譜法或色層分析法這個名字仍保留下來沿用?，F(xiàn)在我們簡稱為層析法或?qū)游黾夹g(shù)。

層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質(zhì)極相類似的物質(zhì)。而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上。現(xiàn)在，它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用。

一、層析的基本理論

層析法是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們在某種基質(zhì)中移動速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達(dá)到彼此分離的目的。

對于一個層析柱來說，可作如下基本假設(shè)：

1.層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個理論塔板。塔板一部分為固定相占據(jù)，一部分為流動相占據(jù)，且各塔板的流動相體積相等，稱為板體積，以Vm表示。

2.每個塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動相之間瞬間達(dá)到平衡，且忽略分子縱向擴(kuò)散。

3.溶質(zhì)在各塔板上的分配系數(shù)是一常數(shù)，與溶質(zhì)在塔板的量無關(guān)。

4.流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程（即不連續(xù)過程）。從一個塔板到另一個塔板流動相體積為Vm。當(dāng)流過層析柱的流動相的體積為V時，則流動相在每個塔板上跳越的次數(shù)為n:

n=

5.溶質(zhì)開始加在層析柱的第零塔板上。根據(jù)以上假定，將連續(xù)的層析過程分解成了間歇的動作，這與多次萃取過程相似，一個理論塔板相當(dāng)于一個兩相平衡的小單元。

3.1.3層析的基本概念

1.固定相：

固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關(guān)鍵的作用。

2.流動相：

在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。

3.分配系數(shù)及遷移率（或比移值）：

分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值，常用K來表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。

K=Cs/Cm

其中Cs:固定相中的濃度，Cm:流動相中的濃度。

遷移率（或比移值）是指：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。

實驗中我們還常用相對遷移率的概念。相對遷移率是指：在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx來表示。不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的。分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。

分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。對于溫度的影響有下列關(guān)系式：

lnK=G0/RT)

－(

式中：K為分配系數(shù)（或平衡常數(shù)）

G0為標(biāo)準(zhǔn)自由能變化

R為氣體常數(shù)

T為絕對溫度

C,G0為負(fù)值，則溫度與分配系數(shù)成反比關(guān)系。通常溫度上升20

這是層析分離的熱力學(xué)基礎(chǔ)。一般情況下，層析時組分的K值下降一半，它將導(dǎo)致組分移動速率增加。這也是為什么在層析時最好采用恒溫柱的原因。有時對于K值相近的不同物質(zhì)，可通過改變溫度的方法，增大K值之間的差異，達(dá)到分離的目的。

4.分辨率（或分離度）

分辨率一般定義為：相鄰兩個峰的分開程度。用Rs來表示。Rs值越大，兩種組分分離的越好。當(dāng)Rs=1時，兩組分具有教好的分離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當(dāng)Rs=1.5時，兩組分基本完全分開，每種組分的純度可達(dá)到99.8%。如果兩種組分的濃度相差較大時，尤其要求較高的分辨率。

為了提高分辨率Rs的值，可采用以下方法：

⑴使理論塔板數(shù)N增大，則Rs上升。

①增加柱長，N可增大，可提高分離度，但它造成分離的時間加長，洗脫液體積增大，并使洗脫峰加寬，因此不是一種特別好的辦法。

②m以下，且壓力可達(dá)150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分離的效率大大提高了。m；而HPLC柱子的固定相顆粒為10減小理論塔板的高度。如減小固定相顆粒的尺寸，并加大流動相的壓力。高效液相色譜(HPLC)就是這一理論的實際應(yīng)用。一般液相層析的固定相顆粒為100

③采用適當(dāng)?shù)牧魉伲部墒估碚撍宓母叨冉档?，增大理論塔板?shù)。太高或太低的流速都是不可取的。對于一個層析柱，它有一個最佳的流速。特別是對于氣相色譜，流速影響相當(dāng)大。

⑵改變?nèi)萘恳蜃覦（固定相與流動相中溶質(zhì)量的分布比）。一般是加大D，但D的數(shù)值通常不超過10，再大對提高Rs不明顯，反而使洗脫的時間延長，譜帶加寬。一般D限制在1D10，最佳范圍在1.5-5之間。我們可以通過改變柱溫（一般降低溫度），改變流動相的性質(zhì)及組成（如改變pH值，離子強(qiáng)度，鹽濃度，有機(jī)溶劑比例等），或改變固定相體積與流動相體積之比（如用細(xì)顆粒固定相，填充的緊密與均勻些），提高D值，使分離度增大。

（分離因子，也稱選擇性因子，是兩組分容量因子D之比），使Rs變大。實際上，使⑶增大增大，就是使兩種組分的分配系數(shù)差值增大。同樣，我們可以通過改變固定相的性質(zhì)、組成，改變流動相的性質(zhì)、組成，或者改變層析的溫度，使發(fā)生改變。應(yīng)當(dāng)指出的是，溫度對分辨率的影響，是對分離因子與理論塔板高度的綜合效應(yīng)。因為溫度升高，理論塔板高度有時會降低，有時會升高，這要根據(jù)實際情況去選擇。通常，的變化對Rs影響最明顯。

總之，影響分離度或者說分離效率的因素是多方面的。我們應(yīng)當(dāng)根據(jù)實際情況綜合考慮，特別是對于生物大分子，我們還必須考慮它的穩(wěn)定性，活性等問題。如pH值、溫度等都會產(chǎn)生較大的影響，這是生化分離絕不能忽視的。否則，我們將不能得到預(yù)期的效果。

5.正相色譜與反相色譜

正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。

反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。

一般來說，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機(jī)分子（有機(jī)酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。

6.操作容量（或交換容量）

在一定條件下，某種組分與基質(zhì)（固定相）反應(yīng)達(dá)到平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量，我們稱為操作容量（或交換容量）。它的單位是毫摩爾（或毫克）/克（基質(zhì)）或毫摩爾（或毫克）/毫升（基質(zhì)），數(shù)值越大，表明基質(zhì)對該物質(zhì)的親合力越強(qiáng)。應(yīng)當(dāng)注意，同一種基質(zhì)對不同種類分子的操作容量是不相同的，這主要是由于分子大?。臻g效應(yīng)）、帶電荷的多少、溶劑的性質(zhì)等多種因素的影響。因此，實際操作時，加入的樣品量要盡量少些，特別是生物大分子，樣品的加入量更要進(jìn)行控制，否則用層析辦法不能得到有效的分離。

