β型溶血性鏈球菌檢驗(yàn)

β型溶血性鏈球菌檢驗(yàn)主講人：王福紅動(dòng)物性食品微生物檢驗(yàn)

知識(shí)目標(biāo)：

理解溶血性鏈球菌的生物學(xué)特性。了解溶血性鏈球菌的致病性。掌握β型溶血性鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。

能力目標(biāo)：

會(huì)制備β型溶血性鏈球菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基。會(huì)對(duì)β型溶血性鏈球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。

鏈球菌系指一大類呈鏈狀排列的球菌，本菌廣泛分布于自然界，存在于水、乳、糞便以及人和動(dòng)物的病灶內(nèi)。健康的人和動(dòng)物的皮膚和粘膜上，呼吸道和消化道內(nèi)往往帶菌。引起各種化膿性炎癥，猩紅熱，丹毒，新生兒敗血癥，腦膜炎，產(chǎn)褥熱以及鏈球菌變態(tài)反應(yīng)性疾病等。溶血性鏈球菌根據(jù)鏈球菌在血液培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖后是否溶血及其溶血性質(zhì)分為三類甲型溶血（α-溶血）：菌落周圍有1-2mm寬的草綠色溶血環(huán)，也稱甲型溶血，這類鏈球菌多為條件致病菌。乙型溶血（β-溶血）：菌落周圍形成一個(gè)2-4mm寬、界限分明、完全透明的無(wú)色溶血環(huán)，也稱乙型溶血，因而這類菌亦稱為溶血性鏈球菌，該菌的致病力強(qiáng)，常引起人類和動(dòng)物的多種疾病。丙型溶血（γ-溶血）：不產(chǎn)生溶血素，菌落周圍無(wú)溶血環(huán)，也稱為丙型或不溶血性鏈球菌，該菌無(wú)致病性，常存在于乳類和糞便中，偶爾也引起感染。按蘭氏分類，鏈球菌可分為從A至V共20個(gè)血清群（其中缺I、J群）。每個(gè)群結(jié)合生化和培養(yǎng)特性又分為若干血清型或亞型。按菌體莢膜抗原不同，分為35個(gè)血清型。引起豬病并偶爾經(jīng)傷口感染人的鏈球菌主要有：D群的豬鏈球菌II型，F(xiàn)群的咽峽炎鏈球菌，L、R、S、T、U、V群鏈球菌等。1998年，我國(guó)江蘇南通地區(qū)發(fā)生的豬鏈球菌疫情，病人在發(fā)病前2日內(nèi)均與病、死豬或來(lái)源不明豬肉有直接接觸史，19人有屠宰病、死豬的歷史(占76.0％)；有3人有銷售豬肉史(占12.0％)；另有3人有洗、切死豬肉或剝豬頭皮史(占12.0％)。25人中有7例有明顯的手指皮膚破損史，有20例病家周圍有病、死豬的發(fā)生史。提示人類感染發(fā)病與病豬接觸密切相關(guān)。由于人們對(duì)豬鏈球菌認(rèn)識(shí)還不夠，且該菌的形態(tài)和生化特征易發(fā)生改變，給該菌的分離鑒定帶來(lái)很大的困難。據(jù)此，國(guó)外一些學(xué)者認(rèn)為該菌實(shí)際感染率比人們報(bào)道的要高得多。四川人-豬鏈球菌病疫情2005年6月24日四川資陽(yáng)市一戶人家養(yǎng)的豬突然死了一頭，這家人覺得一頭豬值幾百塊錢，扔掉可惜，于是把死豬肉吃掉。隨后，該戶人家就有人出現(xiàn)高燒、乏力、惡心、嘔吐等癥狀，被送到資陽(yáng)市第三人民醫(yī)院，成為第一例病人。6月12日、7月15日第二例、第三例病人出現(xiàn)。7月15日，院方向資陽(yáng)市疾控中心報(bào)告。7月18日資陽(yáng)市疾控中心向資陽(yáng)市政府報(bào)告，發(fā)現(xiàn)不明原因疾病。資陽(yáng)市在當(dāng)天啟動(dòng)了“突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急預(yù)案”，資陽(yáng)市第一人民醫(yī)院傳染科開辟出一個(gè)隔離病區(qū)，專門收治此類病人。7月24日四川正式公布病情，截至中午12時(shí)，已統(tǒng)計(jì)出累計(jì)發(fā)病80例，疑似13例，死亡19例，治愈出院4例。住院病例中，病危17例，病情趨于好轉(zhuǎn)40例。7月25日國(guó)家衛(wèi)生部和農(nóng)業(yè)部聯(lián)合發(fā)布新聞公告向外界公布調(diào)查結(jié)果。公告稱，四川不明原因疾病病因初步查明，是由豬鏈球菌引起的人——豬鏈球菌感染。7月26日，四川累計(jì)報(bào)告人感染豬鏈球菌病病例117例，其中實(shí)驗(yàn)室確診5例，臨床診斷71例，疑似41例。這些病例中，治愈出院5例，病危21例，死亡24例。據(jù)四川省衛(wèi)生廳報(bào)告，截至8月3日12時(shí)，四川省累計(jì)報(bào)告人感染豬鏈球菌病病例206例，其中實(shí)驗(yàn)室確診43例，臨床診斷122例，疑似41例。這些病例中，治愈出院26例，病危18例，死亡38例。7月23日，四川省資陽(yáng)市雁江區(qū)南津鎮(zhèn)，面對(duì)親人，不知病因的故去，家屬感到悲痛萬(wàn)分。醫(yī)生“全副武裝”地走進(jìn)傳染病病房

