精液的質(zhì)量控制陸金春

按照WHO5規(guī)范化評(píng)估男性生育力:

精液分析的質(zhì)量控制

陸金春武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院

1主要內(nèi)容QC的概念精液分析QC的重要性質(zhì)量控制的過程精子濃度、活力及形態(tài)學(xué)分析的質(zhì)量控制精漿生化檢測(cè)的質(zhì)量控制抗精子抗體檢測(cè)的質(zhì)量控制質(zhì)量控制的實(shí)施措施2

質(zhì)量控制（QC）

即質(zhì)量管理。實(shí)驗(yàn)室為了達(dá)到質(zhì)量的要求，自行或由權(quán)威部門建立觀察分析步驟的變異性，隨時(shí)評(píng)估檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的一系列相關(guān)制度。

目的：尋找和發(fā)現(xiàn)檢測(cè)分析過程中的誤差和產(chǎn)生誤差的原因，保持檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的穩(wěn)定。

是達(dá)到質(zhì)量保證（QA）的一種手段3QC的分類內(nèi)部質(zhì)量控制（IQC）：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部所進(jìn)行的QC。監(jiān)測(cè)精確性，并通過控制限外的結(jié)果提示分析可能有缺陷。實(shí)施IQC的一種方式是將IQC材料與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作一起檢測(cè)，以使用質(zhì)控圖表監(jiān)測(cè)這些材料的結(jié)果。外部質(zhì)量控制（EQC）：不同的實(shí)驗(yàn)室就同一樣本進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。EQC允許一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果與其他實(shí)驗(yàn)室比較。其允許不同方法被評(píng)估，并以一定規(guī)格比較，其不可能僅在單一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。4QC的重要性

保證不同時(shí)間同一實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果的一致性；保證不同實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果的可比性5

質(zhì)量控制過程

分析前質(zhì)量控制：精液樣本的留取、接受、編號(hào)、保存等分析中質(zhì)量控制：精液分析過程中的質(zhì)控措施，如質(zhì)控品、SOP、95%可信區(qū)間等分析后質(zhì)量控制：報(bào)告的正確發(fā)出至臨床醫(yī)生做出診斷61.禁欲時(shí)間因素待做精液常規(guī)檢查者的禁欲天數(shù)規(guī)定為2-7天。

2.精液收集的完整性因素推薦采用廣口容器為采精器皿，保證精液沒有丟失。3.精液體積測(cè)量的準(zhǔn)確性因素采用5版推薦的天平稱重法計(jì)算精液體積（推薦使用自動(dòng)去皮的精密度達(dá)0.01g的天平），這是獲得一次射精的精子總數(shù)的關(guān)鍵步驟。分析前質(zhì)量控制74.雜質(zhì)的干擾因素使用第5版推薦的相差顯微鏡，相差顯微鏡這種高級(jí)光學(xué)系統(tǒng)能使精液中的大部分雜質(zhì)與精子區(qū)分，使精子頭部發(fā)光，雜質(zhì)顯示為灰色，這樣可以過濾大部分的雜質(zhì)。5.計(jì)數(shù)板間隙的準(zhǔn)確性因素

計(jì)數(shù)板間隙對(duì)濃度檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性的影響巨大，常使誤差達(dá)50%以上。計(jì)數(shù)板的深度按照5版要求每6~12個(gè)月必須校準(zhǔn)一次。分析前質(zhì)量控制8我們使用FilmetricsF20間隙測(cè)量?jī)x分別對(duì)Makler（單池，19塊）、Macro（單池，32塊）、Geoffrey（雙池，34塊）、Glodcyto（四池，20塊）、Leja（八池，20塊）和Cell-VU（雙池，20塊）等6種精子計(jì)數(shù)池的深度進(jìn)行精確測(cè)量，計(jì)算出每個(gè)計(jì)數(shù)池的平均深度、極差和變異系數(shù)（CV）以及每種計(jì)數(shù)池的平均深度、偏差及合格率。

