二維核磁共振譜

二維核磁共振波譜法二維核磁共振(2DNMR)方法是Jeener

于1971年首先提出的,是一維譜衍生出來(lái)的新實(shí)驗(yàn)方法。引入二維后,

不僅可將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等參數(shù)展開(kāi)在二維平面上，減少了譜線的擁擠和重疊,

而且通過(guò)提供的HH、CH、CC之間的偶合作用以及空間的相互作用，確定它們之間的連接關(guān)系和空間構(gòu)型，有利于復(fù)雜化合物的譜圖解析，特別是應(yīng)用于復(fù)雜的天然產(chǎn)物和生物大分子的結(jié)構(gòu)鑒定。2DNMR也是目前適用于研究溶液中生物大分子構(gòu)象的唯一技術(shù)。1第一節(jié)基本原理

NMR一維譜的信號(hào)是一個(gè)頻率的函數(shù)，共振峰分布在一個(gè)頻率軸（或磁場(chǎng)）上，可記為S(ω)。二維譜信號(hào)是二個(gè)獨(dú)立頻率（或磁場(chǎng)）變量的函數(shù)，記為S(ω1,ω2),共振信號(hào)分布在兩個(gè)頻率軸組成的平面上。也就是說(shuō)2DNMR將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等NMR參數(shù)在二維平面上展開(kāi)，于是在一般一維譜中重迭在一個(gè)坐標(biāo)軸上的信號(hào)，被分散到由二個(gè)獨(dú)立的頻率軸構(gòu)成的平面上，使得圖譜解析和尋找核之間的相互作用更為容易。不同的二維NMR方法得到的圖譜不同，二個(gè)坐標(biāo)軸所代表的參數(shù)也不同。2一、1D-NMR到2D-NMR的技術(shù)變化（一）一維核磁共振譜及脈沖序列基本脈沖序列:3預(yù)備期演化期混合期檢測(cè)期t1tmt2d（二）二維核磁共振譜及基本脈沖序列二維譜實(shí)驗(yàn)通常分為4個(gè)階段：1、預(yù)備期：預(yù)備期在時(shí)間軸上通常是一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)期，使核自旋體系回復(fù)到熱平衡狀態(tài)，基本脈沖序列:43、混合期：由一組固定長(zhǎng)度的脈沖和延遲組成。在此期間通過(guò)相干或極化的傳遞，建立檢測(cè)條件?；旌掀谟锌赡懿淮嬖冢皇潜夭豢缮俚模ㄒ暥S譜的種類(lèi)而定）4、檢測(cè)期：在此期間檢測(cè)作為t2函數(shù)的各種橫向矢量的FID的變化，它的初始相及幅度受到t1函數(shù)的調(diào)制。

與t2軸對(duì)應(yīng)的ω2（F2軸），通常是化學(xué)位移，與t1軸對(duì)應(yīng)的ω1（F1軸）是什么，取決于二維譜的類(lèi)型。2、演化期：在t1開(kāi)始時(shí)由一個(gè)脈沖或幾個(gè)脈沖使體系激發(fā)，使之處于非平衡狀態(tài)。t1=t+nΔt，逐步延長(zhǎng)，其對(duì)應(yīng)的核磁信號(hào)的相位和幅值也就不相同。5t1=t+nΔt實(shí)驗(yàn)過(guò)程：二維核磁共振譜數(shù)據(jù)矩陣數(shù)據(jù)矩陣對(duì)t2FT數(shù)據(jù)矩陣對(duì)t1FTF2F16

用固定時(shí)間增量⊿t1依次遞增t1進(jìn)行系列實(shí)驗(yàn)，反復(fù)疊加，因t2時(shí)間檢測(cè)的信號(hào)S(t2)的振幅或相位受到s(t1)的調(diào)制，則接收的信號(hào)不僅與t2有關(guān)，還與t1有關(guān)。每改變一個(gè)t1，記錄S(t2),