7月23日，四川省資陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，患者躺在該院的傳染病隔離病房?jī)?nèi)接受治療。

一、生物學(xué)特性形態(tài)與染色特性：革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、多數(shù)無(wú)莢膜。直徑為0.5～1um，常排列成鏈狀，鏈的長(zhǎng)短不一，短者由4～5個(gè)菌體組成，長(zhǎng)者可達(dá)20～30個(gè)甚至上百個(gè)。鏈的長(zhǎng)短與細(xì)菌種類及生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。致病性鏈球菌一般較長(zhǎng)，非致病性或毒力弱的菌株菌鏈較短，在液體培養(yǎng)基中易呈長(zhǎng)鏈，在固體培養(yǎng)基上常呈短鏈。豬肝臟鏈球菌豬鏈球菌革蘭氏染色培養(yǎng)特性：本菌為需氧或兼性厭氧，多數(shù)菌株的生長(zhǎng)溫度為20℃～42℃，最適溫度為37℃。D群的大多數(shù)菌株，低至10℃、高達(dá)45℃仍能生長(zhǎng)。N群菌株最適生長(zhǎng)溫度為30℃。本菌最適pH為7.4～7.6。培養(yǎng)特性：多數(shù)致病菌株的營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良，必須加血液、血清、腹水等，如培養(yǎng)基中加入0.5%葡萄糖則有助于細(xì)菌生長(zhǎng)。在含鮮血或血清的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，菌落細(xì)小，透明。對(duì)豬致病的各群菌均表現(xiàn)為β溶血（個(gè)別為α溶血）。甲型（α）溶血性鏈球菌灰色、針尖狀菌落、周圍有草綠色溶血環(huán)（α溶血）。乙型（β）溶血性鏈球菌菌落特征：灰白色、細(xì)小菌落、周圍有寬大透明溶血環(huán)（β溶血）。丙型（γ）鏈球菌

形成灰白色、半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直徑約0.5～0.75mm的細(xì)小菌落，無(wú)溶血環(huán)。甲鏈乙鏈丙鏈血平板菌落特征豬鏈球菌在羊血平板上的菌落形態(tài)