3.1.4層析法的分類

層析根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多種類型:

1.根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。薄層層析是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析。柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。

2.根據(jù)流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要氣化，大大限制了其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。

3.根據(jù)分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。

吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。

分配層析是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。

凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。

親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高分辨率。

3.1.5柱層析的基本裝置及基本操作

目前，最常用的層析類型是各種柱層析，下面就簡述柱層析的基本裝置及操作方法，薄層層析的裝置和操作將在后面詳細(xì)討論。

1.柱層析的基本裝置

2.柱層析的基本操作

柱層析的基本操作包括以下一些步驟：

⑴裝柱

柱子裝的質(zhì)量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。

首先選好柱子，根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時將柱子洗滌干凈。

將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當(dāng)濃度的酸（0.5N~1N）、堿（0.5N~1N）、鹽（0.5M~1M）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡。

關(guān)閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。

打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據(jù)分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。

最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2~3cm高的緩沖液，同時關(guān)閉出水口。（采用機(jī)械化裝柱法在此省略。）

⑵平衡

柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時柱子平衡好后，還要進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。這方面的內(nèi)容在離子交換層析中加以介紹。

⑶加樣

加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量，體積應(yīng)低于5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當(dāng)然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗后才能決定。

應(yīng)注意的是，加樣時應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保持基質(zhì)表面平坦。詳細(xì)操作見層析實驗。

⑷洗脫

當(dāng)我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。

簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時間間隔（或洗脫體積間隔）也不長，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應(yīng)采用下面的方法。

分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。

梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等。最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強(qiáng)度梯度。可形成梯度的形式有三種。

洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當(dāng)對所分離的混合物的性質(zhì)了解較少時，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時間較長，但對性質(zhì)相近的組分分離更為有利。同時還應(yīng)注意洗脫時的速率。前面我們已經(jīng)談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質(zhì)的擴(kuò)散，同樣達(dá)不到理想的分離效果。只有多次試驗才會得到合適的流速。總之，我們必須經(jīng)過反復(fù)的試驗與調(diào)整（可以用正交試驗或優(yōu)選法），才能得到最佳的洗脫條件。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點是，在整個洗脫過程中，千萬不能干柱，否則分離純化將會前功盡棄。

⑸收集、鑒定及保存

在生化實驗中，基本上我們都是采用部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml/管。如果分離的物質(zhì)性質(zhì)很相近，可低至0.5ml/管。這視具體情況而定。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進(jìn)行鑒定。對于是單條帶的，認(rèn)為已達(dá)電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對于不同種類的物質(zhì)采用相應(yīng)的鑒定方法，在這里不再敘述。最后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

⑹基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）的再生

許多基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）可以反復(fù)使用多次，而且價格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用，嚴(yán)禁亂倒亂扔。這也是一個科研工作者的科學(xué)作風(fēng)問題。各種基質(zhì)的再生方法可參閱具體層析實驗及有關(guān)文獻(xiàn)。3.2凝膠層析

3.2.1簡介

凝膠層析（gelchromatography）又稱為凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）、分子篩層析（molecularsievechromatography）、凝膠過濾（gelfiltration）、凝膠滲透層析（gelpermeationchromatography）等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個組分的液相色譜方法。1959年，Porath和Flodin首次用一種多孔聚合物－交聯(lián)葡聚糖凝膠作為柱填料，分離水溶液中不同分子量的樣品，稱為凝膠過濾。1964年，Moore制備了具有不同孔徑的交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，能夠進(jìn)行有機(jī)溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析（流動相為有機(jī)溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析）。隨后這一技術(shù)得到不斷的完善和發(fā)展，目前廣泛的應(yīng)用于生物化學(xué)、高分子化學(xué)等很多領(lǐng)域。

凝膠層析是生物化學(xué)中一種常用的分離手段，它具有設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點，因此廣泛用于蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。

3.2.2凝膠層析的基本原理

凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經(jīng)歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。

1.外水體積、內(nèi)水體積、基質(zhì)體積、柱床體積、洗脫體積

外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積?；|(zhì)體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。而柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們設(shè)柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質(zhì)體積為Vg，則有：

Vt＝Vo＋Vi＋Vg

由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：

Vt＝Vo＋Vi

設(shè)洗脫體積為Ve，Ve一般是介于Vo和Vt之間的。對于完全排阻的大分子，由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動相中，故其洗脫體積Ve＝Vo；對于完全滲透的小分子，由于它可以存在于凝膠柱整個體積內(nèi)（忽略凝膠本身體積Vg），故其洗脫體積Ve＝Vt。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。有時可能會出現(xiàn)VeVt，這是由于這種分子與凝膠有吸附作用造成的。

柱床體積Vt可以通過加入一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測量水的體積來測定。外水體積Vo可以通過測定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來測定，一般常用藍(lán)色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質(zhì)。因為它的分子量大（為200萬），在各種型號的凝膠中都被排阻，并且它呈藍(lán)色，易于觀察和檢測。

2.分配系數(shù)

分配系數(shù)是指某個組分在固定相和流動相中的濃度比。對于凝膠層析，分配系數(shù)實質(zhì)上表示某個組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。

3.排阻極限

排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如SephadexG-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。

4.分級分離范圍

分級分離范圍表示一種凝膠適用的分離范圍，對于分子量在這個范圍內(nèi)的分子，用這種凝膠可以得到較好的線性分離。例如SephadexG-75對球形蛋白的分級分離范圍為3,000－70,000，它表示分子量在這個范圍內(nèi)的球形蛋白可以通過SephadexG-75得到較好的分離。應(yīng)注意，對于同一型號的凝膠，球形蛋白與線形蛋白的分級分離范圍是不同的。

5.吸水率和床體積

吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。而床體積是指1g干的凝膠吸水后的最終體積。

6.凝膠顆粒大小

層析用的凝膠一般都成球形，顆粒的大小通常以目數(shù)（mesh）或者顆粒直徑（m）來表示。柱子的分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關(guān)。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢。一般比較常用的是100－200目。