因此得到分別以時(shí)間變量t1,

t2為行列排列數(shù)據(jù)矩陣，即在檢測(cè)期獲得一組FID信號(hào)，組成二維時(shí)間信號(hào)S(t1,t2)。因t1,t2是兩個(gè)獨(dú)立時(shí)間變量，可以分別對(duì)它們進(jìn)行傅立葉變換，一次對(duì)t2,一次對(duì)t1,兩次傅立葉變換的結(jié)果，可以得到兩個(gè)頻率變量函數(shù)S(ω1,ω2)的二維譜。7二、常用2D-NMR圖譜的表現(xiàn)形式1.堆積圖堆積圖的優(yōu)點(diǎn)是直觀,具有立體感.缺點(diǎn)是難以確定吸收峰的頻率。大峰后面可能隱藏小峰，而且耗時(shí)較長(zhǎng)。82.等高線圖等高線圖類(lèi)似于等高線地圖，這種圖的優(yōu)點(diǎn)是容易獲得頻率定量數(shù)據(jù)，作圖快。缺點(diǎn)是低強(qiáng)度的峰可能漏畫(huà)。目前化學(xué)位移相關(guān)譜廣泛采用等高線圖。等高線圖中最中心的圓圈表示峰的位置，圓圈的數(shù)目表示峰的強(qiáng)度。3.投影圖（一維譜）堆積圖在F1或F2方向上的投影，是一維譜形式，可用來(lái)準(zhǔn)確確定F1軸或F2軸上各譜峰的化學(xué)位移值。9β-紫羅蘭酮10三、二維譜共振峰的名稱1.對(duì)角峰21534它們處在坐標(biāo)F1=F2的對(duì)角線上。對(duì)角峰在F1或F2上的投影得到常規(guī)的一維偶合譜或去偶譜。

F2F154321112.交叉峰交叉峰也稱為相關(guān)峰，它們不在對(duì)角線上，即坐標(biāo)F1≠F2。交叉峰顯示了具有相同偶合常數(shù)的不同核之間的偶合（交叉）。交叉峰有兩組，分別出現(xiàn)在對(duì)角線兩側(cè)，并以對(duì)角線對(duì)稱。這兩組對(duì)角峰和交叉峰可以組成一個(gè)正方形，并且由此來(lái)推測(cè)這兩組核A和X有偶合關(guān)系。21534F2F15432112四、二維譜的分類(lèi)二維譜可分為三類(lèi)：1）J分解譜

J分解譜亦稱J譜或者δ-J譜。它把化學(xué)位移和自旋偶合的作用分辨開(kāi)來(lái)，分別用F2、F1表示，包括異核和同核J譜。2）化學(xué)位移相關(guān)譜化學(xué)位移相關(guān)譜也稱δ-δ譜，它把不同自旋核的共振信號(hào)相互關(guān)聯(lián)起來(lái)，是二維譜的核心。包括同核化學(xué)位移相關(guān)譜，異核化學(xué)位移相關(guān)譜，NOESY和化學(xué)交換譜。3）多量子譜用脈沖序列可以檢測(cè)出多量子躍遷，得到多量子二維譜。13第二節(jié)二維J分解譜二維J分解譜是將不同的NMR信號(hào)分解在兩個(gè)不同的軸上，使重疊在一起的一維譜的化學(xué)位移δ和偶合常數(shù)J分解在平面兩個(gè)坐標(biāo)上，提供了精確的偶合裂分關(guān)系，便于解析。二維J分解譜分為同核和異核J分解譜。一、氫、氫同核二維J分解譜同核二維J分解譜將1HNMR中重迭密集的譜線多重峰結(jié)構(gòu)展開(kāi)在一個(gè)二維平面上，可將偶合常數(shù)3JHH（或2JHH)與化學(xué)位移分別在F1、F2二個(gè)軸上給出。14在同核1H,1H－2DJ分解譜中，被測(cè)定的核為1H核。15反式丙烯酸乙酯的1H－1H同核二維J分解譜161/2JHH17182位的a-H和e-H相互偶合，裂分為雙峰后進(jìn)一步被3位氫裂分而顯示六重峰。同樣，3-H的a、e質(zhì)子首先裂分為雙峰，再被鄰位2-H和4-H質(zhì)子進(jìn)一步裂分為十二重峰，但由于有些峰相互重疊，在2DJ分解譜中只顯示10個(gè)點(diǎn)。5位甲基沒(méi)有受到偶合，因此只在F1=0軸上顯示單峰。19二、碳、氫異核二維J分解譜在異核13C,1H－2DJ分解譜中，被測(cè)定的核為13C核，分解譜的F2軸為13C化學(xué)位移δC，F(xiàn)1軸為1H與13C的偶合(1JCH)多重峰，為1/2JCH。

