儀器分析(第3章高效液相色譜分析)

高效液相色譜分析HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC第3章(第五講）內(nèi)容提要1高效液相色譜法的特點(diǎn)2影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素3高效液相色譜法的主要類型及其分離原理4液相色譜法的固定相5液相色譜法流動(dòng)相6高效液相色譜儀7高效液相色譜分離類型的選擇8高效液相色譜法應(yīng)用實(shí)例9液相制備色譜10毛細(xì)管電泳§3.1高效液相色譜的特點(diǎn)一、定義：液相色譜法是指流動(dòng)相為液體的色譜技術(shù)。高效液相色譜是20世紀(jì)70年代迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高效、快速的分離技術(shù)。（液相色譜+氣相色譜理論+高壓泵、高效固定相+高靈敏檢測(cè)器）。二、特點(diǎn)1.高壓:可達(dá)150~350×105Pa2.高速:例，分離20種氨基酸，經(jīng)典色譜法要20多小時(shí)，用HPLC只需1小時(shí).3.高效：3萬(wàn)塔板/米（GC2000塔板/米）4.高靈敏度：紫外檢測(cè)器10-9g；熒光檢測(cè)器10-11g三、應(yīng)用范圍

氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對(duì)高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70-80%。。因此，高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，不受試樣揮發(fā)性的限制。與GC比較65/1；基本概念及理論基礎(chǔ)與GC一致；主要區(qū)別：流動(dòng)相不同.影響的因素：柱內(nèi)展寬和柱外展寬。一、柱內(nèi)展寬1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)：He=2λdp

λ:填充不均勻因子；dp填充粒度直徑高效液相色譜法的固定相是高效填料，其顆粒直徑比氣相色譜法更??；且裝柱多采用勻漿法裝柱，填充很均勻，λ變得很小，所以He值比較小?！?.2影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素2.縱向擴(kuò)散項(xiàng)65/-1：Hd=CdDm/u；當(dāng)試樣分子在色譜柱內(nèi)被流動(dòng)相帶向前時(shí)，由于分子本身運(yùn)動(dòng)所引起的縱向擴(kuò)散同樣引致色譜峰的擴(kuò)展。由于分子在液體中的擴(kuò)散系數(shù)Dm比在氣體中小4-5個(gè)數(shù)量級(jí)，在LC中可忽略,GC中重要。

3、傳質(zhì)阻力項(xiàng)

組分分子在固定相與流動(dòng)相之間傳質(zhì)緩慢引起局部不平衡，從而引起峰擴(kuò)展。（1）固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)（主要發(fā)生在液－液分配色譜中）當(dāng)流動(dòng)相中的試樣分子擴(kuò)散進(jìn)入到涂漬在載體表面的固定液內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量交換時(shí)，由于滲入固定液膜的深度不同，其返回到流動(dòng)相中的時(shí)間也不同，因而引起峰擴(kuò)展。采取措施：1）液-液分配色譜：薄的固定相層；吸附、排阻、離子交換色譜：小的顆粒填料。2）采用擴(kuò)散系數(shù)大的液相固定相。3）減小流動(dòng)相的流速，改善傳質(zhì)。（2）流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)(二種形式:在流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì))i.流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)Hm

當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，靠近填充物顆粒表面的流速較慢，而流路通道中心的流速則較快，移動(dòng)速度不一樣從而引起峰形變寬。

ii.滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力項(xiàng)Hsm

由于固定相的多孔性能使流動(dòng)相滯留在其微孔內(nèi)，微孔內(nèi)的流動(dòng)相稱為滯留區(qū)流動(dòng)相（靜止?fàn)顟B(tài)，不流動(dòng)）。當(dāng)流動(dòng)相中的試樣分子與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換時(shí)，必須先從流動(dòng)相擴(kuò)散進(jìn)入到滯留區(qū)。如果固定相中微孔既小又深，則滯留就越嚴(yán)重，傳質(zhì)就越慢，對(duì)峰擴(kuò)展影響也越大。