3.2.4凝膠的種類和性質(zhì)

凝膠的種類很多，常用的凝膠主要有葡聚糖凝膠（dextran）、聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide）、瓊脂糖凝膠（agarose）以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯(lián)物。另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等等。下面將分別介紹。

1.葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠是指由天然高分子－葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。葡聚糖凝膠主要由PharmaciaBiotech生產(chǎn)。常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex和Sephacryl。

葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex系列，它是葡聚糖與3－氯－1,2環(huán)氧丙烷（交聯(lián)劑）相互交聯(lián)而成，交聯(lián)度由環(huán)氧氯丙烷的百分比控制。SephadexG-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率（單位是ml/g干膠）乘以10。如Sephadex的主要型號是G-10105。Sephadex在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機(jī)溶液中都是比較穩(wěn)定的，可以多次重復(fù)使用。Sephadex穩(wěn)定工作的pH一般為為2－10。強(qiáng)酸溶液和氧化劑會使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex與強(qiáng)酸和氧化劑接觸。Sephadex在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在100G-50，表示吸水率是5ml/g干膠。Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的Sephadex的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。Sephadex中排阻極限最大的G-200為6C下40min對凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒有明顯的影響。Sephadex由于含有羥基基團(tuán)，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(tuán)（尤其是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。但一般在離子強(qiáng)度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。所以在用Sephadex進(jìn)行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex與蛋白發(fā)生吸附，但應(yīng)注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積發(fā)生較大的變化。Sephadex有各種顆粒大?。ㄒ话阌写帧⒅?、細(xì)、超細(xì)）可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差；細(xì)顆粒流速慢，但分辨率高。要根據(jù)分離要求來選擇顆粒大小。Sephadex的機(jī)械穩(wěn)定性相對較差，它不耐壓，分辨率高的細(xì)顆粒要求流速較慢，所以不能實現(xiàn)快速而高效的分離。

另外，SephadexG-25和G-50中分別加入羥丙基基團(tuán)反應(yīng)，形成LH型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號為SephadexLH-20和LH-60，適用于以有機(jī)溶劑為流動相，分離脂溶性物質(zhì)，例如膽固醇、脂肪酸激素等。

Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide）交聯(lián)而成。是一種比較新型的葡聚糖凝膠。Sephacryl的優(yōu)點就是它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達(dá)到108，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sephadex的范圍。所以它不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質(zhì)粒、甚至較大的病毒顆粒。Sephacryl與Sephadex相比另一個優(yōu)點就是它的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性更高：Sephacryl在各種溶劑中很少發(fā)生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫，Sephacryl穩(wěn)定工作的pH一般為

3~11。另外Sephacryl的機(jī)械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，分辨率也較高，所以Sephacryl相比Sephadex可以實現(xiàn)相對比較快速而且較高分辨率的分離。

2.聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺（acrylamide）與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。聚丙烯酰胺凝膠主要由Bio-RadBio-GelLaboratories生產(chǎn)，商品名為Bio-GelP，主要型號有Bio-GelP-2P-300等10種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限的10-3，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。各種型號的主要參數(shù)如附表所示。聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻極限最大的Bio-Gel105。聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機(jī)溶液、鹽溶液中都比較穩(wěn)定。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性較好，在pH為1~10之間比較穩(wěn)定。但在較強(qiáng)的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰胺凝膠易發(fā)生分解。聚丙烯酰胺凝膠非常親水，基本不帶電荷，所以吸附效應(yīng)較小。另外，聚丙烯酰胺凝膠不會象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長微生物。聚丙烯酰胺凝膠對芳香族、酸性、堿性化合物可能略有吸附作用，使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液就可以避免。P-300為4

3.瓊脂糖凝膠

瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。瓊脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脫水半乳糖（anhydrogalactose）交替構(gòu)成的多糖鏈。它在100C時呈液態(tài)，當(dāng)溫度降至45C以下時，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見的主要有Pharmacia4B）和Bio-RadLaboratories生產(chǎn)的Bio-gelBiotech生產(chǎn)的Sepharose（2BA等。關(guān)于各種瓊脂糖凝膠的基本參數(shù)如附表所示。瓊脂糖凝膠在pH為4－9之間是穩(wěn)定的，它在室溫下很穩(wěn)定，穩(wěn)定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠對樣品的吸附作用很小。另外瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和孔穴的穩(wěn)定性都很好，一般好于前兩種凝膠，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會發(fā)生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時洗脫速度可以比較快。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以0－30C為宜。

Sepharose與2,3二溴丙醇反應(yīng)，形成SepharoseCL型凝膠（CL-2BCL-4B），它們的分離特性基本沒有改變，但熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都有所提高，可以在更廣泛的pH范圍內(nèi)應(yīng)用，穩(wěn)定工作的pH范圍為3－13。SepharoseCL型凝膠還特別適合于含有有機(jī)溶劑的分離。

4.聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠

這類凝膠是由交聯(lián)的聚丙烯酰胺和嵌入凝膠內(nèi)部的瓊脂糖組成。它們主要由LKB提供，商品名為Ultragel。這種凝膠由于含有聚丙烯酰胺，所以有較高分辨率；而它又含有瓊脂糖，這使得它又有較高的機(jī)械穩(wěn)定性，可以使用較高的洗脫速度。調(diào)整聚丙烯酰胺和瓊脂糖的濃度可以使Ultragel有不同的分離范圍，

5.多孔硅膠、多孔玻璃珠

104塔板多孔硅膠和多孔玻璃珠都屬于無機(jī)凝膠。顧名思義，它們就是將硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)的球形顆粒。這類凝膠屬于硬質(zhì)無機(jī)凝膠，它們的最大的特點是機(jī)械強(qiáng)度很高、化學(xué)穩(wěn)定性好，使用方便而且壽命長，無機(jī)膠一般柱效較低，但用微粒的多孔硅膠制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以達(dá)到4/106。它們的最大缺點是吸附效應(yīng)較強(qiáng)（尤其是多孔硅膠），可能會吸附比較多的蛋白，但可以通過表面處理和選擇洗脫液來降低吸附。另外它們也不能用于強(qiáng)堿性溶液，一般使用時pH應(yīng)小于8.5。103－9106，多孔玻璃珠一般為3米。多孔玻璃珠易破碎，不能填裝緊密，所以柱效相對較低。多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬，多孔硅膠一般為102－5

