2.2動物細(xì)胞工程課件

2.2動物細(xì)胞工程2.2動物細(xì)胞工程生產(chǎn)單克隆抗體常用技術(shù)手段動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞核移植動物細(xì)胞融合

動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。動物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段技術(shù)：

從動物機(jī)體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)1、動物細(xì)胞培養(yǎng)的概念動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)過程1、選材：

動物胚胎或幼齡動物的組織、器官它們細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。2.將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞將組織塊剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理一段時間，這樣組織就會分三成單個細(xì)胞。思考：為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞？①單個細(xì)胞容易和周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換——獲得營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等，排出代謝廢物；②分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)能使細(xì)胞水平操作的其他技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。

1.進(jìn)行動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？P44旁欄用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。不能用胃蛋白代替因?yàn)閮烧叩淖钸mpH不同，動物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的pH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（最適pH

2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(最適pH

7.2-8.4)的活性較高。胰蛋白酶真的不會把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？P44尋根問底胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細(xì)胞膜蛋白，對細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。動物組織單個細(xì)胞細(xì)胞懸液貼壁生長分瓶培養(yǎng)10代細(xì)胞50代細(xì)胞不死細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶剪碎加培養(yǎng)液接觸抑制少數(shù)癌變少數(shù)3.配制細(xì)胞懸液，進(jìn)行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)1、細(xì)胞貼壁：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。要求：

培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。2、細(xì)胞的接觸抑制：當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。

細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)4.如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖⑴原代培養(yǎng):

將動物組織消化后的初次培養(yǎng)。⑵傳代培養(yǎng):

對貼滿瓶壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，然后再分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。動物組織塊細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細(xì)胞幼齡動物的器官組織；動物胚胎動物細(xì)胞培養(yǎng)過程細(xì)胞貼壁接觸抑制原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)加入培養(yǎng)液用胰蛋白酶等處理貼壁細(xì)胞適宜條件不死性細(xì)胞

多細(xì)胞動物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識，思考以下問題：1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時需要提供哪些物質(zhì)？

2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？

P46討論充足營養(yǎng)（糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素等合成成分及血清、血漿等天然成分。）適宜溫度、PH和氣體環(huán)境；無菌無毒環(huán)境

無菌無毒環(huán)境、充足營養(yǎng)（血清或血漿）、適宜溫度、PH、氣體環(huán)境。4、體外培養(yǎng)動物細(xì)胞需要物質(zhì)和環(huán)境條件⑴無菌、無毒的環(huán)境①對培養(yǎng)液、培養(yǎng)用具進(jìn)行無菌處理；②在培養(yǎng)液中加抗生素；③定期更換培養(yǎng)液。⑵充的營足養(yǎng)葡萄糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素、血漿或血清為什么要加血清呢？⑶溫度和PH36.5±0.5℃；PH=7.2―7.4⑷氣體環(huán)境——O2和CO2

C02的主要作用是維持培養(yǎng)液的PH。含95%空氣加5%CO2

混合氣體1、大規(guī)模的生產(chǎn)生物制品。2、培養(yǎng)的動物細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞。3、檢測判斷物質(zhì)的毒性。4、培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變的細(xì)胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，如用于

等，為

及其他疾病提供理論依據(jù)。5.動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用：篩選抗癌藥物治療和預(yù)防癌癥植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖動物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細(xì)胞培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白二.動物細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物

將動物的一個細(xì)胞核，移入一個已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成為一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體（克隆動物）。

分類胚胎細(xì)胞核移植：體細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易；細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性不容易1.動物細(xì)胞核移植概念：（難度高）(二)、體細(xì)胞核移植的過程：請看教材P48圖2-21思考：1.核移植的受體細(xì)胞是什么？處在什么時期？用此細(xì)胞作為受體細(xì)胞有什么好處？2.通過什么手段激活受體細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎？MⅡ中期卵母細(xì)胞誘導(dǎo)方法：物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。卵母細(xì)胞體積大，便于操作；含有營養(yǎng)物質(zhì)豐富，提供早期胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)；含有激活細(xì)胞核體現(xiàn)全能性的物質(zhì)。電激處理使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞構(gòu)建重組胚胎卵母細(xì)胞采集、培養(yǎng)MⅡ期卵母細(xì)胞供體牛供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞代孕母?？寺∨ｓw細(xì)胞培養(yǎng)去核卵母細(xì)胞去核胚胎移植體細(xì)胞核移植過程