由于柱內(nèi)色譜峰擴(kuò)展所引起的塔板高度的變化可歸納為：

H=A+B/u+Cu

由于B/u這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)，高效液相色譜的方程可寫成：

H=A+Cu1.固定相與裝柱方法的選擇：選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm,5μm目前應(yīng)用最廣泛）首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2.流動(dòng)相及其流速的選擇：選粘度小、低流速的流動(dòng)相——甲醇，約1ml/min3.柱溫的選擇：選室溫25℃左右其中，減小粒度是提高柱效能的最有效的方法。分離條件的選擇HPLC與GC的H-u曲線見圖3-1：（1）兩者曲線形狀相似，都有一個(gè)H最小值；（2）HPLC的H最小值比GC的最小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，柱效更高；（3）HPLC的最佳流速u比GC的最佳流速u也小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。二、柱外展寬：指色譜柱外各種因素引起的峰擴(kuò)展.

a.柱前展寬：主要由進(jìn)樣所引起；進(jìn)樣方式：將試樣注入色譜柱的頂端濾塞上或注入進(jìn)樣器的液流中。由于進(jìn)樣器的死體積以及進(jìn)樣時(shí)的液流擾動(dòng)引起色譜峰不對(duì)稱和展寬。解決：試樣注入柱頂端中心點(diǎn)或填料中心1~2mm處。

b.柱后展寬：主要由接管、檢測(cè)器流通池體積所引起.解決：連接管的體積、檢測(cè)器的死體積應(yīng)盡可能小.§3.3高效液相色譜的主要類型及其分離原理類型：液-液色譜；液-固色譜；離子交換色譜；離子對(duì)色譜；離子色譜；空間排阻色譜一.液-液分配色譜法及化合鍵合相色譜

1.特點(diǎn)：a.流動(dòng)相和固定相都是液體

b.兩相應(yīng)互不相溶，有明顯的分界面

2.分離機(jī)制：試樣組分溶于流動(dòng)相后,在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度存在差異，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。

K=cs/cm=kVm/Vs

分離的順序決定于分配系數(shù)的大小，分配系數(shù)大的組分保留值大.而且流動(dòng)相的種類對(duì)分配系數(shù)也有較大的影響.3.解決固定液流失問(wèn)題方法：1）采用正或反相色譜

a.正相液-液色譜法：流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（固定液：親水性；流動(dòng)相：疏水性）

b.反相液-液色譜法：流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（固定液：疏水性；流動(dòng)相：親水性）2）采用化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相：將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相.目前反相鍵合相色譜法，已成為高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的一個(gè)分支，液-液分配色譜極少采用。二.液-固色譜法（或液-固吸附色譜法）1.特點(diǎn)：流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑。2.分離機(jī)制：根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離。（溶質(zhì)分子X與溶劑分子S對(duì)吸附劑表面競(jìng)爭(zhēng)吸附）

Xm+nSa

=Xa+nSmK=[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]n

3.結(jié)論69/-5：顯然，分配系數(shù)大的組分，吸附劑對(duì)它的吸附力強(qiáng)，保留值就大.4.作用：a.適用分離相對(duì)分子質(zhì)量中等油性試樣。

b.對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。

缺點(diǎn)：由于非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)象.

三、離子對(duì)色譜法

1.特點(diǎn)：對(duì)各種強(qiáng)極性的有機(jī)酸或有機(jī)堿的分離，分離效能高，分析速度快，操作簡(jiǎn)便.2.分離機(jī)制（P71）：將一種或多種與溶質(zhì)電荷相反的離子（稱為對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。

3.分離過(guò)程：流動(dòng)相中待分離有機(jī)離子與固定相或流動(dòng)相中帶相反電荷的對(duì)離子結(jié)合，形成離子對(duì)化合物，然后在兩相間進(jìn)行分配.X+水相

