分子病理基礎綱要課件

DepartmentofPathology

SchoolofBasicMedicalSciences

HuangAimin腫瘤的分子病理學基礎1DepartmentofPathology腫瘤的分子

基因結構的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學研究方法2基因結構的分子病理改變2基因結構分子病理改變的主要類型點突變在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個堿基基因序列大片斷缺失和插入染色體易位重排基因擴增轉錄調控異常引起mRNA合成異常轉錄后及翻譯調控異常引起蛋白質異常3基因結構分子病理改變的主要類型點突變3

1點突變

單個堿基被另一種堿基取代

1)鹼基替換致氨基酸改變CTC→CCC

亮→脯氨酸2)終止密碼突變,合成比正常長的肽鏈

TAA→TAC

終止→酪氨酸3)突變形成終止密碼,肽鏈變短TGG→TGA

色氨酸→終止4)密碼子改變,氨基酸無改變TCC→TCG

絲氨酸→絲氨酸

錯義突變(missense)

無義突變

(nonsense)41點突變單個堿基被另一種堿基取代錯義突變2在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個堿基

缺失或插入3n個堿基,引起n個氨基酸缺失或插入

TACTCC

ACAGCA→TACGCA 酪絲蘇丙→酪丙插入處往后的氨基酸序列完全改變

(Frameshift,移碼突變) TAC

GCAACA→TACAGCAACA 酪丙蘇→酪絲門冬52在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個堿基5

插入后產生終止密碼，肽鏈變短

CCAAACGCA→CCATAACGCA 脯門冬丙→脯終止插入后終止密碼改變，肽鏈變長

CTCTAAACA→CTCTACAACA 亮終止→亮酪門冬6插入后產生終止密碼，肽鏈變短63基因序列大片斷缺失和插入使功能蛋白缺失或產生異常蛋白視網膜母細胞瘤－Rb基因大片斷缺失甲型血友?。璄xon14插入2-4Kb片斷

73基因序列大片斷缺失和插入75基因擴增基因序列拷貝數(shù)增多，重復序列增多轉錄成mRNA增多翻譯成的蛋白質增多85基因擴增8

6轉錄調控異常引起mRNA合成異常

促進子、增強子或其它基因調控因子異常，引起轉錄增多，進而引起翻譯成的蛋白質量增多乳腺癌Her-2基因促進子異常，使Her-2轉錄增多，蛋白質增多96轉錄調控異常引起mRNA合成異常97轉錄后及翻譯調控異常引起蛋白質異常

轉錄后及翻譯調控異常蛋白修飾改變

蛋白質量和質的異常功能蛋白或酶的異?？芍录毎D化107轉錄后及翻譯調控異常引起蛋白質異常10

基因結構的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學研究方法

11基因結構的分子病理改變11

腫瘤發(fā)生的分子生物學基礎原癌基因、癌基因、腫瘤抑制基因對細胞生長、分化起正向或反向調節(jié)發(fā)生異常改變，可致細胞轉化和腫瘤發(fā)生腫瘤是細胞中多種基因突變的結果

oncogenetumorsuppressorgeneDNArepairgene&apoptosis

regulatorygene12腫瘤發(fā)生的分子生物學基礎原癌基因、癌基因、腫瘤抑制

癌基因與抑癌基因

腫瘤的發(fā)生與癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關多步驟，涉及多種癌基因和抑癌基因一種腫瘤可有多種基因的變化同一種基因的改變可在不同腫瘤的發(fā)生中起作用13癌基因與抑癌基因13原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和Bishop獲諾貝爾獎

proto-oncogene存在于正常細胞內，編碼促進細胞生長物質的基因序列，以非激活的形式存在原癌基因編碼的蛋白質多為對正常細胞生長十分重要的GF&GFR14原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和

生長因子及生長因子受體

PDGFFGFEGFR

c-sis基因產物是與PDGF相似的蛋白質信號轉導蛋白（signal-transducingproteins)

H-ras、K-ras和N-ras，均可產生p21蛋白定位于細胞膜內側的膜結合蛋白，接收細胞外生長信號，在細胞增殖和分化中起重要作用

原癌基因的產物和正常功能15生長因子及生長因子受體原癌基因的產物和正常功能15細胞周期調節(jié)蛋白

CYCD1---細胞周期蛋白

CDK4-----細胞周期蛋白依賴性激酶核調節(jié)蛋白(nuclearregulatoryproteins)

轉錄活化因子

myc、myb、fos

產物為位于細胞核內的蛋白質啟動DNA復制過程，使靜止期細胞進入細胞周期1616

原癌基因產物17原癌基因產物17基因變異方式和原癌基因活化點突變-----癌基因活化的主要方式DNA擴增---另一主要方式不明原因復制成多拷貝(

Myc---神經母）染色體易位與基因重排---淋巴瘤和白血病

18基因變異方式和原癌基因活化18癌基因甲基化改變---低甲基化且與點突變、基因缺失、基因表達異常發(fā)生有密切關系基因過量表達不適宜的時間和場合表達錯誤地開啟在胚胎時期才有活性的基因細胞癌變的一個重要因素19癌基因甲基化改變---低甲基化19

癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤H-rasK-rasN-ras全長約30kb，由4個Exon組成均可產生分子量為21KD的蛋白質---p21由189個氨基酸組成P21具有GTP結合活性，參與信號傳遞許多癌基因的轉化作用可能由ras信號系統(tǒng)介導，故ras異常與腫瘤增殖密切相關20癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤20

腫瘤中ras改變基因突變：第12、13、61致瘤性點突變20％肺癌90％胰腺癌80％大腸癌30％前列腺癌10－50％白血病早期胃癌基因過度表達乳腺癌、胃癌等均有p21ras蛋白增多21 腫瘤中ras改變21

2)基因擴增

基因序列拷貝數(shù)增多神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、小細胞肺癌、胃癌、乳腺癌等與腫瘤進展、浸潤、預后、復發(fā)有關22223c-erbB-2基因---Neu、Her-2

