bd 流式基礎知識qj

流式細胞術ForFCMTrainingBD:錢璟2011.9.28重慶流式細胞術？對于處在流動狀態(tài)中的細胞或顆粒各項特性進行檢測FlowCytometryinmotioncellmeasure?特點：速度快(≥10000cells/s)特異性強，靈敏度高(MRD:1/10000)多參數(shù)分析、活細胞分選?

研究對象:單細胞懸液可檢測的樣本種類多樣：外周血、骨髓、細胞穿刺液、洗脫液、實體組織、培養(yǎng)細胞、藻類等流式細胞術FACSVerseAccuriC6LSRforttesa現(xiàn)代流式細胞儀(Flowcytometer)FL2PESSCFSC電子系統(tǒng)計算機系統(tǒng)FL3PerCP,Cy5

FL1FITCLightdetectors液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)laser流式細胞儀工作流程流式細胞儀的構造1.細胞樣本成單列依次通過光檢測區(qū)液流系統(tǒng)2.激發(fā)并收集各種光信號3.光信號轉(zhuǎn)換成電信號，數(shù)字化處理4.數(shù)字信號傳入計算機光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)計算機系統(tǒng)分選系統(tǒng)5.活細胞分選液流系統(tǒng)流動室（Flowcell）LaserSample流體動力學聚焦鞘液：sheathSheathSample

StreamCell樣本流和鞘液流的驅(qū)動一般采用加正壓的方法鞘液壓力恒定，流速不變通過調(diào)節(jié)樣本壓力調(diào)節(jié)樣本進樣速率液流系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng)調(diào)節(jié)樣本進樣速度樣本流與鞘液壓力差改變，樣本流直徑改變，細胞間距改變10psi10psi10psi10psi10psi10.2psi10.4psi10.8psi壓力差樣本流進樣速度分辨率HiLoMedLowpressureHighpressure細胞周期FL301024204830724096Count300280260240220200180160140120100806040200.G0/G1CV=2.42G2/MSphaseG0/G1FL301024204830724096Count340320300280260240220200180160140120100806040200GO/G1CV=7.79.GO/G1CV=7.79流式細胞儀的構造1.細胞樣本成單列依次通過光檢測區(qū)2.激發(fā)并收集各種光信號液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)

激發(fā)光學系統(tǒng):激發(fā)光源—激光透鏡和反射鏡—將激光引導到檢測區(qū)域接收光學系統(tǒng):濾光片等—將產(chǎn)生的光信號引導到對應的光學接收器激發(fā)光學系統(tǒng):將激光引導到檢測區(qū)域，產(chǎn)生光信號激光單波長高強度高穩(wěn)定488nmblue633nmred405nmvioletLightSignals光學棱鏡流式細胞儀檢測信號Injector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluidLaserbeam

1.散射光信號

2.染色過細胞的熒光信號

前向角散射光(FSC)

側向角散射光(SSC)360度立體角通過流式細胞儀我們可以得到---?

相對細胞大小（前向角散射光-FSC）?

相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復雜度（側向角散射光-SSC）?

染色過細胞的相對熒光強度（熒光-Fluoresentlight）前向角散射光（FSC）Forward(AngleLight)Scatter?FSC信號收集方向與激光束相平行?

FSC與被測細胞或顆粒相對大小及表面積相關

FALSSensorLaser前向角散射光（FSC）FSCisproportionaltorelativesize&cell-surfacearea側向角散射光（SSC）Side-scatteredlight

(90DegreeLightScatter)?SSC信號收集方向與激光束相垂直（90°）?

SSC與被測細胞或顆粒內(nèi)部顆粒度和結構復雜度相關FALSSensor90LSSensorLaser側向角散射光（SSC）SSCisproportionaltocellgranularityorinternalcomplexity.散射光（FSC&SSC）

散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基本形態(tài)上的差異

?通常使用“散點圖”來看散射光信號

?散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數(shù)據(jù)eg.MajorleucocytesubpopulationscanbedifferentiatedusingFSCandSSC.Figure:CellsubpopulationsbasedonFSCvsSSCDualParameterdot-plot流式細胞儀檢測信號Injector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluidLaserbeam

1.散射光信號

2.染色過細胞的熒光信號

自發(fā)熒光信號特異性熒光信號熒光信號（Fluoresentlight）雙色熒光散點圖熒光強度（Fluoresenceintensity）?熒光信號的強度代表被測細胞膜表面抗原強度或細胞內(nèi)物質(zhì)濃度。熒光信號（Fluoresentlight）熒光信號收集方向與激光束相垂直（90°）FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4)接收光學系統(tǒng)接收光學系統(tǒng)：接收光信號,并將光信號引導到對應的接收器中光學濾片460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