出峰情況是CH為二重峰，CH2為三重峰，CH3為四重峰，季碳單峰或不出峰。20反式丙烯酸酯的13C,1HJ分解2D譜。

F2軸為13C的化學(xué)位移。F1軸為1JCH偶合的多重峰。21CH3---四重峰（5-Me，1,1’–Me,10);CH2---三重峰(2,3,4);CH---雙重峰(7,8)。由于DEPT等測(cè)定碳原子級(jí)數(shù)的方法能代替異核J譜，且檢測(cè)速度快，操作方便，因此異核J譜較少應(yīng)用。235,622第三節(jié)同核化學(xué)位移相關(guān)譜一、氫、氫化學(xué)位移相關(guān)譜

1H-1H-COSY是1H核和1H核之間的化學(xué)位移相關(guān)譜。在通常的橫軸和縱軸上均設(shè)定為1H的化學(xué)位移值，兩個(gè)坐標(biāo)軸上則顯示通常的一維1H譜。（1H-1HCorrelationspectroscopy，1H-1HCOSY）在該譜圖中出現(xiàn)了兩種峰，分別為對(duì)角峰及相關(guān)峰。同一氫核信號(hào)將在對(duì)角線上相交，相互偶合的兩個(gè)/組氫核信號(hào)將在相關(guān)峰上相交，一般反映的是3J偶合。231H-1HCOSY-900基本脈沖序列：

一般說(shuō)來(lái)，在解析1H-1HCOSY譜時(shí)，應(yīng)首先選擇一個(gè)容易識(shí)別，有確切歸屬的質(zhì)子，以該質(zhì)子為起點(diǎn)，通過(guò)確定各個(gè)質(zhì)子間的偶合關(guān)系，指定分子中全部或大部分質(zhì)子的歸屬，這就是我們通常所說(shuō)的“從頭開(kāi)始”法。2421534F2F15432125162627ArH-CH3-CH-CH2-CH2-CH22885,1167131412295H5/H2J偶合30二、碳、碳化學(xué)位移相關(guān)譜這是二維碳骨架直接測(cè)定法，是確定碳原子連接順序的實(shí)驗(yàn)，采用一種天然豐度雙量子相干（INADEQUATE）技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。碳是組成分子骨架，它更能直接反映化學(xué)鍵的特征與取代情況。但是由于13C天然豐度僅僅為1.1%，出現(xiàn)相連13C-13C偶合的幾率為0.01％，使1JC-C測(cè)試非常困難,信號(hào)累加時(shí)間達(dá)兩天，只在迫不得以才做。兩個(gè)偶合的13C核能產(chǎn)生雙量子躍遷，躍遷頻率相等，孤立的碳則不能。31

2DINADEQUATE譜圖有兩種形式，第一種形式，F(xiàn)2軸是13C的化學(xué)位移，F(xiàn)1為雙量子躍遷頻率，水平連線表明一對(duì)偶合碳具有相同的雙量子躍遷頻率，可以判斷它們是直接相連的碳。另一種形式，F(xiàn)2軸F1軸都是13C的化學(xué)位移，相互偶合的碳核作為一對(duì)雙峰出現(xiàn)在對(duì)角線兩側(cè)對(duì)稱的位置上。依此類(lèi)推可以找出化合物中所有13C原子連接順序。32332143567OHHO6-75-64-51-22-33-41423567F2F1346,75,127,118,108,95,1010,116,123513C-13C2DINADEQUATEspectrumofmenthol

F1(δ13C)F2(δ13C)103426185793,43,2422,181516,15,6 76 1,78,9 8,10910

4,8 4,5F2(δ13C)F1(δ13C)36一、13C檢測(cè)的異核化學(xué)位移相關(guān)譜所謂異核化學(xué)位移相關(guān)譜是兩個(gè)不同核的頻率通過(guò)標(biāo)量偶合建立起來(lái)的相關(guān)譜.應(yīng)用最廣泛的是1H-13CCOSY。第三節(jié)異核化學(xué)位移相關(guān)譜

13C-1HCOSY譜圖中F2為13C化學(xué)位移，F(xiàn)1為1H化學(xué)位移，沒(méi)有對(duì)角峰，其交叉峰表明C-H相連偶合的信息，季碳不出交叉峰。解析時(shí)，可以從一已知的氫核信號(hào)，根據(jù)相關(guān)關(guān)系，即可找到與之相連的13C信號(hào)，反之亦然?？梢詮淖V圖中得到1JC-H的結(jié)構(gòu)信息。37385’32D13C-1HCOSYspectrum(1JCHcorrelations)2a2e1’2166’5C1,H1aC1,H1eC2,H2aC2,H2eC1’,H1’C4,H4C2’,H2’ C4’,H4’ C3,H34’2’41’3’