產物185KD(P185),與EGFR十分相似腫瘤中---基因擴增與過度表達

引起蛋白增多（免疫組化染色增強）

見于30％以上的人類腫瘤乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌

陽性患者抗腫瘤治療敏感性低，預后差233c-erbB-2基因---Neu、Her-2 23

4c-abl基因

位于第9號染色體上腫瘤中abl基因改變，主要表現(xiàn)為基因重排，與第22號染色體上的Bcr基因片斷形成BCR-ABL融合基因，為費城染色體(ph’)的分子基礎

90％慢性粒細胞性白血病

20％急性淋巴細胞性白血病244c-abl基因245Bcl-2基因

位于第18號染色體

凋亡調節(jié)基因，抑制凋亡

Bcl-2基因活化主要由基因重排引起

80％濾泡性淋巴瘤

20％彌漫性大細胞淋巴瘤

50％未分化淋巴瘤255Bcl-2基因位于第18號染色體25

6Fos、sis基因乳腺癌、肺癌7Src、Sas基因神經母、軟組織肉瘤

8c-Met基因胃癌腺樣結構

9Kit基因胃腸道間質瘤

2626

抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時可引起細胞惡性轉化而導致腫瘤發(fā)生的基因

腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)其根本作用在于抑制細胞過度增殖抑制癌基因的活化及表達，或通過使癌基因表達產物失活，對細胞惡性轉化負調節(jié)

抑癌基因27抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時可抑癌基因27

抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細胞生長的負調控作用減弱或消失細胞過度增生且分化不成熟惡性轉化Rb,p53,p16,p15,PTEN,BRCA,nm2328抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細胞生長的判定抑癌基因的3個基本標準惡性腫瘤的相應正常組織中該基因須正常表達惡性腫瘤中該基因功能失活或結構改變或表達缺陷將該基因的野生型導入瘤細胞內,可部分或全部改變其惡性表型29判定抑癌基因的3個基本標準惡性腫瘤的相應正常組織中該基抑癌基因突變的基本病變PointmutationGenelossesGenetranslocationandrearrangementMethylation/hypermethylationLowerexpressionCombinewithoncogeneprotein30抑癌基因突變的基本病變Pointmutatio1p53基因

人p53基因為約20kb的DNA片段位于17號染色體，共有11個外顯子,轉錄出約為2.5kb的mRNA編碼393個AA組成的53KD核內蛋白質具蛋白質-蛋白質及蛋白質-DNA結合功能被《Science》評為1993年的明星分子

常見的抑癌基因與腫瘤311p53基因常見的抑癌基因與腫瘤31

p53蛋白有5個高度保守區(qū)AAresiduals13-19AAresiduals117-142AAresiduals171-181AAresiduals234-258AAresiduals270-2863232p53是細胞生長周期中的負調節(jié)因子細胞周期調控DNA修復細胞分化細胞凋亡33p53是細胞生長周期中的負調節(jié)因子33

腫瘤細胞p53基因的改變1)點突變或基因小片斷缺失或插入

人腫瘤中最常見的突變（50％－60％）常發(fā)生在第5－8Exon，突變熱點（hotspots)

E5E6E7E8E9E10E11E4E3E2突變相對頻率P53基因組DNA結構34 腫瘤細胞p53基因的改變E5E6E7E8E9E10E11Hotspots

codon132-143codon174-179codon236-248codon272-281肺癌(273)結腸癌(175）肝癌(249）乳腺癌(248-258)

胃癌膀胱癌肺癌與肝癌GT結腸癌GCAT35Hotspots35

2)蛋白的改變

野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘難以檢出基因突變表達突變型p53蛋白時，半衰期增加到數(shù)小時,免疫組化可檢出p53蛋白突變型p53蛋白，無抑癌功能362)蛋白的改變36

2Rb基因第一個被克隆的抑癌基因，最重要首先在Retinoblastoma中發(fā)現(xiàn)，稱為Rb基因1986年美國3個實驗室分別獨立克隆---200kb27Exon，轉錄產物為4.7kb的mRNAmRNA編碼由928AA組成MW105-110KD的核內蛋白，參與細胞周期調控磷酸化與非磷酸化兩種形式

372Rb基因37

Rb基因在腫瘤中的改變主要為大片斷缺失和基因突變

RB抑癌基因的缺失或突變而導致P105失活視網膜母細胞瘤骨肉瘤……….43%小細胞肺癌….47%乳腺癌……….32%與p53,c-myc,c-fos,TGF相互調節(jié)38 383MTS1基因又稱p16或p16CDK4I

(Multipletumorsuppressor1)4MTS2基因又稱p15CDK6I5CIP1(WAF1)基因編碼p21WAF1蛋白

CIP1(CDK-interacted-protein1)

WAF1(Wildtypep53activatedfragment1)6BRCA1、BRCA2基因

乳腺卵巢癌易感基因

393MTS1基因又稱p16或p16

7APC、DCC基因---抑制信號傳導adenomatouspolyposiscoli,APCdeletedincolorectalcarcinoma,DCC家族性結腸多發(fā)性息肉病、結腸癌、胃癌

8PTEN基因

1997年由三個實驗室同時分離鑒定

MMAC-1（mutatedinmultipleadvancedcancer1)4040

9p63、p73基因DNA序列上與p53基因有很大同源性

10WT1基因腎細胞分化有關Wilms瘤中基因缺失或變異

11NF1基因

神經纖維瘤病易感基因

4141

多步癌變的分子基礎分子水平改變正常上皮過度增生

形態(tài)學改變早期腺瘤

晚期腺瘤

結腸癌

APC缺失或突變中期腺瘤

DNA甲基化喪失

Ras基因突變

DCC基因缺失

P53基因缺失42多步癌變的分子基礎分子水平改變正常上皮過度增生

腫瘤分子病理診斷的意義

腫瘤易感基因病變的診斷

腫瘤的早期診斷與鑒別診斷

疑難腫瘤的診斷及分類

腫瘤病情監(jiān)測

腫瘤的個體化和預見性治療

腫瘤的預后判斷43腫瘤分子病理診斷的意義43

腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關的腫瘤易感基因檢測，篩檢腫瘤高危人群已明確的腫瘤易感基因及其相關腫瘤

