抗真菌藥物篩選模型

抗真菌藥物篩選模型勵(lì)飛小組制作目錄1.抗真菌藥物綜述1.1真菌致病特點(diǎn)1.2抗真菌藥物類(lèi)型1.3抗真菌藥物作用機(jī)制2.抗真菌藥物的篩選方法2.1傳統(tǒng)的篩選方法2.2定靶的篩選方法1.抗真菌藥物綜述

1.1真菌致病特點(diǎn)頑固性廣泛性新生性嚴(yán)重性1.2抗真菌藥物類(lèi)型化學(xué)合成的抗真菌抗生素

如：咪唑類(lèi)，三唑類(lèi)

微生物來(lái)源的抗真菌藥物

如：多烯類(lèi)抗生素1.3抗真菌藥物作用機(jī)制作用于真菌細(xì)胞膜中醇合成的抗真菌藥物作用于真菌細(xì)胞壁合成的抗真菌藥物作用于核酸合成的抗真菌藥物2.抗真菌藥物的篩選方法

2.1傳統(tǒng)的篩選方法選擇毒性小的代表性真菌作為試驗(yàn)菌，采用管碟法或者紙片法測(cè)定樣品對(duì)試驗(yàn)的抑制或殺傷活性。2.1.1管碟法以白色念珠菌為指示菌，對(duì)微生物進(jìn)行篩選。檢測(cè)菌的培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基：蔗糖1.5％，馬鈴薯2.0％，瓊脂2.0%,pH自然；沙氏培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5％，葡萄糖4.0％，瓊脂2.0％，pH自然。發(fā)酵樣品處理主要用超聲處理，過(guò)濾得上清液，經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾。檢測(cè)菌孢子制備

取凍干管中菌接種到沙氏斜面，28oC培養(yǎng)；白色念珠菌培養(yǎng)24h，表皮癬菌96h，新型隱球菌48h；

然后分別傳代，培養(yǎng)至子三代；取孢子長(zhǎng)勢(shì)良好的子斜面1支加入滅菌生理鹽水5ml，用接種環(huán)刮下孢子，轉(zhuǎn)移至盛有玻璃珠的三角瓶。

同樣方法處理3次，孢子液合并于三角瓶，輕輕震蕩30min，然后過(guò)濾得孢子懸液。

取原液和稀釋液兩個(gè)濃度的孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，結(jié)果分別為3.6×106個(gè)/ml、3×106個(gè)/ml、5.0×106個(gè)/ml.篩選抗真菌活性取無(wú)菌平板加底層沙氏培養(yǎng)基20ml，凝固。取制得的單孢子懸液，將合適的菌液加入48oC保溫的100ml沙氏培養(yǎng)基中輕輕搖勻。再取5ml注入底層培養(yǎng)基上，搖勻制成含菌平板。待平板凝固后，取4支無(wú)菌鋼杯按等距離排放，一個(gè)加入酮康唑?qū)φ掌?，?個(gè)加入受試樣品，于28oC培養(yǎng)3d，觀察抑菌圈。取滅菌的300ul沙氏液體培養(yǎng)基，以每孔50ul的量加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的個(gè)孔中；取50ul樣品溶液分別加入到96孔板的第1行個(gè)孔中（從第2列開(kāi)始留1列作空白對(duì)照），每1列從第1行開(kāi)始依次倍半稀釋到最后一孔（即第8行），然后在28oC培養(yǎng)16～18h，在倒置顯微鏡下觀察孢子生長(zhǎng)的菌絲形態(tài)，判斷其活性，計(jì)算最小活性濃度。2.12紙片法與管碟法類(lèi)似，用無(wú)菌過(guò)濾紙片沾取藥物貼在真菌培養(yǎng)基上，觀察菌落情況。傳統(tǒng)方法固然存在許多缺點(diǎn)，但由于操作簡(jiǎn)單和處理量大，非常適合微生物發(fā)酵樣品初篩。2.2定靶的篩選方法目前發(fā)現(xiàn)作用于真菌的靶位有三種途徑：真菌結(jié)構(gòu)成分及代謝產(chǎn)物分析；真菌產(chǎn)物的生物合成途徑及其相關(guān)酶分子的研究；控制真菌生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的基因序列分析。2.2.1真菌細(xì)胞壁合成抑制劑篩選大多數(shù)真菌細(xì)胞壁成分包括：幾丁質(zhì)，-β葡聚糖，α-葡聚糖和各種甘露聚糖蛋白。2.2.1.1β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑β-1,3葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要成分，但并不出現(xiàn)在人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此β-1,3葡聚糖的合成被期望成為篩選特異性抗真菌抗生素的理想靶位。日本Ohayama建立的篩選模型

