日本島津UV分光光度計操作培訓

山東安和安全技術研究院有限公司檢測部Tel:(0543)3065070E_mail:bzsah20110801@163.com島津UV2550紫外/可見分光光度計操作培訓?2?紫外-可見吸收光譜?吸收光譜的測量-----Lambert-Beer定律?紫外-可見分光光度計儀器組成?分析條件選擇?UV-Vis分光光度法的應用?紫外-可見分光光度計的維護和保養(yǎng)?UV-Vis方法是分子光譜方法，它利用分子對外來輻射的吸收特性。?UV-Vis涉及分子外層電子的能級躍遷；光譜區(qū)在160~780nm.?UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光譜(UV)為四大波譜之一，是鑒定許多化合物，尤其是有機化合物的重要定性工具之一。目錄3ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可見吸收光譜4ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited4電磁波譜g-X-射線紫外可見紅外微波無線電2004008003200(nm)波長真空紫外近紅外核磁共振波長越短，能量越高5ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited5一、分子吸收光譜的形成1.過程：運動的分子外層電子--------吸收外來外來輻射------產(chǎn)生電子能級躍遷-----分子吸收譜。??h*MhMt0II???????基態(tài)E0激發(fā)態(tài)E1DE=E1-E0=h?能量激發(fā)e能量差DE6ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited62.能級組成：除了電子能級(Electronenergylevel)外，分子吸收能量將伴隨著分子的振動和轉動，即同時將發(fā)生振動(Vibration)能級和轉動(Rotation)能級的躍遷！據(jù)量子力學理論，分子的振-轉躍遷也是量子化的或者說將產(chǎn)生非連續(xù)譜。因此，分子的能量變化DE為各種形式能量變化的總和：其中DEe最大：1-10eV;DEv次之：0.05-1eV;DEr最?。?0.05eVrveΔΕΔΕΔΕΔΕ???7ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited7能級躍遷示意圖?電磁波與分子相互作用時產(chǎn)生能級躍遷：能級振動能級躍遷轉動能級躍遷v1v2v0543210電子能級躍遷E1E0v0v1v2E=h?其中h為普朗克常數(shù)(6.626×10-34焦耳·秒）?為頻率8ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited8各軌道能級高低順序：????n??*??*；可能的躍遷類型：?-?*；?-?*；?-?*；n-?*；?-?*；n-?*9ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited9?-?*：C-H共價鍵，如CH4（115nm）；C-C鍵，如C1H6(135nm)，處于真空紫外區(qū)；?-?*:和?-?*躍遷：盡管所需能量比上述?-?*躍遷能量小，但波長仍處于真空紫外區(qū)；n-?*：含有孤對電子的分子，如H1O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl(173nm);CH3I(158nm)；(CH3)1S(119nm)；(CH3)1O(184nm)CH3NH1(115nm)；(CH3)3N(117nm)，可見，大多數(shù)波長仍小于200nm，處于近紫外區(qū)。以上四種躍遷都與?成鍵和反鍵軌道有關（?-?*，?-?*，?-?*和n-?*），躍遷能量較高，這些躍遷所產(chǎn)生的吸收譜多位于真空紫外區(qū)，因而在此不加討論。只有?-?*和n-?*兩種躍遷的能量小，相應波長出現(xiàn)在近紫外區(qū)甚至可見光區(qū)，且對光的吸收強烈，是我們研究的重點。10ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited10幾個概念：生色團（Chromogenesisgroup）：分子中含有非鍵或?鍵的電子體系，能吸收外來輻射時并引起n-?*和?-?*躍遷，可產(chǎn)生此類躍遷或吸收的結構單元，稱為生色團。助色團（Auxochromousgroup）：含有孤對電子，可使生色團吸收峰向長波方向移動并提高吸收強度的一些官能團，稱之為助色團。紅移或藍移（Redshiftorblueshift）：在分子中引入的一些基團或受到其它外界因素影響，吸收峰向長波方向（紅移）或短波方向移動（藍移）的現(xiàn)象。11ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited吸收光譜的測量Lambert-Beer定律12ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited12一、透射率T%入射光I0透射光I光程長b透射率T%=II0×100%13ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited13當入射光波長一定時，待測溶液的吸光度A與其濃度和液層厚度成正比，即k為比例系數(shù)，與溶液性質、溫度和入射波長有關。?