Rb---視網膜母細胞瘤

WT1---腎母細胞瘤

APC---家族性腺瘤性息肉病

NF1---神經纖維瘤病

BRCA1、2、3---乳腺癌44腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關的腫瘤易感基因檢測，篩檢

腫瘤基因標志與腫瘤診斷

較普遍表達

H-rasK-rasc-mycc-fos

特異性表達

abl

臨床診斷意義尚不明確

c-mosc-yesc-fpsc-src45腫瘤基因標志與腫瘤診斷45

腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細胞形態(tài)學改變可能檢測出浸潤前期的腫瘤K-ras基因突變---12,13,61胰腺癌、結腸癌、肺癌FNA檢測胰腺癌第12密碼子突變，檢出率100％P53蛋白的核內表達為多種惡性腫瘤的表現(xiàn)46腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細胞形態(tài)學改變46

腫瘤基因標志與腫瘤鑒別診斷erbB：上皮源性腫瘤高表達erbB：肺大細胞癌高表達肺小細胞癌及黑色素瘤低或不表達Fms：粒細胞性白血病高表達淋巴細胞性白血病不表達C-myc激活….B細胞性淋巴瘤L-myc擴增….肺小細胞癌N-myc擴增….神經母細胞瘤47腫瘤基因標志與腫瘤鑒別診斷47

疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細胞增生與淋巴細胞性腫瘤及其克隆起源RFLP和PCR分析Ig或T細胞受體（TCR)基因的重排B細胞性淋巴瘤---Ig、

、重鏈（H)重排T細胞性淋巴瘤---TCR基因重排慢性粒細胞性白血病----Bcr區(qū)基因重排神經母細胞瘤---N-myc擴增與過表達神經細胞瘤------C-myc擴增與過表達48疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細胞增生與淋巴細胞性腫瘤及其

腫瘤的病情監(jiān)測N-myc高表達….神經母惡性進展L-myc活性高….肺小細胞癌惡性度高ras高表達………前列腺癌低分化H-ras高表達……胃癌已轉移neu高表達……...癌已轉移，存活期短

（乳腺癌及卵巢癌）49腫瘤的病情監(jiān)測49

腫瘤的個體化和預見性治療反義治療人工合成特異寡核苷酸導入瘤細胞，封閉致癌基因的表達

mycmybfoski-rasH-rasabl-bcr50腫瘤的個體化和預見性治療50抑癌基因治療將正常的抑癌基因導入惡變細胞內代替或補償有缺陷的抑癌基因，抑制腫瘤生長并逆轉其表型

已有報道將

RBP53APCNF1P21P16

分別導入多種腫瘤細胞內51抑癌基因治療51

腫瘤的預后判斷P53p16c-erbB-2乳腺癌、肝癌、結腸癌的預后相關nm23---腫瘤轉移抑制基因52腫瘤的預后判斷P53p16c-erbB

基因結構的分子病理改變

癌基因與抑癌基因

腫瘤分子病理學研究方法

53基因結構的分子病理改變53

病理學發(fā)展的嶄新變革對疾病的認識由表型向基因型過渡傳統(tǒng)的以形態(tài)學為主“舊生物學”病理診斷主要依從于經驗

“新生物學”+循證病理學

功能基因組學和蛋白組學為技術平臺54病理學發(fā)展的嶄新變革54

基因多態(tài)性檢測基因表達譜分析蛋白表達譜分析生物芯片生物信息學bioinformatics成千上萬個數(shù)據及其相互關聯(lián)評價分子生物學與病理形態(tài)學的整合55基因多態(tài)性檢測55

腫瘤病理發(fā)生學分子診斷和分型，新病種疾病的微生物檢測和診斷疾病進展和預后的評估藥物反應，指導個體化治療增加病理學診斷的準確性和權威性實驗室研究逐步進入臨床應用階段應用56腫瘤病理發(fā)生學應用56

基因芯片技術（genechip/DNAchip）1995年Standford大學醫(yī)學中心生化系Brown教授首先報道大量靶基因或寡核苷酸片斷有序高密度排列在載體上—硅片、玻片、尼龍膜芯片陣列儀激光掃描儀計算機生物信息軟件處理系統(tǒng)1基因表達譜分析與腫瘤分子分型P52557基因芯片技術（genechip/DNAchip）1基

表達譜基因芯片基因功能的研究診斷芯片檢測芯片遺傳病/代謝病/某些腫瘤的診斷病原微生物檢測

58表達譜基因芯片58

大規(guī)?；虮磉_譜分析（largescalegeneexpressionprofiling)基因突變檢測、新基因尋找抗生素和抗腫瘤藥物的篩選疾病的診斷

應用59大規(guī)模基因表達譜分析應用59

為腫瘤的精確分型帶來希望基因表達譜作為特征性“分子標簽”（molecularsignature)建立全新的腫瘤分子診斷和分型系統(tǒng)淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌分型60為腫瘤的精確分型帶來希望60

實驗材料要求新鮮組織或培養(yǎng)細胞中提取的mRNA外周血和培養(yǎng)細胞樣本的研究較容易對實體瘤的研究受到一定限制61實驗材料要求61

組織微陣列(tissuemicroarray,TMA)1998年Kononen首次提出《NatureMedicine》

數(shù)十至數(shù)百個小組織排列于載體上形成的微縮組織切片組織篩選和定位陣列蠟塊制作和切片2組織芯片技術62組織微陣列(tissuemicroarray,TMA體積小，信息量大，可根據要求進行組合高效快速低消耗地進行各種原位組織學觀察研究形態(tài)學、免疫組化、原位雜交、原位PCR較好的內對照及實驗條件可比性和重復性63體積小，信息量大，可根據要求進行組合63單獨或與基因芯片配套用于基因及其蛋白產物的分析和基因功能的研究基因探針的篩選及生物制劑的鑒定組織學、病理學實習教材外科病理縮微圖譜64單獨或與基因芯片配套用于基因及其64

直接法---熒光素直接標記已知的DNA探針間接法---非熒光標記物標記已知探針橋連一個熒光標記的抗體DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交間期細胞分裂中期染色體冷凍切片石蠟切片