另外值得一提的是各類凝膠技術(shù)近年來發(fā)展得很快，目前已研制出很多性能優(yōu)越的新型凝膠。例如PharmaciaBiotech的Superdex和Superrose，Superdex的分辨率非常高，化學(xué)物理穩(wěn)定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析；而Superose的分離范圍很廣，分辨率較高，可以一次性的分離分子量差異較大的混合物。同時它的機(jī)械穩(wěn)定性也很好。關(guān)于各種凝膠產(chǎn)品的詳細(xì)情況可以參閱本書附錄以及各個公司的產(chǎn)品目錄。

3.2.5凝膠的選擇、處理和保存

1.凝膠的選擇

通過前面的介紹可以看到凝膠的種類、型號很多。不同類型的凝膠在性質(zhì)以及分離范圍上都有較大的差別，所以在進(jìn)行凝膠層析實驗時要根據(jù)樣品的性質(zhì)以及分離的要求選擇合適的凝膠，這是影響凝膠層析效果好壞的一個關(guān)鍵因素。

一般來講，選擇凝膠首先要根據(jù)樣品的情況確定一個合適的分離范圍，根據(jù)分離范圍來選擇合適型號的凝膠。一般的凝膠層析實驗可以分為兩類：分組分離（groupseparations）和分級分離（fractionations），分組分離是指將樣品混合物按分子量大小分成兩組，一組分子量較大，另一組分子量較小。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等。分級分離則是指將一組分子量比較接近的組分分開。在分組分離時要選擇能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，這樣分離效果好。一般常用排阻極限較小的凝膠類型。分級分離時則要根據(jù)樣品組分的具體情況來選擇凝膠的類型，凝膠的分離范圍一方面應(yīng)包括所要的各個組分的分子量，另一方面要合適，不能過大。如果分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離；如分離范圍選擇過大，則分辨率較低，分離效果也不好。

選擇凝膠另外一個方面就是凝膠顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對流速慢，實驗時間長，有時會造成擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重；顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當(dāng)也可以得到滿意的結(jié)果。選擇時要依據(jù)分離的具體情況而定，例如樣品中各個組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的；如果有個別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。由于凝膠一般都比較穩(wěn)定，所以它在一般的實驗條件下都可以正常的工作。如果實驗條件比較特殊，如在較強(qiáng)的酸堿中進(jìn)行或含有有機(jī)溶劑等等，則要仔細(xì)查看凝膠的工作參數(shù)，選擇合適的類型的凝膠。

2.凝膠的處理

凝膠使用前要首先要進(jìn)行處理。選擇好凝膠的類型后，首先要根據(jù)選擇的層析柱估算出凝膠的用量。由于市售的葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠通常是無水的干膠，所以要計算干膠用量：干膠用量（g）＝柱床體積（ml）/凝膠的床體積（ml/g）。由于凝膠處理過程以及實驗過程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計算的基礎(chǔ)上再增加10％－20％。

葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠干膠的處理首先是在水中膨化，不同類型的凝膠所需的膨化時間不同。一般吸水率較小的凝膠（即型號較小、排阻極限較小的凝膠）膨化時間較短，在20C條件下需十幾個到幾十個小時，如SephadexC條件下需3－4小時；但吸水率較大的凝膠（即型號較大、排阻極限較大的凝膠）膨化時間則較長，20G-100以上的干膠膨化時間都要在72小時以上。如果加熱煮沸，則膨化時間會大大縮短，一般在1－5小時即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但應(yīng)注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態(tài)，所以不需膨化處理。另外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。

膨化處理后，要對凝膠進(jìn)行純化和排除氣泡。純化可以反復(fù)漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的細(xì)小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時間，再用水洗至中性。排除凝膠中的氣泡是很重要的，否則會影響分離效果，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。

3.凝膠的保存

凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦ǔ＜尤?.02％的疊氮化鈉，4C下保存。如果要較長時間的保存，則要將凝膠洗滌后脫水、干燥，可以將凝膠過濾抽干后浸泡在50％的乙醇中脫水，抽干后再逐步提高乙醇濃度反復(fù)浸泡脫水，至95％乙醇脫水后將凝膠抽干。置于603.3離子交換層析

3.3.1簡介

離子交換層析（IonExchangeChromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。

3.3.2基本原理

離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價結(jié)合，形成一個帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。離子交換反應(yīng)可以表示為：

+Y)AX(R+A)YX陽離子交換反應(yīng)：(R

(+A)YX

陰離子交換反應(yīng)：(R+Y)AXR

和X

其中R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)，X和A分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，A和Y分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結(jié)合的電荷基團(tuán)，Y分別代表溶液中的離子基團(tuán)。

從上面的反應(yīng)式中可以看出，如果A離子與離子交換劑的結(jié)合力強(qiáng)于Y離子，或者提高A離子的濃度，或者通過改變其它一些條件，可以使A離子將Y離子從離子交換劑上置換出來。也就是說，在一定條件下，溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上，而平衡離子則進(jìn)入流動相，這就是離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程。

陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負(fù)電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后，負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，而將各種負(fù)電基團(tuán)置換出來，隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的負(fù)電基團(tuán)先被置換出來，而與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置換出來，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達(dá)到分離目的。

各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個可逆的過程。結(jié)合的強(qiáng)度與很多因素有關(guān)，包括離子交換劑的性質(zhì)、離子本身的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過改變離子強(qiáng)度、pH等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的目的。離子交換劑的電荷基團(tuán)對不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來講，離子價數(shù)越高，結(jié)合力越大；價數(shù)相同時，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。如陽離子交換劑對離子的結(jié)合力順序為：Li<Na<K<Rb<；NaCs<Ca2<Al3<Ti4。蛋白質(zhì)等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結(jié)合與它們的性質(zhì)及pH有較大關(guān)系。以用陽離子交換劑分離蛋白質(zhì)為例，在一定的pH條件下，等電點pI<pH的蛋白帶負(fù)電，不能與陽離子交換劑結(jié)合；等電點pI>pH的蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結(jié)合，一般pI越大的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。但由于生物樣品的復(fù)雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合情況較難估計，往往要通過實驗進(jìn)行摸索。