實(shí)驗(yàn)一9不論是10μm深的計(jì)數(shù)池（Makler、Macro、Geoffrey）還是20μm深的計(jì)數(shù)池(Glodcyto、Leja、Cell-VU)，沒有一種精子計(jì)數(shù)池的深度是100%的合格。Makler、Macro和Geoffrey計(jì)數(shù)池的深度分別為（12.72±1.08）、（10.19±0.48）和（10.00±0.28）μm，Glodcyto、Leja和Cell-VU計(jì)數(shù)池的深度分別為（23.76±2.15）、（20.49±0.22）、（24.22±2.58）μm。Geoffrey計(jì)數(shù)池的合格率最高，為94.12%，其次為Macro（65.63%）和Leja（35%）計(jì)數(shù)池，其余三種計(jì)數(shù)池的合格率均為0。10我們們利利用用Filmetrics間間隙隙測(cè)測(cè)量量?jī)x儀精精確確測(cè)測(cè)量量5種種不不同同深深度度的的Geoffrey精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池，，然然后后按按照照WHO5手手冊(cè)冊(cè)的的要要求求利利用用CASA分分析析高高[標(biāo)標(biāo)稱稱值值為為50××106/ml]、、低低濃濃度度[標(biāo)標(biāo)稱稱值值為為30××106/ml]的的質(zhì)質(zhì)控控珠珠的的濃濃度度，，以以及及31例例精精液液標(biāo)標(biāo)本本的的精精子子濃濃度度。。并并分分析析不不同同精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池深深度度所所得得結(jié)結(jié)果果的的相相關(guān)關(guān)性性、、相相對(duì)對(duì)偏偏差差以以及及校校正正系系數(shù)數(shù)。。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)二二115種種精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池的的深深度度分分別別為為8.1、、9.1、、10.2、、11.1、、11.9μμm。。不不同同深深度度的的精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)的的低低、、高高濃濃度度質(zhì)質(zhì)控控珠珠濃濃度度結(jié)結(jié)果果均均有有顯顯著著差差異異（（P<0.01）），，但但低低、、高高濃濃度度質(zhì)控控珠珠濃濃度度與與計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池深深度度均均呈呈顯顯著著正正相相關(guān)關(guān)（r均為為0.997，，P均<0.01））。。以以10.2μμm的的計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)板板為為基基準(zhǔn)準(zhǔn)（（100%）），，5種種計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)板板深深度度的的相應(yīng)應(yīng)校校正正系系數(shù)數(shù)分別別為為：：1.26（（10.2/8.1））、、1.12（（10.2/9.1））、、1.00（（10.2/10.2））、、0.92（（10.2/11.1））和和0.86（（10.2/11.9）），，校校正正后后的的各各計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池相相對(duì)對(duì)偏偏差差均均低低于于5%。。31例例精精液液標(biāo)標(biāo)本本用用不不同同深深度度的的精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池進(jìn)進(jìn)行行檢檢測(cè)測(cè)，，精精子子濃濃度度結(jié)結(jié)果果類類似似于于質(zhì)質(zhì)控控珠珠懸懸液液。。12在精精子子濃濃度度分分析析中中，，精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池的的深深度度非非常常關(guān)關(guān)鍵鍵，，使使用用不不合合格格的的計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)板板，，將將導(dǎo)導(dǎo)致致檢檢測(cè)測(cè)結(jié)結(jié)果果產(chǎn)產(chǎn)生生誤誤差差，，這種種誤誤差差和和計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)板板深深度度誤誤差差成成正正比比。