3熒光原位雜交---FluorescenceISH,FISH653熒光原位雜交---FluorescenceISH,

重復序列探針位點特異性探針全染色體探針大量商品化的熒光標記探針FISH廣泛應用成為可能66重復序列探針66

FDA批準FISH檢測HER2/c-erbB2實驗目的

評價預后基于阿霉素的化療選擇

幫助評價是否采取曲妥珠單抗(Herceptin,赫賽?。┲委烮HC2+/3+患者，僅FISH陽性者對藥物有反應67FDA批準FISH檢測HER2/c-erbB267

FISH的應用

乳腺癌HER2基因診斷肺癌EGFR和HER2基因診斷膀胱癌無創(chuàng)性早期診斷和復發(fā)的早期檢測胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等腫瘤基因的分析研究68FISH的應用682001年12月31日,美國FDA批準FISH檢測HER2基因狀態(tài)用于乳腺癌診斷,以指導臨床治療HER2基因為紅色熒光，正常HER2拷貝數(shù)(1~5)CEP17為17號染色體著絲粒,為綠色熒光692001年12月31日,美國FDA批準FISH檢測HER2

常規(guī)PCR是基因檢測的金標準基因突變檢測、測序的前期和基礎易受污染妨礙其臨床應用4即時熒光定量PCR---Real-timePCR70常規(guī)PCR是基因檢測的金標準4即時熒光定量PCR---R

Real-timePCR

靈敏、定量、特異、封閉無污染提供了對PCR產物積累過程實時監(jiān)測微生物病原檢測、腫瘤生物學標志物臨床應用前景寬廣將逐漸成為病理學必備技術之一71Real-timePCR71

comparativegenomichybridization,CGH分子細胞遺傳學技術單一的一次雜交檢測某一腫瘤整個基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化

5比較基因組雜交72comparativegenomichybridiza

CGH的優(yōu)點

實驗所需樣本DNA量較少外周血、培養(yǎng)細胞、新鮮組織、存檔組織全基因組范圍內分析腫瘤染色體不平衡發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因所在區(qū)域腫瘤發(fā)病的分子機制研究73CGH的優(yōu)點實驗所需樣本DNA量較少73

CGH的局限性

所能檢測到的最小的DNA擴增或丟失在3-5Mb，對于低水平的DNA擴增和小片斷丟失可能漏檢相關染色體拷貝數(shù)無變化時，不能檢測出平行染色體的易位74CGH的局限性所能檢測到的最小的DNA擴增或丟失在3

lasercapturemicrodissection，LCM從組織切片或細胞涂片上的任一區(qū)域切割數(shù)百、數(shù)十、單個細胞再進行PCR、PCR-SSCP、CGH等冷凍切片、石蠟切片、細胞涂片先常規(guī)或免疫組化染色進行定位

6激光捕獲顯微切割術75lasercapturemicrodi

局限性

手工操作技術難度大LCM操作簡便，耗時少，取材準確需特殊設備，激光器造價高76局限性手工操作技術難度大76

Laserscanningconfocalmicroscope

---LSCM

光學顯微鏡＋激光掃描＋計算機圖像處理細胞CT，顯微CT，三維圖像重建活細胞長時間無損傷動態(tài)觀察……

原位---動態(tài)---定量

7激光掃描共聚焦顯微術77Laserscanningconfocalmicro

細胞間通訊，膜流動性測定細胞骨架的構成培養(yǎng)細胞樣本，冷凍切片石蠟包埋標本不合適免疫熒光染色或FISH78細胞間通訊，膜流動性測定78精密、準確、快速、分辨高

快速準確測定細胞內DNA含量和倍體數(shù)快速進行細胞分選和細胞收集測定生長分數(shù)，診斷惡性腫瘤的參考反映惡性程度和生物學行為8流式細胞術---Flowcytometry，F(xiàn)CM79精密、準確、快速、分辨高8流式細胞術---Flow

在基礎研究和臨床中的應用

外周血細胞的免疫表型測定和定量分析某一特定細胞群的篩選和收集細胞MDR基因的檢測細胞凋亡的定量研究癌基因和抑癌基因的檢測細胞內某些蛋白質與核酸的定量分析80在基礎研究和臨床中的應用外周血細胞的免疫表型測定和定

定量核形態(tài)參數(shù)的測定

直徑/周長/面積/體積

區(qū)別良惡性腫瘤、癌前病變與癌腫瘤的組織病理分級、預后判斷DNA倍體分析和顯色反應的定量

免疫組化原位雜交

9圖像分析技術---Imageanalysis

，IA81定量81

雜合性缺失（LOH）檢測

單核苷酸多態(tài)性（SNP)分析

RNA干擾

8282核酸雜交Southern雜交---檢測DNA

Northern雜交---檢測RNADot/Slot雜交---檢測DNA或RNA

原位雜交(Insituhybridization,ISH)應用范圍廣DNA和mRNA定性、定位、定量、分布雜交電鏡的亞細胞定位

10其他常用技術83核酸雜交10其他常用技術83

restrictionfragmentlengthpolymorphism,

RFLP

分析

限制性內切酶片斷長度多態(tài)性分析GenomicDNA酶切電泳轉膜雜交放射自顯影分析基因的變化結合PCR--PCR-RFLP簡便快速樣本用量少8484

限制性內切酶酶切位點EcoRI

GAATTC

BamH1

GGATCC

CTTAAG

CCTAGG

GTTAGAATTCGAATCCGAGGTTGGATCCCGG

CAATCTTAAGCTTAGGCTCCAACCTAGGGCC8585

WesternBlot

PCR技術

PCR-RFLP分析

PCR-SSCPDNA單鏈構象多態(tài)性分析

PCR-DNAsequencing

凋亡的檢測

計算機重構蛋白質三維結構86WesternBlot86PCR….酶切….電泳

M

正常

突變GAATTCGCATT失去酶切位點野生型突變型PCR產物PCR-RFLP87GAATTCGCATT失去酶切位點野生型突變型PCR產生物信息學技術---bioinformatics