3.3.3離子交換劑的種類和性質(zhì)

1.離子交換劑的基質(zhì)

離子交換劑的大分子聚合物基質(zhì)可以由多種材料制成，聚苯乙烯離子交換劑（又稱為聚苯乙烯樹脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯為基質(zhì)。聚苯乙烯離子交換劑機(jī)械強(qiáng)度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強(qiáng)的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素（Cellulose）、球狀纖維素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose）為基質(zhì)的離子交換劑都與水有較強(qiáng)的親和力，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，葡聚糖離子交換劑一般以SephadexG－25和G－50為基質(zhì)，瓊脂糖離子交換劑一般以SepharoseCL－6B為基質(zhì)。關(guān)于這些離子交換劑的性質(zhì)可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹。

2.離子交換劑的電荷基團(tuán)

根據(jù)與基質(zhì)共價結(jié)合的電荷基團(tuán)的性質(zhì)，可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。

OHPO2H）為中等酸型離子交換劑，結(jié)合酚羥基（PO3H2）和亞磷酸基團(tuán)（SO3H），如磺酸甲基（簡寫為SM）、磺酸乙基（SE）等為強(qiáng)酸型離子交換劑，結(jié)合磷酸基團(tuán)（陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，可以交換陽離子物質(zhì)。根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，又可以分為強(qiáng)酸型、中等酸型和弱酸型三類。它們的區(qū)別在于它們電荷基團(tuán)完全解離的pH范圍，強(qiáng)酸型離子交換劑在較大的pH范圍內(nèi)電荷基團(tuán)完全解離，而弱酸型完全解離的pH范圍則較小，如羧甲基在pH小于6時就失去了交換能力。一般結(jié)合磺酸基團(tuán)（COOH），如羧甲基（CM）為弱酸型離子交換劑。一般來講強(qiáng)酸型離子交換劑對H離子的結(jié)合力比Na+離子小，弱酸型離子交換劑對H離子的結(jié)合力比Na+離子大。）或羧基（

離子大。離子的結(jié)合力比Cl離子小，弱酸型離子交換劑對OH離子的結(jié)合力比ClNHCH3）、伯胺（-NH2）等為中等或弱堿型離子交換劑，如結(jié)合二乙基氨基乙基（DEAE）為弱堿型離子交換劑。一般來講強(qiáng)堿型離子交換劑對OHN(CH3)2）、仲胺（N(CH3)3），如季胺乙基（QAE）為強(qiáng)堿型離子交換劑，結(jié)合叔胺（陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，可以交換陰離子物質(zhì)。同樣根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，可以分為強(qiáng)堿型、中等堿型和弱堿型三類。一般結(jié)合季胺基團(tuán)（

3.交換容量

交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。在實際實驗中關(guān)心的是層析柱與樣品中各個待分離組分進(jìn)行交換時的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關(guān)，還與實驗條件有很大的關(guān)系，一般又稱為有效交換容量。后面提到的交換容量如未經(jīng)說明都是指有效交換容量。

影響交換容量的因素很多，主要可以分為兩個方面，一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進(jìn)行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當(dāng)然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量能夠讓樣品組分進(jìn)入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因為小分子可以自由的進(jìn)入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。對于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因為對于很大的分子，一般不能進(jìn)入孔隙內(nèi)部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑表面積大。

另一些影響因素如實驗中的離子強(qiáng)度、pH值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般pH對弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對于弱酸型離子交換劑在pH較高時，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH時，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量小。同時pH也影響樣品組分的帶電性。尤其對于蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在離子交換層析中要選擇合適的pH以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結(jié)合。一般來說，離子強(qiáng)度增大，交換容量下降。實驗中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要降低交換容量以將結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。

離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)（meq/mg或meq/充分置換出來，再用酸滴定，計算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測定。，再用標(biāo)準(zhǔn)濃度的NaOH滴定生成的HCl，就可以計算出離子交換劑的交換容量；對于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H。再用水洗至中性，對于強(qiáng)酸型離子交換劑，用NaCl充分置換出Hml）來表示。通?？梢杂傻味ǚy定。陽離子交換劑首先用HCl處理，使其平衡離子為H

對于一些常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質(zhì)的量來表示，一般這種表示方法對于分離蛋白質(zhì)等生物大分子具有更大的參考價值。實驗前可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。

3.3.4離子交換劑的選擇、處理和保存

1.離子交換劑的選擇

離子交換劑的種類很多，離子交換層析要取得較好的效果首先要選擇合適的離子交換劑。

首先是對離子交換劑電荷基團(tuán)的選擇，確定是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑。這要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4，穩(wěn)定的pH范圍為6－9，由于這時蛋白帶負(fù)電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進(jìn)行分離。強(qiáng)酸或強(qiáng)堿型離子交換劑適用的pH范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH下的分離。由于弱酸型或弱堿型離子交換劑不易使蛋白質(zhì)失活，故一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。

其次是對離子交換劑基質(zhì)的選擇。前面已經(jīng)介紹了，聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強(qiáng)的離子交換劑一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強(qiáng)，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。一般纖維素離子交換劑價格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和pH變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機(jī)械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價格較貴。

m）來表示，目數(shù)越大表示直徑越小。前面在介紹交換容量時提到了一些關(guān)于交換劑顆粒大小、孔隙的選擇。另外離子交換層析柱的分辨率和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關(guān)。一般來說顆粒小，分辨率高，但平衡離子的平衡時間長，流速慢；顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合于對分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的離子交換劑適于需要高分辨率的分析或分離。另外離子交換劑顆粒大小也會影響分離的效果。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(shù)（mesh）或者顆粒直徑（

這里特別要提到的是，離子交換纖維素目前種類很多，其中以DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）和CM-纖維素（羧甲基纖維素）最常用，它們在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。