LongpassShortpass Bandpass(500+/-25)FACSCalibur光路圖每個探測器前往往為BP，所以每個探測器只能接收特定波長范圍的光信號FL1:515nm-545nm光學探測器光電二極管---FSCPhotodiodes光電倍增管---SSC&Fluoresence

Photomultipliertubes(PMTs)光電轉(zhuǎn)換器：

將光信號轉(zhuǎn)換為電信號流式細胞儀的構造3.光信號轉(zhuǎn)換成電信號，數(shù)字化處理1.細胞樣本成單列依次通過光檢測區(qū)2.激發(fā)并收集各種光信號液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)將光信號轉(zhuǎn)化為電信號（模擬信號）將模擬信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號計算每個脈沖峰和計算機連接以傳出數(shù)據(jù)將光信號成比例的轉(zhuǎn)換成電信號，并進行數(shù)字化處理后傳入計算機光信號轉(zhuǎn)換為電信號LinearAmplificationLogAmplificationorVoltageTimeVoltagePMT電壓電信號

電壓脈沖的產(chǎn)生—模擬信號LaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage1當微粒通過激光束時，脈沖開始。此時，激光強度和信號強度都很低。2當微粒達到激光束中間時，脈沖達到最大強度或者高度，此時激光束和信號強度都最高。此時測定峰值強度或者脈沖高度。3當微粒離開激光束時，脈沖減弱。計算一個電壓脈沖峰Time

VoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0面積是對熒光光通量進行積分測量的結果寬度=面積/高度，與顆粒通過激光照射區(qū)的時間成正比特定參數(shù)可選擇面積、寬度信號（DNA含量分析）模擬信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號流式細胞儀的構造3.光信號轉(zhuǎn)換成電信號，數(shù)字化處理4.數(shù)字信號傳入計算機1.細胞樣本成單列依次通過光檢測區(qū)2.激發(fā)并收集各種光信號液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)的獲取表現(xiàn)專業(yè)軟件中的數(shù)據(jù)表現(xiàn)單參數(shù)直方圖雙參數(shù)散點圖三維點圖等高圖密度圖設門（Gating）平均熒光強度百分比流式細胞儀的構造1.細胞樣本成單列依次通過光檢測區(qū)2.激發(fā)并收集各種光信號3.光信號轉(zhuǎn)換成電信號，數(shù)字化處理4.數(shù)字信號傳入計算機液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)計算機系統(tǒng)分選系統(tǒng)5.活細胞分選分選系統(tǒng)檢測加電偏轉(zhuǎn)收集ReviewSortingReviewQuestions在儀器設置中調(diào)高Red參數(shù)的電壓，左圖中群體會發(fā)生什么變化？如何進行流式細胞實驗？1.樣本處理2.熒光染料的選擇3.染色4.數(shù)據(jù)收集和分析1.樣本處理單細胞懸液細胞懸液：直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡便，樣本用血量小灌洗液、體腔積液培養(yǎng)細胞、細胞系實體組織：病理組織：新鮮樣本/石蠟包埋樣本針吸組織：新鮮樣本2.選擇合適的熒光染料★必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)★

激發(fā)光譜必須在探測器能夠接收的合適范圍內(nèi)★根據(jù)抗原表達強弱選擇熒光抗體★熒光素光譜的重疊應當盡量減少熒光信號（Fluoresentlight）Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)Allophycocyanin(APC)633nm紅激光ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm2.選擇合適的熒光染料★必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)★激發(fā)光譜必須在探測器能夠接收的合適范圍內(nèi)★根據(jù)抗原表達強弱選擇熒光抗體★熒光素光譜的重疊應當盡量減少FACSCalibur光路圖每個探測器前往往為BP，所以每個探測器只能接收特定波長范圍的光信號FL1:515nm-545nm2.選擇合適的熒光染料★必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)★激發(fā)光譜必須在探測器能夠接收的合適范圍內(nèi)★根據(jù)抗原表達強弱選擇熒光抗體★熒光素光譜的重疊應當盡量減少2.選擇合適的熒光染料★必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)★激發(fā)光譜必須在探測器能夠接收的合適范圍內(nèi)★根據(jù)抗原表達強弱選擇熒光抗體★熒光素光譜的重疊應當盡量減少熒光光譜重疊與補償530/30585/42利用電子術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的技術稱“熒光補償”熒光補償補償前補償后2.選擇合適的熒光染料★必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)★激發(fā)光譜必須在探測器能夠接收的合適范圍內(nèi)★根據(jù)抗原表達強弱選擇熒光