以基因組DNA序列的信息分析為源頭分析基因組結構，尋找或發(fā)現(xiàn)新基因分析基因調控信息在此基礎上研究基因的功能88生物信息學技術---bioinformatics以基因組D

模擬和預測蛋白質空間結構蛋白質的性質、結構及功能間的關系為基于靶分子結構的藥物分子設計和蛋白質分子改性設計提供依據已在理論生物學領域占據核心地位主要任務是研究生物分子數(shù)據的獲取、存儲和查詢，發(fā)展數(shù)據分析方法89模擬和預測蛋白質空間結構89生物信息的收集、存儲、管理與提供分子生物學的三大核心數(shù)據庫GenBank核酸序列數(shù)據庫SWISS-PROT蛋白質序列數(shù)據庫PDB生物大分子結構數(shù)據庫已成為全世界分子生物學和醫(yī)學研究人員獲取生物分子序列、結構信息的基本來源發(fā)表自己序列或結構測定結果的重要媒體90生物信息的收集、存儲、管理與提供分子生物學的三大核心數(shù)據庫9基因組序列分析基因表達數(shù)據的分析與處理了解基因與疾病的關系疾病產生的機制，為疾病的診療提供依據確定新藥的作用靶點和作用方式設計新的藥物分子生物學數(shù)據的處理和分析91基因組序列分析生物學數(shù)據的處理和分析91開發(fā)研制管理分析數(shù)據的新工具和實用軟件，為生物信息學的具體應用服務與大規(guī)模基因表達譜分析相關算法和軟件基因表達調控網絡的研究與基因組信息相關的核酸、蛋白質空間結構的預測和模擬蛋白質功能預測的研究生物學數(shù)據的有效利用92生物學數(shù)據的有效利用92現(xiàn)代生物技術的進展生物芯片技術蛋白質二維凝膠電泳技術質譜技術、蛋白質結構測定技術新形式的生物學實驗數(shù)據的信息挖掘已納入生物信息學的研究范疇后基因組時代的生物信息學技術將為基因組功能預測、透視基因相互作用及其機制、生物學虛擬實驗模型的構建等提供強大支撐93現(xiàn)代生物技術的進展生物芯片技術93生物分子信息處理流程

實驗數(shù)據信息知識基因工程蛋白質設計疾病診斷疾病治療新藥開發(fā)94生物分子信息處理流程數(shù)據信息知識基因工程94

極大豐富了判斷預后、預測因素的生物學標志物內容不斷涌現(xiàn)新的疾病單位、病理分子分型使感染性疾病的微生物學檢測和診斷特異、敏感、易行，與組織學檢查同步增加病理診斷的準確性和權威性

分子診斷進入病理診斷領域95極大豐富了判斷預后、預測因素的生物分子診斷進入病理診斷

DepartmentofPathology

SchoolofBasicMedicalSciences

HuangAimin腫瘤的分子病理學基礎96DepartmentofPathology腫瘤的分子

基因結構的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學研究方法97基因結構的分子病理改變2基因結構分子病理改變的主要類型點突變在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個堿基基因序列大片斷缺失和插入染色體易位重排基因擴增轉錄調控異常引起mRNA合成異常轉錄后及翻譯調控異常引起蛋白質異常98基因結構分子病理改變的主要類型點突變3

1點突變

單個堿基被另一種堿基取代

1)鹼基替換致氨基酸改變CTC→CCC

亮→脯氨酸2)終止密碼突變,合成比正常長的肽鏈

TAA→TAC

終止→酪氨酸3)突變形成終止密碼,肽鏈變短TGG→TGA

色氨酸→終止4)密碼子改變,氨基酸無改變TCC→TCG

絲氨酸→絲氨酸

錯義突變(missense)

無義突變

(nonsense)991點突變單個堿基被另一種堿基取代錯義突變2在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個堿基

缺失或插入3n個堿基,引起n個氨基酸缺失或插入

TACTCC

ACAGCA→TACGCA 酪絲蘇丙→酪丙插入處往后的氨基酸序列完全改變

(Frameshift,移碼突變) TAC

GCAACA→TACAGCAACA 酪丙蘇→酪絲門冬1002在基因編碼區(qū)缺失或插入幾個堿基5

插入后產生終止密碼，肽鏈變短

CCAAACGCA→CCATAACGCA 脯門冬丙→脯終止插入后終止密碼改變，肽鏈變長

CTCTAAACA→CTCTACAACA 亮終止→亮酪門冬101插入后產生終止密碼，肽鏈變短63基因序列大片斷缺失和插入使功能蛋白缺失或產生異常蛋白視網膜母細胞瘤－Rb基因大片斷缺失甲型血友病－Exon14插入2-4Kb片斷

1023基因序列大片斷缺失和插入75基因擴增基因序列拷貝數(shù)增多，重復序列增多轉錄成mRNA增多翻譯成的蛋白質增多1035基因擴增8

6轉錄調控異常引起mRNA合成異常

促進子、增強子或其它基因調控因子異常，引起轉錄增多，進而引起翻譯成的蛋白質量增多乳腺癌Her-2基因促進子異常，使Her-2轉錄增多，蛋白質增多1046轉錄調控異常引起mRNA合成異常97轉錄后及翻譯調控異常引起蛋白質異常

轉錄后及翻譯調控異常蛋白修飾改變

蛋白質量和質的異常功能蛋白或酶的異?？芍录毎D化1057轉錄后及翻譯調控異常引起蛋白質異常10

基因結構的分子病理改變

癌基因與抑癌基因腫瘤分子病理學研究方法

106基因結構的分子病理改變11

腫瘤發(fā)生的分子生物學基礎原癌基因、癌基因、腫瘤抑制基因對細胞生長、分化起正向或反向調節(jié)發(fā)生異常改變，可致細胞轉化和腫瘤發(fā)生腫瘤是細胞中多種基因突變的結果

oncogenetumorsuppressorgeneDNArepairgene&apoptosis

regulatorygene107腫瘤發(fā)生的分子生物學基礎原癌基因、癌基因、腫瘤抑制

癌基因與抑癌基因

腫瘤的發(fā)生與癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關多步驟，涉及多種癌基因和抑癌基因一種腫瘤可有多種基因的變化同一種基因的改變可在不同腫瘤的發(fā)生中起作用108癌基因與抑癌基因13原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和Bishop獲諾貝爾獎

proto-oncogene存在于正常細胞內，編碼促進細胞生長物質的基因序列，以非激活的形式存在原癌基因編碼的蛋白質多為對正常細胞生長十分重要的GF&GFR109原癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和定義1989年Varmus和