當濃度以g/L表示時，稱k為吸光系數(shù)，以a表示，即?當濃度以mol/L表示時，稱k為摩爾吸光系數(shù)，以?表示，即?比a更常用。?越大，表示方法的靈敏度越高。?與波長有關，因此，?常以??表示。kbcA?abcA?bcA??14ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited14樣品吸光度A與光程b總是成正比。但當b一定時，A與c并不總是成正比，即偏離L-B定律！這種偏離由樣品性質和儀器決定。1.樣品性質影響a）待測物高濃度--吸收質點間隔變小—質點間相互作用—對特定輻射的吸收能力發(fā)生變化---?變化；b）試液中各組份的相互作用，如締合、離解、光化反應、異構化、配體數(shù)目改變等，會引起待測組份吸收曲線的變化；c）溶劑的影響：對待測物生色團吸收峰強度及位置產(chǎn)生影響；d）膠體、乳狀液或懸浮液對光的散射損失。三、偏離L-B定律的因素15ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited152.儀器因素儀器因素包括光源穩(wěn)定性以及入射光的單色性等。a）入射光的非單色性：不同光對所產(chǎn)生的吸收不同，可導致測定偏差。b）譜帶寬度與狹縫寬度：“單色光”僅是理想情況，經(jīng)分光元件色散所得的“單色光”實際上是有一定波長范圍的光譜帶(即譜帶寬度)。單色光的“純度”與狹縫寬度有關，狹縫越窄，它所包含的波長范圍越小，單色性越好。16ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可見分光光度計儀器組成17ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited17UV示意圖18ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited18紫外-可見光度計儀器由光源、單色器、吸收池和檢測器四部分組成。一、光源對光源基本要求：足夠光強、穩(wěn)定、連續(xù)輻射且強度隨波長變化小。1.鎢及碘鎢燈：340~1500nm，多用在可見光區(qū)；2.氫燈和氘燈：160~375nm，多用在紫外區(qū)。二、單色器(Monochromator)與原子吸收光度儀不同，在UV-Vis光度計中，單色器通常置于吸收池的前面?。煞乐箯姽庹丈湟鹞粘刂幸恍┪镔|的分解）三、吸收池(Cell，Container)：用于盛放樣品?？捎檬⒒虿Ａ煞N材料制作，前者適于紫外區(qū)和可見光區(qū)；后者只適于可見光區(qū)。有些透明有機玻璃亦可用作吸收池。四、檢測器：硅光電池、PMT、PDA19ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited19UV2550光路圖20ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited20分光光度計的校正當光度計使用一段時間后其波長和吸光度將出現(xiàn)漂移，因此需要對其進行校正。波長標度校正：使用鐠-釹玻璃（可見光區(qū)）和鈥玻璃（紫外光區(qū)）進行校正。因為二者均有其各自的特征吸收峰。吸光度標度校正：采用K2CrO4標準液校正（在15oC時，于不同波長處測定0.04000g/L的KOH溶液（0.05mol/L）的吸光度A，調整光度計使其A達到指定的吸光度。21ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited分析條件選擇22ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited22一、儀器測量條件由于光源不穩(wěn)定性、讀數(shù)不準等帶來的誤差。當分析高濃度的樣品時，誤差更大。由L-B定律：微分后得：將上兩式相比，并將dT和dc分別換為DT和Dc，得當相對誤差Dc/c最小時，求得T=0.368或A=0.434。即當A=0.434時，吸光度讀數(shù)誤差最?。⊥ǔ？赏ㄟ^調節(jié)溶液濃度或改變光程b來控制A的讀數(shù)在0.15~1.00范圍內。bcTA????lgbdcTdTTd????434.0lgTTTcclg434.0D?D23ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited23二、反應條件選擇1.顯色劑的選擇原則：使配合物吸收系數(shù)?最大、選擇性好、組成恒定、配合物穩(wěn)定、顯色劑吸收波長與配合物吸收波長相差大等。2.顯色劑用量：配位數(shù)與顯色劑用量有關；在形成逐級配合物，其用量更要嚴格控制。3.溶液酸度：配位數(shù)和水解等與pH有關。4.顯色時間、溫度、放置時間等。24ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited24三、參比液選擇1.溶劑參比：試樣組成簡單、共存組份少（基體干擾少）、顯色劑不吸收時，直接采用溶劑（多為蒸餾水）為參比；2.試劑參比：當顯色劑或其它試劑在測定波長處有吸收時，采用試劑作參比（不加待測物）；3.試樣參比：如試樣基體在測定波長處有吸收，但不與顯色劑反應時，可以試樣作參比（不能加顯色劑）。25ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited25四、干擾消除1.控制酸度：配合物穩(wěn)定性與pH有關，可以通過控制酸度提高反應選擇性，副反應減少，而主反應進行完全。如在0.5MH2SO4介質中，雙硫腙與Hg2+生成穩(wěn)定有色配合物，而與Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等離子生成的有色物不穩(wěn)定。2.選擇掩蔽劑3.合適測量波長4.干擾物分離5.導數(shù)光譜及雙波長技術26ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可見分光光度法的應用27ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited27一、定性分析不同物質結構不同或者說其分子能級的能量(各種能級能量總和)或能量間隔各異，因此不同物質將選擇性地吸收不同波長或能量的外來輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎。定性分析具體做法是讓不同波長的光通過待測物，經(jīng)待測物吸收后，測量其對不同波長光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A為縱坐標，輻射波長為橫坐標作圖，得到該物質的吸收光譜或吸收曲線，據(jù)吸收曲線的特性(峰強度、位置及數(shù)目等)研究分子結構。28ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited28?-胡羅卜素咖啡因阿斯匹林丙酮幾種化合物的分子吸收光譜圖29ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited29二、定量分析1.單組份定量方法1）標準曲線法(職業(yè)衛(wèi)生檢測中常用)：用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與待測組分相同的條件下，測量吸光度，用吸光度對樣品濃度繪制標準曲線標準曲線的斜率即為絕對校正因子。在測定樣品中的組分含量時，要用與繪制標準曲線完全相同的條件測量吸光度，然后根據(jù)吸光度在標準曲線上直接讀出樣品組分的濃度。2）標準對比法：該法是標準曲線法的簡化，即只配制一個濃度為cs的標準溶液，并測量其吸光度，求出吸收系數(shù)k，然后由Ax=kcx求出cx該法只有在測定濃度范圍內遵守L-B定律，且cx與cs大致相當時，才可得到準確結果。30ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited30二、定量分析步驟（標準曲線法）1.先開主機，然后再打開UVPROBE軟件；2.啟動UVPROBE以后，點擊界面下方“連接”進行儀器連接，儀器進行連接檢查，待檢查全部通過后，點擊“OK”3.點擊“光度測定”；4.點擊“方法”，波長設定為通過光譜檢測到所測樣品的最大吸收波長,然后加入波長，類型多選擇為“多點”，WL1=最大波長。點擊“下一步”，（注：根據(jù)所測樣品對相應的參數(shù)進行設定），“方法”設定完后，點擊“關閉”；5.將兩個空白參比放入光束吸收池架；6.點擊“自動調零”；7.雙擊標準表中的任意位置激活標準表，在表頭位置將顯示激活；31ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited318.點擊下拉菜單中的I-扣空白；9.在標準表中依次輸入標準系列ID；10.讀取標準樣品：將兩個空白參比放入光束吸收池架，點擊“自動調零”，然后放入樣品，輸入樣品濃度，依次進行“讀取”。樣品的濃度讀取完后，在“標準曲線”表中點擊“右鍵”-“屬性”中選擇“方程式”、“相關系數(shù)”，查看標準曲線；11.樣品讀?。狐c擊樣品表中的任意位置激活標準表，在表頭位置將顯示激活；12.在樣品表中輸入樣品ID，放入待測樣品，進行“讀取”。13.打印結果：點擊文件-打印-（選擇打印標準表或樣品表）14.關機：點擊操作界面“斷開”，然后關閉儀器電源，關閉操作軟件，關閉電腦，將比色皿倒扣放置保存。32ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited紫外-可見分光光度計的維護與保養(yǎng)33ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited33一、環(huán)境要求１、使用工作溫度：15～35℃，濕度：45～80%，如果溫度高于30℃，則濕度必須小于70%２、避免日光直射３、避免震動４、避免強磁場，電場５、遠離腐蝕性氣體，并避免置于任何可能導致紫外區(qū)吸收的含有機/無機試劑氣體的區(qū)域６、避免臟污、多塵環(huán)境34ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited34二、工作臺要求１、可承受壓力35Kg+25Kg（PC）２、最小尺寸：長：1