(被測(cè)離子)+Y－水相(對(duì)離子)?X+Y－有機(jī)相

KXY=[X+Y－]有機(jī)相

/[X+]水相·

[Y－]水相（平衡常數(shù)）

DX=[X+Y－]有機(jī)相

/X+水相

=KXY·

[Y－]水相（分配系數(shù)）4.離子對(duì)色譜法分類正相離子對(duì)色譜法(極性固定相）反相離子對(duì)色譜法（非極性的疏水固定相，含有對(duì)離子Y－的甲醇－水（或乙腈－水）溶液作為極性流動(dòng)相）試樣離子X＋進(jìn)入柱內(nèi)以后，與對(duì)離子Y－生成疏水性離子對(duì)X＋Y－，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。5.應(yīng)用：解決了以往難分離混合物的分離問(wèn)題,諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣.可見保留值隨KXY和[Y-]水相的增大而增大。四.離子交換色譜法

1.分離機(jī)制70/2；離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子對(duì)交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

2.適用范圍70/3；凡能在溶劑中電離的物質(zhì)一般均可用該法進(jìn)行分離。離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：

3.分離交換：KX=[-NR4+X-][Cl-]/[-NR4+Cl-][X-]DX=[-NR4+X-]/[X-]=KX[-NR4+Cl-]/[Cl-]4.結(jié)論：a.分配系數(shù)D愈大，表示溶質(zhì)的離子與離子交換劑的相互作用愈強(qiáng)。

b.親合力高的，在柱中保留值就愈大.5.應(yīng)用：a.分離離子或可離解的化合物。

b.已成功地分離氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等.五、離子色譜法 這是20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的液相色譜法，很快發(fā)展成為水溶液中陰離子分析的最佳方法。

1.固定相:離子交換樹脂流動(dòng)相:電解質(zhì)溶液

檢測(cè)器:電導(dǎo)檢測(cè)器主配件：抑制柱（抑制流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子的干擾）

2.流程圖：fig3-2例：陰離子交換柱（分離柱）：R—OH－＋+Na+Br-(待測(cè))→R—Br-+Na+OH-（交換）R—Br-＋+Na+OH－(洗脫劑)→R—OH-+Na+Br-（洗脫）抑制柱（消除本底電導(dǎo)影響），則發(fā)生下列反應(yīng)：R—H＋

+Na+OH-(流動(dòng)相)→

R—Na++H2O

R—H＋

+Na+Br-(流動(dòng)相)→

R—Na++H+Br-可見，不僅大量堿轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的酸，大大提高檢測(cè)靈敏度。3.分離機(jī)制

a.雙柱型：化學(xué)抑制型離子色譜法；

b.單柱型：非抑制型，用低電導(dǎo)的洗脫液；

4.應(yīng)用：離子色譜法是目前唯一快速、靈敏和準(zhǔn)確的多組分分析的方法因而得到廣泛重視和迅速發(fā)展。從無(wú)機(jī)和有機(jī)陰離子到金屬陽(yáng)離子，從有機(jī)陽(yáng)離子到糖類、氨基酸等均可用該法分析.六、空間排阻色譜法

1.固定相：凝膠

2.機(jī)制73/-9：類似于分子篩作用，分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流體力學(xué)體積和分子大小有關(guān).排阻法是建立在分子大小的基礎(chǔ)上的。組分中太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，先出峰；組分中太小的分子可以進(jìn)入所有膠體微孔中，最后出峰。洗脫次序?qū)⑷Q于相對(duì)分子質(zhì)量的大小，相對(duì)分子質(zhì)量大的先洗脫，相對(duì)分子質(zhì)量小的后洗脫。分子的形狀也對(duì)保留有重要的作用。3.分離示意圖，fig3-3a.排斥極限A點(diǎn)74/2;3:b.全滲透極限B點(diǎn)74/2;6:

相對(duì)分子質(zhì)量介于上述兩個(gè)極限之間的化合物，

將按相對(duì)分子質(zhì)量降低的次序被洗脫而可以分離.4.特點(diǎn)75/2;3:1）試樣色譜峰全部在溶劑的保留時(shí)間前出峰。2）用于分離相對(duì)分子質(zhì)量大的化合物（約為2000以上）；3）只能分離相對(duì)分子質(zhì)量差別在10%以上的分子?！?.4液相色譜法固定相色譜柱是色譜法的心臟，固定相及裝柱技術(shù)是關(guān)鍵.一、液-液色譜法、鍵合相色譜法及離子對(duì)色譜法固定相1.全多孔型擔(dān)體：直徑小于10μm,由nm級(jí)的硅膠微粒堆聚而成為5μm直徑的全多孔型擔(dān)體。顆粒小，柱效高。2.表層多孔型擔(dān)體：直徑為30~40μm的實(shí)心核(玻璃微珠)，表層上附有一層厚度約為1~2μm的多孔硅膠，填柱容易，重現(xiàn)性好，但試樣容量低。目前5~10μm直徑是使用最廣泛的高效填料。3.化學(xué)鍵合固定相（P76及P69）定義：用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面.化學(xué)鍵合固定相根據(jù)在硅膠表面的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型（≡Si-O-C)；硅氧硅碳鍵型（≡Si-O-Si-C);硅碳鍵型（≡Si-C)；硅氮鍵型（≡Si-N)。硅烷化反應(yīng)：化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：（1）表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多；（2）無(wú)固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命；（3）可以鍵合不同的官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分析；（4）有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測(cè)器和餾分的收集。分離機(jī)制77/2：既不是全部吸附過(guò)程，亦不是典型的液-液分配過(guò)程，而是雙重機(jī)制兼而有之，只是按鍵合量的多少而各有側(cè)重.二、液-固吸附色譜法固定相目前較常用5-10μm的硅膠微粒（全多孔型）.三、離子交換色譜法固定相

1.薄膜型離子交換樹脂，以薄殼玻珠為擔(dān)體，表面涂1%離子交換樹脂.2.離子交換鍵合固定相：用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合在惰性擔(dān)體表面。

a.鍵合薄殼型：擔(dān)體，薄殼玻珠；

b.鍵合微粒擔(dān)體型：擔(dān)體，微粒硅膠.四、排阻色譜法固定相

a.軟質(zhì)凝膠：葡萄糖凝膠；瓊脂糖凝膠；(水流動(dòng)相,常壓)b.半硬質(zhì)凝膠：交聯(lián)聚苯乙烯凝膠；(有機(jī)溶劑，較高壓)c.硬質(zhì)凝膠：多孔硅膠；多孔玻珠；(高速)§3.5液相色譜法流動(dòng)相1.重要性：GC載氣僅三四種，要提高柱效選擇性，主要是改變固定相的性質(zhì)；

LC則不同，當(dāng)固定相選定時(shí)，流動(dòng)相的種類，配比能顯著地影響分離效果，因此流動(dòng)相的選擇很重要。2.選擇流動(dòng)相應(yīng)注意的因素79/2：5點(diǎn)，

選擇流動(dòng)相的注意因素：（1）流動(dòng)相的純度：一般是采用分析純?cè)噭?，必要時(shí)需進(jìn)一步純化，以除去干擾的雜質(zhì)。（2）應(yīng)避免使用會(huì)引起柱效損失或保留值特性變化的溶劑。（固定相不能吸附溶劑或與流動(dòng)相互溶。）（3）對(duì)試樣要有適宜的溶解度，否則會(huì)在柱頭易產(chǎn)生沉淀。（4）溶劑的粘度小些為好，否則會(huì)降低試樣組分的擴(kuò)散系數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。（5）應(yīng)柱檢測(cè)器相匹配（溶劑不能被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)出來(lái)）3.溶劑的選擇79/-3：

a.依據(jù)：溶劑的極性是重要依據(jù)。

b.溶劑極性順序，水最大，煤油最小。

c.采用多元組合溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相（底液和洗脫液）（底劑決定基本的色譜分離情況；洗脫劑則調(diào)節(jié)試樣組分的滯留并對(duì)幾個(gè)具有選擇性的分離作用）

d.根據(jù)不同的方法選擇合適的底液和洗脫液

選用溶劑的依據(jù)：溶劑的極性。正相色譜：底劑（弱極性）＋洗脫劑（極性較強(qiáng)）反相色譜：水（主體）＋有機(jī)溶劑調(diào)節(jié)劑。離子交換色譜：組分保留值通過(guò)流動(dòng)相的離子強(qiáng)度（鹽的濃度）和pH來(lái)控制。增加鹽的濃度，保留值降低；陽(yáng)離子交換柱流動(dòng)相pH增加，保留值增加，陰離子交換柱相反。排阻色譜：所用的溶劑必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠并防止吸附作用?！?-6高效液相色譜儀

highperformanceliquidchromatograph液相色譜儀（2）液相色譜儀（3）液相色譜儀（4）高效液相色譜儀構(gòu)成：一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、恒溫器、記錄儀等主要部件。