生長因子及生長因子受體

PDGFFGFEGFR

c-sis基因產物是與PDGF相似的蛋白質信號轉導蛋白（signal-transducingproteins)

H-ras、K-ras和N-ras，均可產生p21蛋白定位于細胞膜內側的膜結合蛋白，接收細胞外生長信號，在細胞增殖和分化中起重要作用

原癌基因的產物和正常功能110生長因子及生長因子受體原癌基因的產物和正常功能15細胞周期調節(jié)蛋白

CYCD1---細胞周期蛋白

CDK4-----細胞周期蛋白依賴性激酶核調節(jié)蛋白(nuclearregulatoryproteins)

轉錄活化因子

myc、myb、fos

產物為位于細胞核內的蛋白質啟動DNA復制過程，使靜止期細胞進入細胞周期11116

原癌基因產物112原癌基因產物17基因變異方式和原癌基因活化點突變-----癌基因活化的主要方式DNA擴增---另一主要方式不明原因復制成多拷貝(

Myc---神經母）染色體易位與基因重排---淋巴瘤和白血病

113基因變異方式和原癌基因活化18癌基因甲基化改變---低甲基化且與點突變、基因缺失、基因表達異常發(fā)生有密切關系基因過量表達不適宜的時間和場合表達錯誤地開啟在胚胎時期才有活性的基因細胞癌變的一個重要因素114癌基因甲基化改變---低甲基化19

癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤H-rasK-rasN-ras全長約30kb，由4個Exon組成均可產生分子量為21KD的蛋白質---p21由189個氨基酸組成P21具有GTP結合活性，參與信號傳遞許多癌基因的轉化作用可能由ras信號系統(tǒng)介導，故ras異常與腫瘤增殖密切相關115癌基因與人類腫瘤1Ras基因變異與腫瘤20

腫瘤中ras改變基因突變：第12、13、61致瘤性點突變20％肺癌90％胰腺癌80％大腸癌30％前列腺癌10－50％白血病早期胃癌基因過度表達乳腺癌、胃癌等均有p21ras蛋白增多116 腫瘤中ras改變21

2)基因擴增

基因序列拷貝數(shù)增多神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、小細胞肺癌、胃癌、乳腺癌等與腫瘤進展、浸潤、預后、復發(fā)有關117223c-erbB-2基因---Neu、Her-2

產物185KD(P185),與EGFR十分相似腫瘤中---基因擴增與過度表達

引起蛋白增多（免疫組化染色增強）

見于30％以上的人類腫瘤乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌

陽性患者抗腫瘤治療敏感性低，預后差1183c-erbB-2基因---Neu、Her-2 23

4c-abl基因

位于第9號染色體上腫瘤中abl基因改變，主要表現(xiàn)為基因重排，與第22號染色體上的Bcr基因片斷形成BCR-ABL融合基因，為費城染色體(ph’)的分子基礎

90％慢性粒細胞性白血病

20％急性淋巴細胞性白血病1194c-abl基因245Bcl-2基因

位于第18號染色體

凋亡調節(jié)基因，抑制凋亡

Bcl-2基因活化主要由基因重排引起

80％濾泡性淋巴瘤

20％彌漫性大細胞淋巴瘤

50％未分化淋巴瘤1205Bcl-2基因位于第18號染色體25

6Fos、sis基因乳腺癌、肺癌7Src、Sas基因神經母、軟組織肉瘤

8c-Met基因胃癌腺樣結構

9Kit基因胃腸道間質瘤

12126

抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時可引起細胞惡性轉化而導致腫瘤發(fā)生的基因

腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)其根本作用在于抑制細胞過度增殖抑制癌基因的活化及表達，或通過使癌基因表達產物失活，對細胞惡性轉化負調節(jié)

抑癌基因122抑癌基因是指在發(fā)生突變、缺失或失活時可抑癌基因27

抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細胞生長的負調控作用減弱或消失細胞過度增生且分化不成熟惡性轉化Rb,p53,p16,p15,PTEN,BRCA,nm23123抑癌基因失活突變、缺失等而失活對細胞生長的判定抑癌基因的3個基本標準惡性腫瘤的相應正常組織中該基因須正常表達惡性腫瘤中該基因功能失活或結構改變或表達缺陷將該基因的野生型導入瘤細胞內,可部分或全部改變其惡性表型124判定抑癌基因的3個基本標準惡性腫瘤的相應正常組織中該基抑癌基因突變的基本病變PointmutationGenelossesGenetranslocationandrearrangementMethylation/hypermethylationLowerexpressionCombinewithoncogeneprotein125抑癌基因突變的基本病變Pointmutatio1p53基因

人p53基因為約20kb的DNA片段位于17號染色體，共有11個外顯子,轉錄出約為2.5kb的mRNA編碼393個AA組成的53KD核內蛋白質具蛋白質-蛋白質及蛋白質-DNA結合功能被《Science》評為1993年的明星分子

常見的抑癌基因與腫瘤1261p53基因常見的抑癌基因與腫瘤31

p53蛋白有5個高度保守區(qū)AAresiduals13-19AAresiduals117-142AAresiduals171-181AAresiduals234-258AAresiduals270-28612732p53是細胞生長周期中的負調節(jié)因子細胞周期調控DNA修復細胞分化細胞凋亡128p53是細胞生長周期中的負調節(jié)因子33

腫瘤細胞p53基因的改變1)點突變或基因小片斷缺失或插入

人腫瘤中最常見的突變（50％－60％）常發(fā)生在第5－8Exon，突變熱點（hotspots)