2.離子交換劑的處理和保存

離子交換劑使用前一般要進(jìn)行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進(jìn)行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為Na型（即平衡離子是Na離子），陰離子交換劑為Cl型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH或再加一定的NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為Na型，陰離子交換劑為Cl型。使用的酸堿濃度一般小于0.5mol/L，浸泡時間一般30min。處理時應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。

離子交換劑的再生是指對使用過的離子交換劑進(jìn)行處理，使其恢復(fù)原來性狀的過程。前面介紹的酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。離子交換劑的轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過程。如對陰離子交換劑用HCl處理可將其轉(zhuǎn)為Cl型，用NaOH處理可轉(zhuǎn)為OH型，用甲酸鈉處理可轉(zhuǎn)為甲酸型等等。對離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型的目的是一致的，都是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。

前面已經(jīng)介紹了，離子交換層析就是通過離子交換劑上的平衡離子與樣品中的組分離子進(jìn)行可逆的交換而實現(xiàn)分離的目的，因此在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進(jìn)行有效的交換。如果平衡離子與離子交換劑結(jié)合力過強(qiáng)，會造成組分離子難以與交換劑結(jié)合而使交換容量降低。另外還要保證平衡離子不對樣品組分有明顯影響。因為在分離過程中，平衡離子被置換到流動相中，它不能對樣品組分有污染或破壞。如在制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因為其它離子都會對純水有污染。但是在分離蛋白質(zhì)時，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因為分離過程中H或OH離子被置換出來都會改變層析柱內(nèi)pH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質(zhì)的變性。

C下保存。離子交換劑保存時應(yīng)首先處理洗凈蛋白等雜質(zhì)，并加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，一般加?.02%的疊氮鈉，4

3.3.5離子交換層析的基本操作

離子交換層析的基本裝置及操作步驟與前面介紹的柱層析類似，這里就不再重復(fù)了。下面主要介紹離子交換層析操作中應(yīng)注意的一些具體問題。

1.層析柱

離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時要均勻平整，不能有氣泡。

2.平衡緩沖液

離子交換層析的基本反應(yīng)過程就是離子交換劑平衡離子與待分離物質(zhì)、緩沖液中離子間的交換，所以在離子交換層析中平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的選擇對于分離效果有很大的影響。

平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的選擇首先要保證各個待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。其次是要使各個待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合。而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定。在一些情況下（如污水處理）可以使雜質(zhì)與離子交換劑有牢固的結(jié)合，而樣品與離子交換劑結(jié)合不穩(wěn)定，也可以達(dá)到分離的目的。另外注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。選擇合適的平衡緩沖液，直接就可以去除大量的雜質(zhì)。并使得后面的洗脫有很好的效果。如果平衡緩沖液選擇不合適，可能會對后面的洗脫帶來困難，無法得到好的分離效果。

3.上樣

離子交換層析的上樣時應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的1－5％為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。

4.洗脫緩沖液

在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強(qiáng)度和改變pH兩種方式。改變離子強(qiáng)度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個組分被洗脫下來；而改變pH的洗脫，對于陽離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。梯度洗脫的裝置前面已經(jīng)介紹了，可以有線性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分級梯度等洗脫方式。一般線性梯度洗脫分離效果較好，故通常采用線性梯度進(jìn)行洗脫。

洗脫液的選擇首先也是要保證在整個洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來。另外可以使梯度范圍盡量小一些，以提高分辨率。

5.洗脫速度

洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會造成分離時間長、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中某個區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。

6.樣品的濃縮、脫鹽

離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積較大，樣品濃度較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進(jìn)行濃縮、脫鹽處理。

3.3.6離子交換層析的應(yīng)用

離子交換層析的應(yīng)用范圍很廣，主要有以下幾個方面。

1.水處理

離子交換層析是一種簡單而有效的去除水中的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚苯乙烯樹脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。純水的制備可以用蒸餾的方法，但要消耗大量的能源，而且制備量小、速度慢，也得不到高純度。用離子交換層析方法可以大量、快速制備高純水。一般是將水依次通過H型強(qiáng)陽離子交換劑，去除各種陽離子及與陽離子交換劑吸附的雜質(zhì)；再通過OH型強(qiáng)陰離子交換劑，去除各種陰離子及與陰離子交換劑吸附的雜質(zhì)，即可得到純水。再通過弱型陽離子和陰離子交換劑進(jìn)一步純化，就可以得到純度較高的純水。離子交換劑使用一段時間后可以通過再生處理重復(fù)使用。

2.分離純化小分子物質(zhì)

離子交換層析也廣泛的應(yīng)用于無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對氨基酸的分析，使用強(qiáng)酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混合液在pH2~3上柱。這時氨基酸都結(jié)合在樹脂上，再逐步提高洗脫液的的離子強(qiáng)度和pH，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以進(jìn)行分離鑒定。目前已有全部自動的氨基酸分析儀。

3.分離純化生物大分子物質(zhì)

離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來進(jìn)行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。由于生物樣品中蛋白的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過一次離子交換層析就達(dá)到高純度，往往要與其它分離方法配合使用。使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。

3.4親和層析

3.4.1簡介

親和層析（AffinityChromatography）是利用生物分子間專一的親和力而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。人們很早就認(rèn)識到蛋白質(zhì)、酶等生物大分子物質(zhì)能和某些相對應(yīng)的分子專一而可逆的結(jié)合，可以用于對生物分子的分離純化。但由于技術(shù)上的限制，主要是沒有合適的固定配體的方法，所以在實驗中沒有廣泛的應(yīng)用。直到60年代末，溴化氰活化多糖凝膠并偶聯(lián)蛋白質(zhì)技術(shù)的出現(xiàn)，解決了配體固定化的問題，使得親和層析技術(shù)得到了快速的發(fā)展。親和層析是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術(shù)，分離過程簡單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應(yīng)用。同時它也可以用于某些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究。

3.4.2親和層析的基本原理

生物分子間存在很多特異性的相互作用，如我們熟悉的抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等等，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析的分離原理簡單的說就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質(zhì)作為配體，例如分離酶可以選擇其底物類似物或競爭性抑制劑為配體，分離抗體可以選擇抗原作為配體等等。并將配體共價結(jié)合在適當(dāng)?shù)牟蝗苄曰|(zhì)上，如常用的Sepharose－4B等。將制備的親和吸附劑裝柱平衡，當(dāng)樣品溶液通過親和層析柱的時候，待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性的結(jié)合，從而留在固定相上；而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質(zhì)。

前面介紹的一些層析方法，如吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析等都是利用各種分子間的理化特性的差異，如分子的吸附性質(zhì)、分子大小、分子的帶電性質(zhì)等等進(jìn)行分離。由于很多生物大分子之間的這種差異較小，所以這些方法的分辨率往往不高。要分離純化一種物質(zhì)通常需要多種方法結(jié)合使用，這不僅使分離需要較多的操作步驟、較長的時間，而且使待分離物的回收率降低，也會影響待分離物質(zhì)的活性。親和層析是利用生物分子所具有的特異的生物學(xué)性質(zhì)－親和力來進(jìn)行分離純化的。由于親和力具有高度的專一性，使得親和層析的分辨率很高，是分離生物大分子的一種理想的層析方法。

3.4.3親和吸附劑

選擇并制備合適的親和吸附劑是親和層析的關(guān)鍵步驟之一。它包括基質(zhì)和配體的選擇、基質(zhì)的活化、配體與基質(zhì)的偶聯(lián)等等。這里主要介紹一些基本的原理，關(guān)于活化、偶聯(lián)等過程的具體實驗操作可以參閱本書后面的實驗部分或相應(yīng)的參考書。

1.基質(zhì)

⑴基質(zhì)的性質(zhì)

基質(zhì)構(gòu)成固定相的骨架，親和層析的基質(zhì)應(yīng)該具有以下一些性質(zhì)：

1)具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性。在與配體偶聯(lián)、層析過程中配體與待分離物結(jié)合、以及洗脫時的pH、離子強(qiáng)度等條件下，基質(zhì)的性質(zhì)都沒有明顯的改變。

2)能夠和配體穩(wěn)定的結(jié)合。親和層析的基質(zhì)應(yīng)具有較多的化學(xué)活性基團(tuán)，通過一定的化學(xué)處理能夠與配體穩(wěn)定的共價結(jié)合，并且結(jié)合后不改變基質(zhì)和配體的基本性質(zhì)。

3)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)應(yīng)是均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以使被分離的生物分子能夠均勻、穩(wěn)定的通透，并充分與配體結(jié)合?；|(zhì)的孔徑過小會增加基質(zhì)的排阻效應(yīng)，使被分離物與配體結(jié)合的機(jī)率下降，降低親和層析的吸附容量。所以一般來說，多選擇較大孔徑的基質(zhì)，以使待分離物有充分的空間與配體結(jié)合。

4)基質(zhì)本身與樣品中的各個組分均沒有明顯的非特異性吸附，不影響配體與待分離物的結(jié)合?；|(zhì)應(yīng)具有較好的親水性，以使生物分子易于靠近并與配體作用。

一般纖維素以及交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝膠排阻層析的凝膠都可以作為親和層析的基質(zhì)，其中以瓊脂糖凝膠應(yīng)用最為廣泛。纖維素價格低，可利用的活性基團(tuán)較多，但它對蛋白質(zhì)等生物分子可能有明顯的非特異性吸附作用，另外它的穩(wěn)定性和均一性也較差。交聯(lián)葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化學(xué)穩(wěn)定性較好，但它們的孔徑相對比較小，而且孔徑的穩(wěn)定性不好，可能會在與配體偶聯(lián)時有較大的降低，不利待分離物與配體充分結(jié)合，只有大孔徑型號凝膠可以用于親和層析。多孔玻璃珠的特點是機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好。但它可利用的活性基團(tuán)較少，對蛋白質(zhì)等生物分子也有較強(qiáng)的吸附作用。瓊脂糖凝膠則基本可以較好的滿足上述四個條件，它具有非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化等優(yōu)點，因此得到了廣泛的應(yīng)用，如Pharmacia公司的Sepharose－4B、6B是目前應(yīng)用較多的基質(zhì)。

⑵基質(zhì)的活化

基質(zhì)的活化是指通過對基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán)。配體和基質(zhì)的偶聯(lián)，通常首先要進(jìn)行基質(zhì)的活化。

1)多糖基質(zhì)的活化

前面已經(jīng)介紹了，多糖基質(zhì)尤其是瓊脂糖是一種常用的基質(zhì)。瓊脂糖通常含有大量的羥基，通過一定的處理可以引入各種適宜的活性基團(tuán)。瓊脂糖的活化方法很多，下面介紹一些常用的活性基團(tuán)及活化方法。

①溴化氰活化

溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團(tuán)，它可以和伯氨基（NH2）反應(yīng)，主要生成異脲衍生物。

溴化氰活化的基質(zhì)可以在溫和的條件下與配體結(jié)合，結(jié)合的配體量大。利用溴化氰活化的基質(zhì)通過進(jìn)一步處理還可以得到很多其它的衍生物。這種方法的缺點是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時，可能會出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。通過實驗條件的不斷改進(jìn)，這些缺點可以得到一定程度的控制。

②環(huán)氧乙烷基活化

這類方法活化后的基質(zhì)都含有環(huán)氧乙烷基。如在含有NaBH4的堿性條件下，1，4－丁二醇－雙縮水甘油醚的一個環(huán)氧乙烷基可以與羥基反應(yīng)，而將另一個環(huán)氧乙烷基結(jié)合在基質(zhì)上。另外也可以用環(huán)氧氯丙烷活化，將環(huán)氧乙烷基結(jié)合在基質(zhì)上。

這種活化方法的優(yōu)點是活化后不引入電荷基團(tuán)，而且基質(zhì)與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且便于在親和層析中使用較強(qiáng)烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。它的缺點是用環(huán)氧乙基活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時需要堿性條件，pH為9~13，溫度為