提取白色念珠菌和煙曲霉的β-1,3葡聚糖作為反應(yīng)酶，酶反應(yīng)混合物（100ul含）含有75mmol/LTris-HCl(pH7.5)、0.75mmol/LEDTA、0.75％BSA、1mmol/LUDP-葡萄糖和0.06uCi的UDP-[U-14C]葡萄糖（519mCi/mmol）。在酶反應(yīng)混合物中加入5ul酶溶液，在30oC培養(yǎng)60min，加入100ml冰冷的20％三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。濾紙過(guò)濾獲得沉淀物，先后使用10％的三氯乙酸和95％的乙醇洗滌、風(fēng)干，加入100ml的液閃試劑，使用液閃儀測(cè)定放射活性。計(jì)算酶活性，篩選時(shí)在酶反應(yīng)混合物中加入測(cè)定樣品。

文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用這種方法篩選出許多β-1,3葡聚糖合成酶抑制劑化合物如arborcandinsA~F等。2.2.1.2甘露聚糖合成酶抑制劑甘露聚糖是真菌細(xì)胞壁組成中三種多糖之一，對(duì)細(xì)胞壁的功能起到十分重要的作用。甘露聚糖合成酶抑制劑篩選模型

分離啤酒酵母的甘露聚糖合成酶，以[14C]GDP-甘露聚糖為底物。反應(yīng)混合加入12.5umol/L[14C]GDP-甘露聚糖、20mmol/L二甲基砷酸鹽緩沖液（pH6.5）、10mmol/LMnCl2、1mmol/L二硫蘇糖醇、待測(cè)樣品和甘露聚糖合成酶，25oC反應(yīng)30min，使用紙層析測(cè)定多聚物。

普納米星（pradimicin）類(lèi)和貝娜諾霉素（benanomicin）類(lèi)在存在Ca2＋的條件下，其有力羧基與細(xì)胞表面甘露聚糖蛋白質(zhì)復(fù)合物的多糖部分絡(luò)合，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)異常而破裂，細(xì)胞膜通透性增加，胞內(nèi)鉀外漏而致細(xì)胞死亡。2.2.1.3幾丁質(zhì)合成酶抑制劑幾丁質(zhì)是β-(1,4)糖苷鍵連接的N-乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)的鏈狀聚合物，是細(xì)胞壁的支架結(jié)構(gòu)。幾丁質(zhì)合成酶催化GlcNAc在細(xì)胞膜上聚合成幾丁質(zhì)，在真菌細(xì)胞的分裂和成熟中起了重要作用。幾丁質(zhì)合成酶抑制劑篩選模型

篩選方法類(lèi)似于甘露聚糖合成酶抑制劑方法。

尼克霉素（nikkomycin）和多氧霉素（polyoxin）是兩類(lèi)幾丁質(zhì)合成酶抑制劑，因其結(jié)構(gòu)與幾丁質(zhì)的前提尿苷二磷酸N-乙酰胺基葡萄糖（UDPNlcNAc）類(lèi)似而競(jìng)爭(zhēng)性抑制幾丁質(zhì)合成酶。2.2.2真菌細(xì)胞膜合成抑制劑真菌細(xì)胞膜是一種滲透屏障，可作為小分子和信號(hào)傳導(dǎo)的通路。細(xì)胞膜由磷脂類(lèi)、鞘脂類(lèi)和固醇類(lèi)物質(zhì)組成，為各種功能蛋白提供基本的骨架。2.2.2.1麥角固醇生物合成抑制劑麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)組分，在真菌生活中其重要作用。一些不同類(lèi)型的化合物通過(guò)作用于真菌麥角甾醇生物合成途徑中不同環(huán)節(jié)的酶，干擾真菌麥角甾醇生物合成，發(fā)揮抗真菌作用。2.2.2.2鞘磷脂合成的抑制劑鞘磷脂是真菌與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜必要成分，借其信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)控制細(xì)胞的分裂、增殖和凋亡。鞘磷脂合成始于脂肪酰輔酶A，通常軟脂酰輔酶A與絲氨酸結(jié)合，這一過(guò)程受絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶酯化。針對(duì)這一過(guò)程，目前有多球殼菌素（myriocin）、脂黃菌素（lipoxarnycin）、鞘脂菌素（sphingoffigins）和綠啶菌素（vindofungins）.2.2.3真菌DNA和蛋白質(zhì)合成抑制劑許多癌癥化療用藥或抗細(xì)胞感染系列藥物如：炭疽環(huán)素（a-thracycines）、奎諾酮等均是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。篩選方法類(lèi)似于抗細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑的篩選，主要是從相應(yīng)試驗(yàn)菌中提取酶，建立體外反應(yīng)系統(tǒng)，檢測(cè)樣品對(duì)酶反應(yīng)的抑制作用高低有無(wú)。2