E5E6E7E8E9E10E11E4E3E2突變相對頻率P53基因組DNA結構129 腫瘤細胞p53基因的改變E5E6E7E8E9E10E11Hotspots

codon132-143codon174-179codon236-248codon272-281肺癌(273)結腸癌(175）肝癌(249）乳腺癌(248-258)

胃癌膀胱癌肺癌與肝癌GT結腸癌GCAT130Hotspots35

2)蛋白的改變

野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘難以檢出基因突變表達突變型p53蛋白時，半衰期增加到數(shù)小時,免疫組化可檢出p53蛋白突變型p53蛋白，無抑癌功能1312)蛋白的改變36

2Rb基因第一個被克隆的抑癌基因，最重要首先在Retinoblastoma中發(fā)現(xiàn)，稱為Rb基因1986年美國3個實驗室分別獨立克隆---200kb27Exon，轉錄產物為4.7kb的mRNAmRNA編碼由928AA組成MW105-110KD的核內蛋白，參與細胞周期調控磷酸化與非磷酸化兩種形式

1322Rb基因37

Rb基因在腫瘤中的改變主要為大片斷缺失和基因突變

RB抑癌基因的缺失或突變而導致P105失活視網膜母細胞瘤骨肉瘤……….43%小細胞肺癌….47%乳腺癌……….32%與p53,c-myc,c-fos,TGF相互調節(jié)133 383MTS1基因又稱p16或p16CDK4I

(Multipletumorsuppressor1)4MTS2基因又稱p15CDK6I5CIP1(WAF1)基因編碼p21WAF1蛋白

CIP1(CDK-interacted-protein1)

WAF1(Wildtypep53activatedfragment1)6BRCA1、BRCA2基因

乳腺卵巢癌易感基因

1343MTS1基因又稱p16或p16

7APC、DCC基因---抑制信號傳導adenomatouspolyposiscoli,APCdeletedincolorectalcarcinoma,DCC家族性結腸多發(fā)性息肉病、結腸癌、胃癌

8PTEN基因

1997年由三個實驗室同時分離鑒定

MMAC-1（mutatedinmultipleadvancedcancer1)13540

9p63、p73基因DNA序列上與p53基因有很大同源性

10WT1基因腎細胞分化有關Wilms瘤中基因缺失或變異

11NF1基因

神經纖維瘤病易感基因

13641

多步癌變的分子基礎分子水平改變正常上皮過度增生

形態(tài)學改變早期腺瘤

晚期腺瘤

結腸癌

APC缺失或突變中期腺瘤

DNA甲基化喪失

Ras基因突變

DCC基因缺失

P53基因缺失137多步癌變的分子基礎分子水平改變正常上皮過度增生

腫瘤分子病理診斷的意義

腫瘤易感基因病變的診斷

腫瘤的早期診斷與鑒別診斷

疑難腫瘤的診斷及分類

腫瘤病情監(jiān)測

腫瘤的個體化和預見性治療

腫瘤的預后判斷138腫瘤分子病理診斷的意義43

腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關的腫瘤易感基因檢測，篩檢腫瘤高危人群已明確的腫瘤易感基因及其相關腫瘤

Rb---視網膜母細胞瘤

WT1---腎母細胞瘤

APC---家族性腺瘤性息肉病

NF1---神經纖維瘤病

BRCA1、2、3---乳腺癌139腫瘤易感基因病變的診斷與遺傳相關的腫瘤易感基因檢測，篩檢

腫瘤基因標志與腫瘤診斷

較普遍表達

H-rasK-rasc-mycc-fos

特異性表達

abl

臨床診斷意義尚不明確

c-mosc-yesc-fpsc-src140腫瘤基因標志與腫瘤診斷45

腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細胞形態(tài)學改變可能檢測出浸潤前期的腫瘤K-ras基因突變---12,13,61胰腺癌、結腸癌、肺癌FNA檢測胰腺癌第12密碼子突變，檢出率100％P53蛋白的核內表達為多種惡性腫瘤的表現(xiàn)141腫瘤的早期診斷分子病理改變早于細胞形態(tài)學改變46

腫瘤基因標志與腫瘤鑒別診斷erbB：上皮源性腫瘤高表達erbB：肺大細胞癌高表達肺小細胞癌及黑色素瘤低或不表達Fms：粒細胞性白血病高表達淋巴細胞性白血病不表達C-myc激活….B細胞性淋巴瘤L-myc擴增….肺小細胞癌N-myc擴增….神經母細胞瘤142腫瘤基因標志與腫瘤鑒別診斷47

疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細胞增生與淋巴細胞性腫瘤及其克隆起源RFLP和PCR分析Ig或T細胞受體（TCR)基因的重排B細胞性淋巴瘤---Ig、

、重鏈（H)重排T細胞性淋巴瘤---TCR基因重排慢性粒細胞性白血病----Bcr區(qū)基因重排神經母細胞瘤---N-myc擴增與過表達神經細胞瘤------C-myc擴增與過表達143疑難腫瘤的診斷及分類判斷淋巴細胞增生與淋巴細胞性腫瘤及其

腫瘤的病情監(jiān)測N-myc高表達….神經母惡性進展L-myc活性高….肺小細胞癌惡性度高ras高表達………前列腺癌低分化H-ras高表達……胃癌已轉移neu高表達……...癌已轉移，存活期短

（乳腺癌及卵巢癌）144腫瘤的病情監(jiān)測49

腫瘤的個體化和預見性治療反義治療人工合成特異寡核苷酸導入瘤細胞，封閉致癌基因的表達

mycmybfoski-rasH-rasabl-bcr145腫瘤的個體化和預見性治療50抑癌基因治療將正常的抑癌基因導入惡變細胞內代替或補償有缺陷的抑癌基因，抑制腫瘤生長并逆轉其表型