（體細(xì)胞克隆動物）１、在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？為使核移植動物的遺傳物質(zhì)全部來自有利用價值的動物提供的細(xì)胞。２、用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，為什么？10代以內(nèi)的細(xì)胞一般保持正常二倍體的核型，未發(fā)生突變思考題3、體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？不是，克隆動物絕大部分DNA來自供體細(xì)胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來自受體卵母細(xì)胞思考題

1996年，英國人IanWilmut成功獲得體細(xì)胞克隆羊“多利”，這是世界上第一例利用成年體細(xì)胞核獲得的克隆動物.277次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個發(fā)育為8細(xì)胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。多莉羊的培育過程“多莉羊”是雄還是雌？是否符合孟德爾遺傳？問題卵細(xì)胞C母綿羊子宮Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細(xì)胞卵細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵細(xì)胞妊娠3.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景：1.加速家畜遺傳改良的進(jìn)程2.保護(hù)瀕危物種3.

生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植4.了解胚胎發(fā)育和衰老過程；追蹤研究疾病的發(fā)展過程和治療疾病3、體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題P50（1）成功率非常低（2）克隆動物以表現(xiàn)早衰、生理缺陷等健康問題成功率低，絕大多數(shù)克隆動物存在健康問題并表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷：如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。思考與探究1.幼齡與老齡動物的組織細(xì)胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細(xì)胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？

細(xì)胞的衰老與動物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細(xì)胞比老年動物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。思考與探究2.動物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？動物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力要想使培養(yǎng)的動物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。（1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請說明理由?？梢浴１R辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對它進(jìn)行克隆？從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易取）上剪取一小塊組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。4.體細(xì)胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。研究方面：克隆動物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。應(yīng)用上：生產(chǎn)克隆動物費(fèi)用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。知識拓展2.為什么動物細(xì)胞要分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)？用酶消化的是什么物質(zhì)？

細(xì)胞原代培養(yǎng)時可以分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用細(xì)胞群（團(tuán)）、組織塊培養(yǎng)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，最終都為細(xì)胞培養(yǎng)。分散成單個細(xì)胞、細(xì)胞群（團(tuán)）后容易培養(yǎng)，細(xì)胞所需的營養(yǎng)容易供應(yīng)，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養(yǎng)時，內(nèi)部細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細(xì)胞在體外長時間的生存和生長就較困難。同時，分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)，可使得在細(xì)胞水平操作的其他技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。用酶消化的是細(xì)胞間基質(zhì)，細(xì)胞間基質(zhì)主要成分有膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、彈性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，從而使細(xì)胞相互分離。知識拓展3.體細(xì)胞核移植技術(shù)為什么要選擇MⅡ期的卵母細(xì)胞做受體細(xì)胞？

細(xì)胞核移植技術(shù)中能用作受體細(xì)胞的通常有MⅡ期卵母細(xì)胞和受精卵（合子）。早期核移植技術(shù)中常用受精卵，后來基本上用MⅡ期卵母細(xì)胞取代了受精卵，主要因?yàn)閮烧叩募?xì)胞質(zhì)環(huán)境不同。有人認(rèn)為重組需要的因子存在于MⅡ期卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，而在原核形成時這些因子已被降解或用光，因此，原核擴(kuò)張后受精卵去核可引起胞質(zhì)中重組因子缺乏。成熟促進(jìn)因子（MPF）是卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中重要的胞質(zhì)影響因子，MPF的活性在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的MI期和MⅡ期達(dá)到最高，受精或