20~40C。這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用。

上面兩種方法是比較常用的方法，另外還有很多種活化方法如：N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化、三嗪（triazine）活化、高碘酸鹽（periodate）活化、羰酰二咪唑（carbonyldiimidazole）活化、2,4,6－三氟5－氯吡啶（FCP）活化、乙二酸酰肼（adipicaciddihydrazide）活化、二乙烯砜（divinylsulfone）活化等，總之，目前對基質(zhì)的活化方法很多，各有其特點，應(yīng)根據(jù)實際需要選擇適當(dāng)?shù)幕罨椒ā?/p>

2)聚丙烯酰胺的活化

聚丙烯酰胺凝膠有大量的甲酰胺基，可以通過對甲酰胺基的修飾而對聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行活化。一般有以下三種方式：氨乙基化作用、肼解作用和堿解作用。另外在偶聯(lián)蛋白質(zhì)配體時也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝膠。

3)多孔玻璃珠的活化

對于多孔玻璃珠等無機(jī)凝膠的活化通常采用硅烷化試劑與玻璃反應(yīng)生成烷基胺－玻璃，在多孔玻璃上引進(jìn)氨基，再通過這些氨基進(jìn)一步反應(yīng)引入活性基團(tuán)，與適當(dāng)?shù)呐潴w偶聯(lián)。

⑶間隔臂分子

在親和層析中，由于配體結(jié)合在基質(zhì)上，它在與待分離的生物大分子結(jié)合時，很大程度上要受到基質(zhì)和待分離的生物大分子間的空間位阻效應(yīng)的影響。尤其是當(dāng)配體較小或待分離的生物大分子較大時，由于直接結(jié)合在基質(zhì)上的小分子配體非常靠近基質(zhì)，而待分離的生物大分子由于受到基質(zhì)的空間障礙，使得其與配體結(jié)合的部位無法接近配體，影響了待分離的生物大分子與配體的結(jié)合，造成吸附量的降低。解決這一問題的方法通常是在配體和基質(zhì)之間引入適當(dāng)長度的“間隔臂”，即加入一段有機(jī)分子，使基質(zhì)上的配體離開基質(zhì)的骨架向外擴(kuò)展伸長，這樣就可以減少空間位阻效應(yīng)，大大增加配體對待分離的生物大分子的吸附效率。加入手臂的長度要恰當(dāng)，太短則效果不明顯；太長則容易造成彎曲，反而降低吸附效率。

引入間隔臂分子常用的方法是將適當(dāng)長度的氨基化合物NH2(CH2)nR共價結(jié)合到活化的基質(zhì)上，R通常是氨基或羧基，n一般為2－12。例如Pharmacia公司生產(chǎn)的AH－Sepharose4B和CH－Sepharose4B就是分別將1,6－乙二胺，6－氨基乙酸與CNBr活化的瓊脂糖反應(yīng)引入間隔臂分子。二者的末端分別為氨基或羧基，通過碳二亞胺的縮合作用可以分別與含羧基或氨基的配體偶聯(lián)。

另外也可以通過進(jìn)一步的活化處理，生成N－羥基琥珀酰亞胺酯、環(huán)氧基等活性基團(tuán)直接與各種配體偶聯(lián)。引入間隔臂的基質(zhì)與配體結(jié)合時，配體就可以離開基質(zhì)一定的空間，從而可以減少空間位阻效應(yīng)，易于與待分離物質(zhì)結(jié)合。

2.配體

⑴配體的性質(zhì)

親和層析是利用配體和待分離物質(zhì)的親和力而進(jìn)行分離純化的，所以選擇合適的配體對于親和層析的分離效果是非常重要的。理想的配體應(yīng)具有以下一些性質(zhì)：

1)配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力。親和力太弱，待分離物質(zhì)不易與配體結(jié)合，造成親和層析吸附效率很低。而且吸附洗脫過程中易受非特異性吸附的影響，引起分辨率下降。但如果親和力太強(qiáng)，待分離物質(zhì)很難與配體分離，這又會造成洗脫的困難。總之，配體和待分離物質(zhì)的親和力過弱或過強(qiáng)都不利于親和層析的分離。應(yīng)根據(jù)實驗要求盡量選擇與待分離物質(zhì)具有適當(dāng)?shù)挠H和力的配體。

2)配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性，也就是說配體與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力，而與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對其它組分沒有非特異性吸附作用。這是保證親和層析具有高分辨率的重要因素。

3)配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價結(jié)合，在實驗過程中不易脫落，并且配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，對其結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，尤其是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質(zhì)有親和力的部分，對二者的結(jié)合沒有明顯影響。

4)配體自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性，在實驗中能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時可能的的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。

完全滿足上述條件的配體實際上很難找到，在實驗中應(yīng)根據(jù)具體的條件來選擇盡量滿足上述條件的最適宜的配體。

根據(jù)配體對待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specificligand）和通用性配體（generalligand）。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實驗。解決這一問題的方法是使用通用性的配體。通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA、結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價格便宜等優(yōu)點，所以在實驗中得到了廣泛的應(yīng)用。在后面的親和層析應(yīng)用中將詳細(xì)介紹實驗中各種常用的配體。

⑵配體與基質(zhì)的偶聯(lián)

除了前面已經(jīng)介紹了基質(zhì)的一些活化基團(tuán)外，通過對活化基質(zhì)的進(jìn)一步處理，還可以得到更多種類的活性基團(tuán)。這些活性基團(tuán)可以在較溫和的條件下與含氨基、羧基醛基、酮基、羥基、硫醇基等多種配體反應(yīng)，使配體偶聯(lián)在基質(zhì)上。另外通過碳二亞胺、戊二醛等雙功能試劑的作用也可以使配體與基質(zhì)偶聯(lián)。以上這些方法使得幾乎任何一種配體都可以找到適當(dāng)?shù)姆椒ㄅc基質(zhì)偶聯(lián)。關(guān)于配體和基質(zhì)偶聯(lián)的具體實驗操作可以參閱本書后面的實驗部分或相應(yīng)的參考文獻(xiàn)。

配體和基質(zhì)偶聯(lián)完畢后，必須要反復(fù)洗滌，以去除未偶聯(lián)的配體。另外要用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ忾]基質(zhì)中未偶聯(lián)上配體的活性基團(tuán)，也就是使基質(zhì)失活，以免影響后面的