1a 1eδ1Ηδ13CF1F2C5,H5 C6’,H6’ C6,H63940 常規(guī)的13C檢測(cè)的異核直接相關(guān)譜，靈敏度低，樣品的用量較大，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)。HMQC（異核多量子相關(guān)譜）技術(shù)很好地克服了上述缺點(diǎn)，HMQC實(shí)驗(yàn)是通過(guò)多量子相干，檢測(cè)1H信號(hào)而達(dá)到間接檢測(cè)13C的一種方法二、1H檢測(cè)的異核多量子相關(guān)譜（HMQC）HMQC(異核多量子相干譜)的優(yōu)點(diǎn)脈沖序列較簡(jiǎn)單，參數(shù)設(shè)置容易。反式檢測(cè)氫維(f2)分辨率較高，靈敏度較高。缺點(diǎn)碳維(f1)分辨率低.—C1

—C2—C3—C4—H1H2H3H441HMQC是將1H信號(hào)的振幅及相位分別依13C化學(xué)位移及1H間的同核化學(xué)偶合信息調(diào)制，并通過(guò)直接檢測(cè)調(diào)制后的1H信號(hào)，獲得13C-1H化學(xué)位移相關(guān)數(shù)據(jù)。它所提供的信息及譜圖與1H-13CCOSY完全相同。圖上F2坐標(biāo)是1H的化學(xué)位移,F1是13C化學(xué)位移，直接相連的13C與1H將在對(duì)應(yīng)的13C化學(xué)位移與1H化學(xué)位移的交點(diǎn)處給出相關(guān)信號(hào)。不能得到季碳的結(jié)構(gòu)信息。42HMQC譜434423678945三、1H檢測(cè)的異核單量子相關(guān)譜（HSQC）HSQC(HeteronuclearSingleQuantumCorrelation)與HMQC相似，也是通過(guò)1JCH偶合常數(shù)實(shí)現(xiàn)碳?xì)湎嚓P(guān)。相干傳遞是通過(guò)單量子相干機(jī)理。下面是基本的HSQC脈沖序列：1Ht1/2d1t1/213CDec.d2d2d2d2d2=1/41JCHHSQC譜的靈敏度比HMQC高，但HSQC包含較多射頻脈沖，要求實(shí)驗(yàn)參數(shù)精確設(shè)置，否則誤差偏大。圖譜形式和解譜方法與HMQC相同。46

HMBC是heteronuclear

multipule

bond

correlation

的縮寫(xiě)，表示異核遠(yuǎn)程（多鍵）相關(guān)譜。與HMQC一樣，HMBC的譜圖也是是一種間接檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，是通過(guò)檢測(cè)H間接檢測(cè)C信號(hào)。橫坐標(biāo)F2代表采樣的H

NMR的化學(xué)位移，縱坐標(biāo)F1代表的是間接檢測(cè)的C

NMR的化學(xué)位移。相隔2-4個(gè)化學(xué)鍵相連的C、H原子就會(huì)在譜圖上出現(xiàn)交叉峰，即只要有交叉峰的出現(xiàn)，那么交叉峰所對(duì)應(yīng)的H、C原子是通過(guò)2-4個(gè)化學(xué)鍵相連的（4J相連的交叉峰不一定出現(xiàn)）。