已有報道將

RBP53APCNF1P21P16

分別導入多種腫瘤細胞內146抑癌基因治療51

腫瘤的預后判斷P53p16c-erbB-2乳腺癌、肝癌、結腸癌的預后相關nm23---腫瘤轉移抑制基因147腫瘤的預后判斷P53p16c-erbB

基因結構的分子病理改變

癌基因與抑癌基因

腫瘤分子病理學研究方法

148基因結構的分子病理改變53

病理學發(fā)展的嶄新變革對疾病的認識由表型向基因型過渡傳統(tǒng)的以形態(tài)學為主“舊生物學”病理診斷主要依從于經驗

“新生物學”+循證病理學

功能基因組學和蛋白組學為技術平臺149病理學發(fā)展的嶄新變革54

基因多態(tài)性檢測基因表達譜分析蛋白表達譜分析生物芯片生物信息學bioinformatics成千上萬個數(shù)據及其相互關聯(lián)評價分子生物學與病理形態(tài)學的整合150基因多態(tài)性檢測55

腫瘤病理發(fā)生學分子診斷和分型，新病種疾病的微生物檢測和診斷疾病進展和預后的評估藥物反應，指導個體化治療增加病理學診斷的準確性和權威性實驗室研究逐步進入臨床應用階段應用151腫瘤病理發(fā)生學應用56

基因芯片技術（genechip/DNAchip）1995年Standford大學醫(yī)學中心生化系Brown教授首先報道大量靶基因或寡核苷酸片斷有序高密度排列在載體上—硅片、玻片、尼龍膜芯片陣列儀激光掃描儀計算機生物信息軟件處理系統(tǒng)1基因表達譜分析與腫瘤分子分型P525152基因芯片技術（genechip/DNAchip）1基

表達譜基因芯片基因功能的研究診斷芯片檢測芯片遺傳病/代謝病/某些腫瘤的診斷病原微生物檢測

153表達譜基因芯片58

大規(guī)?；虮磉_譜分析（largescalegeneexpressionprofiling)基因突變檢測、新基因尋找抗生素和抗腫瘤藥物的篩選疾病的診斷

應用154大規(guī)?；虮磉_譜分析應用59

為腫瘤的精確分型帶來希望基因表達譜作為特征性“分子標簽”（molecularsignature)建立全新的腫瘤分子診斷和分型系統(tǒng)淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌分型155為腫瘤的精確分型帶來希望60

實驗材料要求新鮮組織或培養(yǎng)細胞中提取的mRNA外周血和培養(yǎng)細胞樣本的研究較容易對實體瘤的研究受到一定限制156實驗材料要求61

組織微陣列(tissuemicroarray,TMA)1998年Kononen首次提出《NatureMedicine》

數(shù)十至數(shù)百個小組織排列于載體上形成的微縮組織切片組織篩選和定位陣列蠟塊制作和切片2組織芯片技術157組織微陣列(tissuemicroarray,TMA體積小，信息量大，可根據要求進行組合高效快速低消耗地進行各種原位組織學觀察研究形態(tài)學、免疫組化、原位雜交、原位PCR較好的內對照及實驗條件可比性和重復性158體積小，信息量大，可根據要求進行組合63單獨或與基因芯片配套用于基因及其蛋白產物的分析和基因功能的研究基因探針的篩選及生物制劑的鑒定組織學、病理學實習教材外科病理縮微圖譜159單獨或與基因芯片配套用于基因及其64

直接法---熒光素直接標記已知的DNA探針間接法---非熒光標記物標記已知探針橋連一個熒光標記的抗體DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交間期細胞分裂中期染色體冷凍切片石蠟切片

3熒光原位雜交---FluorescenceISH,FISH1603熒光原位雜交---FluorescenceISH,

重復序列探針位點特異性探針全染色體探針大量商品化的熒光標記探針FISH廣泛應用成為可能161重復序列探針66

FDA批準FISH檢測HER2/c-erbB2實驗目的

評價預后基于阿霉素的化療選擇

幫助評價是否采取曲妥珠單抗(Herceptin,赫賽汀）治療IHC2+/3+患者，僅FISH陽性者對藥物有反應162FDA批準FISH檢測HER2/c-erbB267

FISH的應用

乳腺癌HER2基因診斷肺癌EGFR和HER2基因診斷膀胱癌無創(chuàng)性早期診斷和復發(fā)的早期檢測胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等腫瘤基因的分析研究163FISH的應用682001年12月31日,美國FDA批準FISH檢測HER2基因狀態(tài)用于乳腺癌診斷,以指導臨床治療HER2基因為紅色熒光，正常HER2拷貝數(shù)(1~5)CEP17為17號染色體著絲粒,為綠色熒光1642001年12月31日,美國FDA批準FISH檢測HER2

常規(guī)PCR是基因檢測的金標準基因突變檢測、測序的前期和基礎易受污染妨礙其臨床應用4即時熒光定量PCR---Real-timePCR165常規(guī)PCR是基因檢測的金標準4即時熒光定量PCR---R

Real-timePCR

靈敏、定量、特異、封閉無污染提供了對PCR產物積累過程實時監(jiān)測微生物病原檢測、腫瘤生物學標志物臨床應用前景寬廣將逐漸成為病理學必備技術之一166Real-timePCR71

comparativegenomichybridization,CGH分子細胞遺傳學技術單一的一次雜交檢測某一腫瘤整個基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化

5比較基因組雜交167comparativegenomichybridiza

CGH的優(yōu)點

實驗所需樣本DNA量較少外周血、培養(yǎng)細胞、新鮮組織、存檔組織全基因組范圍內分析腫瘤染色體不平衡發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因所在區(qū)域腫瘤發(fā)病的分子機制研究168CGH的優(yōu)點實驗所需樣本DNA量較少73

CGH的局限性

所能檢測到的最小的DNA擴增或丟失在3-5Mb，對于低水平的DNA擴增和小片斷丟失可能漏檢相關染色體拷貝數(shù)無變化時，不能檢測出平行染色體的易位169CGH的局限性所能檢測到的最小的DNA擴增或丟失在3

lasercapturemicrodissection，LCM從組織切片或細胞涂片上的任一區(qū)域切割數(shù)百、數(shù)十、單個細胞再進行PCR、PCR-SSCP、CGH等冷凍切片、石蠟切片、細胞涂片先常規(guī)或免疫組化染色進行定位

6激光捕獲顯微切割術170lasercapturemicrodi