因因此此，，精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)板板深深度度應(yīng)應(yīng)該該進(jìn)進(jìn)行行定定期期校校驗(yàn)驗(yàn)，，并并應(yīng)應(yīng)以以相相應(yīng)應(yīng)的的校正正系系數(shù)數(shù)對(duì)檢檢測(cè)測(cè)結(jié)結(jié)果果進(jìn)進(jìn)行行糾糾正正。。13我們們利利用用Filmetrics間間隙隙測(cè)測(cè)量量?jī)x儀精精確確測(cè)測(cè)量量4種種不不同同深深度度的的Geoffrey精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池，，然然后后按按照照WHO5手手冊(cè)冊(cè)的的要要求求利利用用CASA系系統(tǒng)統(tǒng)分分析析36例例精精液液標(biāo)標(biāo)本本的的前前向向運(yùn)運(yùn)動(dòng)動(dòng)精精子子百百分分率率（（PR））、、非非前前向向運(yùn)運(yùn)動(dòng)動(dòng)精精子子百百分分率率（（NP））和和總總活活動(dòng)動(dòng)率率（（PR+NP）），，并并進(jìn)進(jìn)行行比比較較分分析析。。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)三三144種種精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)池池的的深深度度分分別別為為9.8、12.7、、15.7和和19.9μm，，測(cè)測(cè)得得的的PR分分別別為為（（44.00±±11.63））%、、（（41.96±±12.62））%、、（（40.86±±11.71））%和和（（37.78±±11.38））%，，NP分分別別為為（（13.54±±3.01））%、、（（14.13±±2.94））%、、（（14.91±±3.02））%和和（（16.53±±2.77））%，，總總活活動(dòng)動(dòng)率率分分別別為為（（57.53±±11.06））%、、（（56.08±±11.97））%、、（（55.78±±11.55））%和和（（54.31±±12.11））%。。精精子子計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)板板深度與PR呈呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)（r=-0.993，P<0.05）），與NP呈顯著著正相關(guān)（r=0.989，P<0.05）），與活動(dòng)率率呈顯著負(fù)相相關(guān)（r=-0.978，P<0.05））。盡管精子子總活動(dòng)率在在4種不同深深度的計(jì)數(shù)池池之間沒有顯顯著差異，但但PR和NP在在9.8μμm深的計(jì)數(shù)數(shù)池和19.9μm深深的計(jì)數(shù)池之之間均有顯著著性差異（P<0.05））。15精子計(jì)數(shù)池的的深度對(duì)精子子活力的影響響不容忽視，，不同深度計(jì)計(jì)數(shù)池獲得的的結(jié)果差異將將會(huì)給臨床醫(yī)醫(yī)生對(duì)患者做做出正確的診診斷（如弱精精子癥）和采采取合適的治治療措施帶來來一定的負(fù)面面影響。不同深度的精精子計(jì)數(shù)池應(yīng)應(yīng)有相應(yīng)的精精子活力正常常參考值范圍圍。166.檢測(cè)時(shí)間和和液化程度的的影響檢查精子活力力，必須在精精液完全液化化后進(jìn)行，最最好在60分鐘以內(nèi)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，以以防止脫水、、pH值或溫溫度的變化對(duì)對(duì)精子活力的的有害影響。。對(duì)射出60分分鐘后仍沒有有完全液化的的精液，必須須采取措施促促使其液化，，常用的方法法是用注射器器連接18號(hào)號(hào)鈍性針頭反反復(fù)緩慢抽吸吸，或加入等等體積的培養(yǎng)養(yǎng)液用加樣器器反復(fù)吹打，，也可以使用用菠蘿蛋白酶酶消化。分析前質(zhì)量控控制17分析前質(zhì)量控控制7.充分混勻后后取樣為確保獲得可可重復(fù)的數(shù)據(jù)據(jù)，在取樣用用于檢測(cè)前，，應(yīng)充分混勻勻標(biāo)本。當(dāng)重重復(fù)取樣的結(jié)結(jié)果一致時(shí)才才能認(rèn)可此測(cè)測(cè)定值?；靹蚓簳r(shí)不不要太劇烈震震蕩而產(chǎn)生氣氣泡。不要在在漩渦震蕩器器上高速混勻勻，這樣會(huì)損損傷精子。建議使用盤式式混勻器或三三維混勻器。。18精子濃度分析析的質(zhì)量控制制19分析精子數(shù)為了獲得可接接受的較低的的吸樣誤差，，每次至少分析200條精子評(píng)價(jià)相同的計(jì)計(jì)數(shù)池兩次，，或評(píng)價(jià)從單單一稀釋液充充兩次的池都都不是真正的的重復(fù)，由于于其不能反映映吸樣、混合合和稀釋的誤誤差20通過評(píng)估更多多精子可以減減小取樣誤差差，但需權(quán)衡衡增加精確度度與時(shí)間花費(fèi)費(fèi)及因檢測(cè)人人員疲勞導(dǎo)致致準(zhǔn)確性下降降之間的利弊弊。