動(dòng)畫1.高壓泵作用：輸送液體流動(dòng)相。要求：i).高壓力150～350×105

Pa;ii).流量要穩(wěn)定；iii).壓力平穩(wěn)無(wú)脈動(dòng)；iv).對(duì)流速要有一定的可調(diào)范圍.分類：a.往復(fù)式柱塞泵—恒流泵.i)供給恒定體積的流動(dòng)相，流量可調(diào)；ii)死體積小，適用梯度洗提；iii）輸出有脈動(dòng)。b.氣動(dòng)放大泵—恒壓泵。i)供給無(wú)脈沖的穩(wěn)定流量的輸出.ii)死體積大，不適用梯度洗提。p1SA=p2SB2.梯度洗提（梯度洗脫、梯度淋洗）裝置82/a.作用：與GC中的程序升溫一樣.（P22、23）

b.定義83/1：所謂梯度洗提，就是載液中含有兩種以上不同極性的溶劑，在分離過(guò)程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過(guò)載液中極性的變化來(lái)改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。應(yīng)用梯度洗提還可以使分離時(shí)間縮短，分辨能力增加，還可提高最小檢測(cè)量和定量分析的精度。外梯度（低壓梯度）：先混合后輸入色譜柱；內(nèi)梯度（高壓梯度）：先泵入梯度混合室再入色譜柱；3.進(jìn)樣裝置

a.重要性83/1：進(jìn)樣方式及試樣體積對(duì)柱效有很大影響.要獲得良好的分離效果和重現(xiàn)性，需要將試樣“濃縮”地瞬間注入色譜柱入擔(dān)體的中心成一個(gè)點(diǎn)。

b.進(jìn)樣方式

1）注射器進(jìn)樣裝置：由于不能承受高壓，所以需用停流進(jìn)樣方法，但該方式無(wú)法取得精確的保留時(shí)間，峰形的重現(xiàn)性亦較差.2）高壓定量進(jìn)樣閥通過(guò)進(jìn)樣閥（通常是六通閥）直接向壓力系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)樣而不必停止流動(dòng)相的一種裝置（fig3-7）a.進(jìn)樣準(zhǔn)備：1和6，2和3連通，試樣由5、4注入定量管；b.進(jìn)樣：閥芯順時(shí)針旋轉(zhuǎn)600，這時(shí)1和2，3和4，5和6連通，試樣送入柱中.特點(diǎn)：進(jìn)樣準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適于定量分析.4.色譜柱

a.參數(shù)：id，4.6或3.9mm；

L=15-30cm；填料顆粒度，5-10μm；

n=5000-10000b.發(fā)展趨勢(shì)

1）減小填料粒度，3-5μm；

2）減小柱內(nèi)徑，<1mm；

c.裝填方式

1）干法，填料粒度大于20μm；

2）濕法（勻漿法），粒度小于20μm；(生成勻漿，高壓裝柱）5.檢測(cè)器要求84/-1：具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、響應(yīng)快、現(xiàn)性范圍寬、適用范圍廣、對(duì)流動(dòng)相和溫度波動(dòng)不敏感、死體積小等特點(diǎn).a.紫外光度檢測(cè)器85/11）原理，被分析試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度關(guān)系遵守比爾定律。2）光路圖，圖3-8；3）特點(diǎn)85/3；a.具有很高靈敏度；

b.對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗提.

缺點(diǎn)：不適用于對(duì)紫外光不吸收的試樣.4）發(fā)展85-1；光電二極管211/1024個(gè)陣列檢測(cè)器.

紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：211/1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。光電二極管陣列檢測(cè)器b.熒光檢測(cè)器86/1）原理：許多物質(zhì)，特別是具有對(duì)稱共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光，某些不發(fā)射熒光的物質(zhì)亦可通過(guò)化學(xué)衍生轉(zhuǎn)變成能發(fā)出熒光的物質(zhì)而得到檢測(cè)。當(dāng)入射光強(qiáng)度、試樣池長(zhǎng)度不變時(shí)，稀溶液的熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比。

2）光路圖：圖3-11；

3）特點(diǎn)：熒光檢測(cè)器比紫外光度檢測(cè)器的靈敏度要高2個(gè)數(shù)量級(jí)。但線性范圍僅103，利用可調(diào)諧的激光作光源（激光誘導(dǎo)熒光）可使檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度都得到提高。熒光檢測(cè)器（fluorescencedetector）

高靈敏度、高選擇性應(yīng)用：對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)

c.差示折光檢測(cè)器—通用型87/1）原理：借連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率的方法來(lái)測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器。溶有試樣的流動(dòng)相和純流動(dòng)相之間折射率之差，表示試樣在流動(dòng)相中的濃度。2）類型：偏轉(zhuǎn)式；反射式3）定量方法：偏轉(zhuǎn)式是利用測(cè)量折射角偏轉(zhuǎn)值的大小來(lái)測(cè)定試樣的濃度。4）特點(diǎn)88/-1：幾乎每種物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)，如同GC中熱導(dǎo)池一樣，它是一種通用型的濃度檢測(cè)器。5）不足89/1：a.對(duì)溫度變化敏感；b.不能梯度洗提.d.電導(dǎo)檢測(cè)器89/1）特點(diǎn)：是離子色譜法中使用最廣泛的檢測(cè)器.

不足：電導(dǎo)檢測(cè)器的響應(yīng)受溫度的影響較大，因此要求嚴(yán)格控制溫度.2）原理：利用物質(zhì)電離后產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來(lái)測(cè)定電離物質(zhì)含量.（參P72）3）類型：

a.兩電極電導(dǎo)檢測(cè)器—用于低電導(dǎo)背景的抑制型離子色譜.b.五電極式電導(dǎo)檢測(cè)器90/—用于單柱型離子色譜，它有效地消除了極化和電解效應(yīng)的影響，在高背景電導(dǎo)下仍能獲得極低的噪聲水平，適用于單柱型離子色譜系統(tǒng)。

（5）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是一種通用型的檢測(cè)器，可檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品，而不需要樣品含有發(fā)色基團(tuán)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器靈敏度比示差折光檢測(cè)器高，對(duì)溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器已被廣泛應(yīng)用于碳水化合物、類脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測(cè)。工作原理霧化：液體流動(dòng)相在載氣壓力的作用下在霧化室內(nèi)轉(zhuǎn)變成細(xì)小的液滴，從而使溶劑更易于蒸發(fā)。液滴的大小和均勻性是保證檢測(cè)器的靈敏度和重復(fù)性的重要因素。蒸發(fā)：載氣把液滴從霧化室運(yùn)送到漂移管進(jìn)行蒸發(fā)。在漂移管中，溶劑被除去，留下微?；蚣?nèi)苜|(zhì)的小滴。檢測(cè)：光源采用650nm激光，溶質(zhì)顆粒從漂移管出來(lái)后進(jìn)入光檢測(cè)池，并穿過(guò)激光光束。被溶質(zhì)顆粒散射的光通過(guò)光電倍增管進(jìn)行收集。電信號(hào)的強(qiáng)弱取決于散射室中溶質(zhì)顆粒大小與數(shù)量。Step1.Eluentisnebulizedandsmalldropletsareselectedtominimizebackgroundnoise.Step2.Smalldropletsareevaporatedatlowtemperaturestoavoidlossofcompounds.

Step3.Thesoluteparticlesarefocussed,usinggas-supportedfocusing(GSF)forenhancedsignal-to-noiseratiosandlessmaintenance,anddetectthelightscattering

Step1:Nebulization

ColumneffluentpassesthroughnebulizerneedleMixeswithnitrogengasFormsdispersionofdropletsStep2: