分子生物學實驗課件：4目的基因片段的回收

實驗四目的基因片段的回收克隆程序簡圖【實驗目的】了解瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA片段的幾種方法及其優(yōu)缺點學習采用玻璃纖維柱法回收目的片段已有20余種原始或衍生的方法可供選擇，但缺乏高效回收不同大小DNA的普遍實用方法

（1）透析袋電洗脫法（2）凍融法（3）玻璃粉法（4）低融點瓊脂糖凝膠法（羥乙基）幾種回收方法的介紹低融點瓊脂糖法凝膠制備回收方法的選擇原則：根據(jù)回收片段的大小、現(xiàn)有的試劑與器材、以及后處理的難易等選擇合適的回收方法。產(chǎn)物的純度未達標則嚴重影響以后的酶切、連接、標記等酶參與的反應產(chǎn)物的回收率否則增大前期工作量回收實驗中兩個最重要的技術指標玻璃纖維柱法快速回收DNA片段【實驗原理】利用特殊硅基質(zhì)材料，在一定高鹽（消除DNA和硅基質(zhì)的負電排斥）緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA的原理（DNA磷酸基團與基質(zhì)硅烷醇基團形成氫鍵），配備設計獨特的離心吸附柱式結構，快速高效回收DNA片段。1、電泳分離目的片段(電泳)配膠:1%瓊脂糖凝膠30mL(0.3g瓊脂糖+30ml的1TAE,熔解后加2μl的Goldviewna)(2人配一塊膠,使用2個大齒的梳子)制樣和點樣:點樣后，等待1分鐘，讓樣品在加樣孔中均勻分散(2人一組,所有酶切樣品上樣)電泳:110V電泳1小時至目的帶與載體帶徹底分開后,停止電泳并照相(對面實驗室),忽丟【實驗步驟】酶切樣品：每人的酶切樣品上一個樣品孔(大點樣孔)

50μl(或74μl)＋9μl10上樣緩沖液,混勻,Short,上樣DNAmarker：5μlDSTM5000

(小點樣孔)

A1,B1(50μl樣品)回收pET28a中的4.7kb片段A2,B2(74μl樣品)回收pEGFP-N3的0.7kb片段4.0kb0.7kb4.7kbA1,B1A2,B2pEGFP-N3pET28a2、目的片段凝膠的回收(切膠)紫外燈下切下目的帶(本實驗室后面)膠塊要盡可能小,盡量控制在100-200μl,否則影響回收率！將回收的凝膠切成盡可能小的塊,放入EP管中,做好標記12000rpm離心1分鐘估計膠體積溶膠:估計凝膠的體積,按照100μl膠加入500μl的溶膠液(Gel-lysisBuffer溶膠液,6MNaI)65℃水浴溶膠,其間偶爾搖動,至膠完全溶解(熔膠要充分)3、目的片段的純化(純化)裝柱:將溶液冷卻至室溫,裝柱(做標記),10000rpm離心30秒,濾液可以重新上柱,重復離心一次后棄濾液漂洗：500μL漂洗液(WashingBuffer漂洗液,含75%乙醇)漂洗,12000rpm離心30秒,去掉廢液重復漂洗：重復漂洗一次,棄廢液干燥：再12000rpm離心2min(離心要充分,徹底去除乙醇)洗脫:在柱子中央加入120μl洗脫緩沖液(elutionbuffer)或ddH2O,室溫放置2分鐘,轉入新的EP管中(標記),12000rpm離心1分鐘,收集濾液沉淀:向濾液中加入15μl的3MNaAC溶液,混勻,然后再加入270μl的無水乙醇,-20℃保存?zhèn)溆?下次實驗材料)2人一塊膠兩人一組分別回收載體及目的片段進行回收電泳時，往往需要在紫外燈下監(jiān)測。注意應使用長波紫外燈。因為短波紫外線（254nm）會引起DNA鏈斷裂，或是造成基因突變所有與回收片段接觸的試劑及器皿等都應進行滅菌處理，防止DNA酶的污染回收時的操作要輕柔，特別是大片段，