當(dāng)至少計(jì)數(shù)400個(gè)精子子時(shí)，抽樣誤誤差相對(duì)較小小，約5%。。精子計(jì)數(shù)與取取樣誤差21稀釋兩份標(biāo)本本，分別計(jì)數(shù)數(shù)，可接受差差異見下表22表示存在計(jì)數(shù)數(shù)錯(cuò)誤或者取取樣誤差，或或者精液未充充分混勻，以以及在計(jì)數(shù)池池上精子未隨隨機(jī)分布。此此時(shí)需要放棄棄第一次的兩兩個(gè)值并重復(fù)復(fù)評(píng)估（不要要計(jì)數(shù)第三個(gè)個(gè)樣本，取3個(gè)值的平均均值，或者取取3個(gè)值中最最相近的兩個(gè)個(gè)值的平均值值）。對(duì)一些不常見的的精液標(biāo)本，如非均質(zhì)的的精液標(biāo)本，，甚至取第三三批重復(fù)樣本本仍不能獲得得可接受差異異值。在這種種情況下，計(jì)計(jì)算所有重復(fù)復(fù)樣本的平均均值，并記錄錄在報(bào)告中。。當(dāng)計(jì)數(shù)結(jié)果大大于可接受差差異23不同類型標(biāo)本本的處理方法法高濃度精液標(biāo)標(biāo)本運(yùn)用CASA分析時(shí)，精精子濃度高于于50×106/ml的標(biāo)本本，由于精子子之間的相互互碰撞，會(huì)影影響CASA的分析質(zhì)量量，為了保證證CASA對(duì)對(duì)于濃度分析析的準(zhǔn)確性，，可對(duì)標(biāo)本進(jìn)進(jìn)行稀釋。一般儀器對(duì)于于50×106/ml—100×106/ml濃度度的標(biāo)標(biāo)本能能夠進(jìn)進(jìn)行分分析，，但準(zhǔn)準(zhǔn)確性性不高高，要要發(fā)表表論文文或者者質(zhì)控控要求求高的的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室最最好對(duì)對(duì)高于于50×106/ml的標(biāo)標(biāo)本進(jìn)進(jìn)行稀稀釋。。濃度超超過100×106/ml的標(biāo)標(biāo)本必必須進(jìn)進(jìn)行稀稀釋24精子活活力分分析的的質(zhì)量量控制制25CASA較較人工工分析析的優(yōu)優(yōu)勢(shì)用CASA（計(jì)算算機(jī)輔輔助精精液分分析））分析析精子子活力力，較較人工工方法法具有有兩大大優(yōu)勢(shì)勢(shì)：高精確確性和提供精精子動(dòng)動(dòng)力學(xué)學(xué)參數(shù)數(shù)的量量化數(shù)數(shù)據(jù)（前向向運(yùn)動(dòng)動(dòng)和超超活化化運(yùn)動(dòng)動(dòng)，即即獲能能精子子特征征參數(shù)數(shù)）。。CASA分析視頻記記錄的功能能更容容易實(shí)實(shí)現(xiàn)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化化和更更好地地實(shí)施施質(zhì)量量保證證程序序。26WHO第5版對(duì)對(duì)評(píng)估估精子子活力力的溫度條件非非常重重視，，要求求每個(gè)個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室都都必須須標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)化。。雖然然室溫溫和37℃℃都可可取，，但我我國(guó)幅幅員遼遼闊，，各地地氣溫溫相差差很大大，室室內(nèi)保保溫條條件各各不相相同，，唯有有統(tǒng)一一37℃的的恒溫溫標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)才能能使檢檢測(cè)結(jié)結(jié)果可可以比比較。。WHO第5版提提出：：在37℃℃評(píng)估估精子子活力力，保保溫板板（計(jì)數(shù)板板）應(yīng)預(yù)預(yù)熱10分分鐘。。最好好在帶帶有恒溫載載物臺(tái)臺(tái)的顯微微鏡下下進(jìn)行行檢查查。同同時(shí)標(biāo)本也必須須在相相同的的溫度度下孵孵育。。27分析時(shí)時(shí)要注注意的的細(xì)節(jié)節(jié)1.加樣后后應(yīng)靜靜置5~15秒再檢檢查，，避免免液體體流動(dòng)動(dòng)（漂漂移））影響響判斷斷。但但最好好在10分分鐘內(nèi)內(nèi)檢查查完畢畢，防防止溫溫度變變化和和脫水水等因因素對(duì)對(duì)精子子活力力的影影響。。2.