四、1H檢測(cè)的異核多量子遠(yuǎn)程相關(guān)譜HMBC47根據(jù)HMBC譜所給出的H、C之間的關(guān)系，結(jié)合HMQC的譜圖，我們就能夠解決C原子的連接順序問(wèn)題，這樣我們就能基本上確定有機(jī)化合物的骨架結(jié)構(gòu)，基本上一個(gè)有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)就能夠確定了。HMBC的主要問(wèn)題在于并不能夠確定相關(guān)峰是二鍵、三鍵還是四鍵的耦合(四鍵偶合較少出現(xiàn))。HMBC可高靈敏度地檢測(cè)13C-1H遠(yuǎn)程偶合，因此可得到有關(guān)季碳的結(jié)構(gòu)信息及其被雜原子或季碳切斷的偶合系統(tǒng)之間的結(jié)構(gòu)信息。48C2,C3andC4:QuaternaryorprotonatedcarbonsX:O,NHMQC是通過(guò)異核多量子相干把1H核和與其直接相連的13C核關(guān)聯(lián)起來(lái)，HMBC則是通過(guò)異核多量子相干把1H核和遠(yuǎn)程偶合的13C核關(guān)聯(lián)了起來(lái)。HMBC是突出表現(xiàn)相隔2個(gè)至4個(gè)鍵的碳?xì)渲g的偶合，交叉峰為單峰。但由于技術(shù)上的原因，有時(shí)不能完全去掉直接相連的碳?xì)渲g的偶合1JCH,交叉峰表現(xiàn)為雙峰或三峰，中心對(duì)應(yīng)δH，解析圖譜時(shí)要特別注意。49789654312987623確定H2確定C2-C=OH3與C5五交叉峰503鍵偶合3鍵偶合51HMQC52HMBC53第五節(jié)二維NOE譜一、二維NOESY二維NOE譜簡(jiǎn)稱為NOESY，它反映了有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)中H核與H核之間空間距離的關(guān)系，而與二者間相距多少根化學(xué)鍵無(wú)關(guān)。因此對(duì)確定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)象以及生物大分子（如蛋白質(zhì)分子在溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)等）有著重要意義。909090t1tm54NOESY的譜圖與1H-1HCOSY非常相似，它的F2維和F1維上的投影均是氫譜，也有對(duì)角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和COSY相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個(gè)氫核之間有耦合關(guān)系，而是表示兩個(gè)氫核之間的空間位置接近。由于NOESY實(shí)驗(yàn)是由COSY實(shí)驗(yàn)發(fā)展而來(lái)為的，因此在圖譜中往往出現(xiàn)COSY峰，即J偶合交叉峰，故在解析時(shí)需對(duì)照它的1H-1HCOSY譜將J偶合交叉峰扣除。55NOESY(H-3,H-2)交叉峰為J偶合峰5615867CH2NOESY-CH35758

2DNOESYspectrumofailanthoneacbda,cb,d

NOEc bdaNOE59二、二維ROESYNOESY譜是確定化合物立體結(jié)構(gòu)時(shí)普遍應(yīng)用的一種二維技術(shù)，但對(duì)于中等大小的分子（分子量約為1000-3000），有時(shí)NOE的增益為零，從NOESY譜上得不到相關(guān)的信息。而旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的NOESY，我們稱之為ROESY譜則有效地克服了上述NOESY譜的不足，是一種解決中等大小化合物立體結(jié)構(gòu)的理想技術(shù)，ROESY譜的解析方法和說(shuō)明的問(wèn)題與NOESY譜一致。60第六節(jié)一維、二維譜綜合解析一維譜的初步解析：分析一維1H譜，根據(jù)譜圖中化學(xué)位移值、耦合常數(shù)值、峰形和峰面積找出一些特征峰，并確定各譜線的大致歸屬和氫分布，確定O,N等雜原子的可能的連接。分析一維C譜，對(duì)照13C質(zhì)子噪聲去偶譜以及各個(gè)DEPT碳譜，確定各碳原子的級(jí)數(shù)和各譜線的大致歸屬，確定O,N等雜原子的可能的連接。一、解析步驟61解析H-HCOSY譜，從一維譜中已經(jīng)確定的氫譜線出發(fā)找到與之相關(guān)的其它譜線。解析13C-1HCOSY（HMQC、HSQC）譜，同樣從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關(guān)的碳譜線，以此推斷出這些碳譜線的歸屬。解析13C-1H遠(yuǎn)程相關(guān)譜（HMBC），從已確定的碳譜線出發(fā)，找到與之相關(guān)的各氫譜線或從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關(guān)的碳譜線，由此完成對(duì)一些未知譜線的指認(rèn)。借助二維核磁共振譜對(duì)圖譜作進(jìn)一步的指認(rèn)：注意排除一維譜與二維譜中的溶劑峰與雜質(zhì)峰62某化合物的分子式為C6H10O，請(qǐng)根據(jù)下列各譜推斷結(jié)構(gòu)1H2H1H1H1H2H2HU=2二、解析實(shí)例63=CH2=CH-CH-CH2-CH2-CH22156436412211234C2-H25435543666/C1-H1H2-H3-H4-H5-H6,H6/H3-C3H4-C4H5-C5C6-H6,H6/或H6,H6/-C6HMQC1H-1H-COSY65

123413244231The1HNMRspectrumof2,3-dihydrofuran(F)showsresonancesat2.6(2H),4.2(2H),4.9(1H),6.2(1H)PPM.The13Cspe