生化特性：對(duì)常用的糖類，發(fā)酵后產(chǎn)酸產(chǎn)氣。乳糖、甘露醇、水楊苷、薔薇醇的發(fā)酵能力因菌株不同而異。鏈球菌一般不分解菊糖（某些草綠色菌株例外），不被膽汁或10%膽鹽所溶解，這兩點(diǎn)可用來(lái)鑒別鏈球菌和肺炎雙球菌。多數(shù)A群鏈球菌能產(chǎn)生淀粉酶，不僅分解淀粉，也可水解肝糖和淀粉粘膠質(zhì)。腸鏈球菌可在6.5%氯化鈉葡萄糖肉湯、40%膽汁肉湯、pH9.6葡萄糖肉湯和0.1%美蘭牛乳培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，能在10℃和45℃下生長(zhǎng)，這幾點(diǎn)可作為腸鏈球菌和其他鏈球菌的鑒別試驗(yàn)?？乖匦裕烘溓蚓目乖瓨?gòu)造比較復(fù)雜。β型溶血性鏈球菌的抗原構(gòu)造可分為三種：核蛋白抗原（P抗原）：此種抗原無(wú)種、屬、型的特異性、各種鏈球菌的核蛋白的抗原性都是一致的，和肺炎球菌、葡萄球菌的核蛋白有互相交叉反應(yīng)。群特異性抗原（C抗原）：細(xì)胞壁的多糖成分，有特異性。根據(jù)群多糖抗原的不同，可將鏈球菌分成19個(gè)血清群。型特異性抗原（表面抗原）：鏈球菌細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)抗原，位于C抗原的外層。其中又分M、T、R、S等四種不同的抗原成分，與致病性有關(guān)的是M抗原。M抗原主要見于A群鏈球菌，根據(jù)M抗原的不同，可用血清學(xué)反應(yīng)將A群鏈球菌分為60多個(gè)型。抵抗力：鏈球菌抵抗力不強(qiáng)。60℃30分鐘即可死亡。本菌在滲出液及動(dòng)物排泄物中可生活數(shù)周。D群鏈球菌抵抗力很強(qiáng)，加熱60℃30分鐘不死。二、致病性致病性鏈球菌?？僧a(chǎn)生多種酶和外毒素。透明質(zhì)酸酶：又稱擴(kuò)散因子?？扇芙饨M織間隙的粘合質(zhì)——透明質(zhì)酸，增加組織間隙的通透性，便于細(xì)菌和毒素向組織擴(kuò)散，因此，能增加細(xì)菌的侵襲力。透明質(zhì)酸具有抗原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，不同菌群產(chǎn)生的酶，抗原性不同。鏈激酶：又稱溶纖維蛋白酶。能使血液中的血漿蛋白酶原變成血漿蛋白酶，即可溶解血塊或阻止血漿凝固，有利于細(xì)菌在組織中擴(kuò)散。耐熱，加熱100℃50分鐘仍可保存活性。A群鏈球菌可產(chǎn)生兩種免疫原性不同的鏈激酶。鐵道酶：又稱脫氧核糖核酸酶，主要為A、C、G群鏈球菌所產(chǎn)生，有A、B、C、D四個(gè)血清型。由于此酶能分解粘稠膿液中具有高度粘性的DNA，所以有人提出用含有鏈激酶和鏈道酶的制劑來(lái)溶解膿皰的膿性滲出物，以利藥物治療。此酶具有抗原性，受鏈球菌感染可產(chǎn)生抗體，如果這種酶抗體增高，即表示有鏈球菌感染。溶血毒素：由溶血性鏈球菌產(chǎn)生，有溶解紅細(xì)胞、殺害白細(xì)胞及毒害心臟的作用。本菌的溶血毒素主要分為“O”和“S”兩種。紅疹毒素：主要是A群鏈球菌產(chǎn)生的一種外毒素。B、C群鏈球菌偶爾也產(chǎn)生。紅疹毒素除對(duì)皮膚的毒性作用外，還有其它多種毒性作用，如內(nèi)毒素樣致熱作用，對(duì)細(xì)胞或組織的損害作用，淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，免疫抑制作用，提高動(dòng)物對(duì)內(nèi)毒素發(fā)生致死性休克的敏感性等。溶血性鏈球菌在自然界中分布較廣，存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動(dòng)物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會(huì)對(duì)人類進(jìn)行感染。上呼吸道感染患者、人畜化膿性感染部位常成為食品污染的污染源。一般來(lái)說(shuō)，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品：食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時(shí)造成食品的污染。食品在加工前就已帶菌、奶?；蓟撔匀橄傺谆蛐笄菥植炕摃r(shí)，其奶和肉尸某些部位污染。熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。溶血性鏈球菌?？梢鹌つw、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感染、流行性咽炎的爆發(fā)性流行以及新生兒敗血癥、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、猩紅熱和風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等變態(tài)反應(yīng)。人的臨床表現(xiàn)病例潛伏期短，平均為2～3天，數(shù)小時(shí)至7天起病急，畏寒、發(fā)熱，伴有頭痛、頭昏、全身不適、乏力等癥狀消化道癥狀有食欲下降，惡心，嘔吐，少數(shù)患者出現(xiàn)腹痛、腹瀉病例皮膚有出血點(diǎn)、瘀點(diǎn)瘀斑重癥病例進(jìn)行性休克表現(xiàn)：血壓下降，脈壓差縮小部分為腦膜炎：昏迷，腦膜刺激征陽(yáng)性，腦脊液呈化膿性改變，重者可出現(xiàn)昏迷重要臟器損害表現(xiàn)為凝血功能障礙、間質(zhì)性肺水腫、肝臟損害和腎臟損害。三、檢驗(yàn)食品中β型溶血性鏈球菌的檢驗(yàn)應(yīng)按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》β型溶血性鏈球菌的檢驗(yàn)方法GB4789.11-2014

進(jìn)行。檢驗(yàn)程序增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)鑒定樣品處理結(jié)果與報(bào)告按無(wú)菌操作稱取檢樣25g（mL），加入盛有225mL

mTSB的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min～2min；或加入盛有225mL

mTSB的均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min。若樣品為液態(tài)，振蕩均勻即可。36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。1．樣品處理及增菌將增菌液劃線接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落形態(tài)。溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)為直徑約2mm～3mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圓形、邊緣整齊，并產(chǎn)生β型溶血。2．分離培養(yǎng)挑取5個(gè)（如小于5個(gè)則全選）可疑菌落分別接種哥倫比亞血瓊脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。3．鑒定-分純培養(yǎng)挑取可疑菌落染色鏡檢。β型溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。3．鑒定-革蘭氏染色鏡檢挑取可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量3%過氧化氫溶液，立即產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性。β型溶血性鏈球菌觸酶為陰性。3．鑒定-觸酶試驗(yàn)原理：致病性乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶，使血液中的血漿蛋白酶原變成成血漿蛋白酶，溶解纖維蛋白。試驗(yàn)方法：吸取草酸鉀人血漿0.2mL，加0.8mL滅菌生理鹽水，混勻。再加滅菌生理鹽水中混勻，再加入經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h的可疑菌的TSB培養(yǎng)液0.5mL及0.25%氯化鈣溶液0.25mL，振蕩搖勻，置于36℃±1℃水浴