為防止止干燥燥影響響觀察察精子子活力力的效效果，，應(yīng)在在距離離蓋玻玻片（（實(shí)際際可檢檢查范范圍））邊緣緣至少5mm的區(qū)區(qū)域觀察精精子。。3.為了避避免重重復(fù)觀觀察相相同的的區(qū)域域，最最好根根據(jù)精精子濃濃度利利用網(wǎng)網(wǎng)格事事先隨機(jī)選選擇視視野。在視視野中中界定定的區(qū)區(qū)域內(nèi)內(nèi)要評(píng)評(píng)估所所有精精子的的活力力。28活力質(zhì)質(zhì)控必必須解解決的的問題題1.檢檢測(cè)全全程要要采取取有效效的保保溫措措施，，使檢檢測(cè)標(biāo)標(biāo)本保保持在在37℃。。2.必必須使使用高高幀速速率CCD實(shí)時(shí)時(shí)記錄錄精子子運(yùn)動(dòng)動(dòng)的連連續(xù)軌軌跡。。3.規(guī)規(guī)定計(jì)計(jì)數(shù)板板的間間隙標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，，統(tǒng)一一精子子的運(yùn)運(yùn)動(dòng)條條件。。4.利利用視視頻錄錄像（（包括括刻錄錄軟件件和光光盤））進(jìn)行行可重重復(fù)的的人工工評(píng)估估。5.高高濃度度樣本本要稀稀釋。。29精子形形態(tài)學(xué)學(xué)分析析的質(zhì)質(zhì)量控控制30精子形形態(tài)學(xué)學(xué)分析析操作作的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化化精子形形態(tài)學(xué)學(xué)分析析過程程中的的所有有操作作步驟驟都可可能影影響精精子形形態(tài)學(xué)學(xué)分析析的結(jié)結(jié)果，，如精精液樣樣本的的洗滌滌、制制片、、固定定、染染色方方法、、顯微微鏡質(zhì)質(zhì)量、、自動(dòng)動(dòng)化分分析系系統(tǒng)的的質(zhì)量量等。31正常形態(tài)精精子判斷標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的一致致性精子頭外形形上應(yīng)該是是光滑、輪輪廓規(guī)則，，大體上呈橢圓形形，頂體區(qū)區(qū)可清晰分分辨，占頭頭部的40%~70%，沒有大空空泡，并且且不超過2個(gè)小空泡泡，空泡大大小不超過過頭部的20%，頂頂體后區(qū)不不含任何空空泡中段應(yīng)該細(xì)細(xì)長(zhǎng)、規(guī)則則，大約與與頭部長(zhǎng)度度相等，中中段主軸應(yīng)應(yīng)與頭部長(zhǎng)長(zhǎng)軸成一條條直線，殘殘留胞漿不不超過精子子頭大小的的1/3；；主段應(yīng)該比比中段細(xì)，，均一，長(zhǎng)長(zhǎng)約45um，可以自身卷卷曲成環(huán)狀狀，尾部沒有有顯示鞭毛毛折斷的銳銳利折角。。32α葡糖苷酶酶、ACP、Zn、、果糖等嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)操作程序序（SOP）標(biāo)準(zhǔn)液的吸吸光度相對(duì)對(duì)恒定或定定標(biāo)室內(nèi)質(zhì)控品品（每次與與樣本同時(shí)時(shí)檢測(cè)）精漿生化檢檢測(cè)的質(zhì)量量控制33抗精子抗體體檢測(cè)的質(zhì)質(zhì)量控制嚴(yán)格的SOP（加樣樣、稀釋、、洗滌、孵孵育時(shí)間等等）每次帶有陰陰、陽(yáng)性對(duì)對(duì)照準(zhǔn)備兩種試試劑，陽(yáng)性性樣本復(fù)核核陽(yáng)性判斷標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)34QC的實(shí)施施措施35QC樣本來源購(gòu)買——比比較貴、缺缺乏，有靶靶值實(shí)驗(yàn)室制備備——費(fèi)用用低，靶值值未知精子濃度QC樣本：：乳膠珠、保保存時(shí)間、、聚集精子形態(tài)學(xué)學(xué)QC樣本本：固定或染色色玻片精子活動(dòng)率率QC樣本本：錄像帶、DVD視頻頻、網(wǎng)格膠膠片精漿生化和和AsAb的QC樣樣本：中、低值精精漿，陽(yáng)性性精漿36QC圖——Xbar圖圖37QC圖的基基本控制規(guī)規(guī)則一個(gè)結(jié)果在在控制線之之外隨機(jī)誤差3個(gè)點(diǎn)中的的2個(gè)在警警告線之外外系統(tǒng)誤差5個(gè)點(diǎn)中的的4個(gè)在警警告線之外外系統(tǒng)誤差兩個(gè)連續(xù)的的結(jié)果均在在上或下控控制線之外外系統(tǒng)誤差兩個(gè)連續(xù)的的結(jié)果一個(gè)個(gè)在上控制制線外，一一個(gè)在下控控制線外隨機(jī)誤差8個(gè)連續(xù)的的結(jié)果均在在均值上或或下系統(tǒng)誤差38失控的原因因樣本不恰當(dāng)當(dāng)?shù)幕靹颍ǎǔＲ娪谡?/p>