酶工程第酶生產與純化

酶工程第酶生產與純化合適的酶源？一級生物？足夠酶產量？細胞是否穩(wěn)定？易于后處理？成本高低？純化能否成功？篩選新酶源有機體中轉入新基因傳統(tǒng)/基因技術提高產量改進發(fā)酵條件改進后處理：減少費用和浪費；提高純度更具競爭力、更廉價的目標酶2023/1/122Contentsofchapter2酶的生產及提高酶產量的措施酶的下游處理GoGoGo酶源2023/1/123酶源2023/1/124動植物組織動植物細胞野生微生物重組微生物Enzymesource12%88%2023/1/125-淀粉酶(曲霉)葡萄糖淀粉酶(曲霉，根霉)果膠酶/果膠裂合酶(曲霉)乳糖酶(曲霉，克魯維酵母)蔗糖酶/葡聚糖酶(酵母)微生物凝乳酶(毛霉)葡聚糖酶(青霉)/-淀粉酶(芽孢桿菌)青霉素酰胺酶(芽孢桿菌)支鏈淀粉酶(克雷伯菌/芽孢桿菌)木糖異構酶(芽孢桿菌/鏈霉菌)天冬酰胺酶(大腸桿菌)DNA連接酶(大腸桿菌)過氧化氫酶(肝臟)胰蛋白酶(胰臟)胰凝乳蛋白酶(胰臟)三脂酰甘油脂肪酶(胰臟)凝乳酶（胃）獼猴桃蛋白酶/-淀粉酶(麥芽)脂肪加氧酶(大豆)-葡聚糖酶(麥芽)無花果蛋白酶工業(yè)酶生產所用的原料細菌真菌植物動物2023/1/126微生物產酶之優(yōu)點

微生物種類繁多產酶種類齊全生長周期短繁殖快不受季節(jié)氣候限制培養(yǎng)基來源豐富產酶成本低易變異，用遺傳技術培育高產理想菌株培養(yǎng)簡便易行易管理、工廠化生產2023/1/127安全無毒，非致病菌周期短，產量高遺傳性能穩(wěn)定，不易退化易于酶分離純化易培養(yǎng)，廉價易得產酶菌種的要求新產酶菌種需毒理和動物實驗，食品和醫(yī)藥酶需經有關部門批準。2023/1/128一般產胞內酶主要的酶品種谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等基因工程操作酶：限制性內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等大腸桿菌（）2023/1/129能產生多種胞外酶主要酶品種淀粉酶類：如-淀粉酶（胞外）蛋白酶類：如中性蛋白酶（胞外）磷酸酶類：堿性磷酸酶（細胞間質）、5’-核苷酸酶等枯草桿菌（B.subtilis）2023/1/1210鏈霉菌（Streptomyces）主要酶品種葡萄糖異構酶、青霉素?；?、纖維素酶、幾丁質酶、堿性/中性蛋白酶等含有豐富的16-羥化酶，用于甾體轉化2023/1/1211黑曲霉（Aspergillusniger）可生產多種酶（胞內酶或胞外酶）主要酶品種糖化酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纖維素酶等2023/1/1212廣泛應用于釀造和食品行業(yè)主要酶品種糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶、氨基?；?、磷酸二酯酶、核酸酶等米曲霉（Aspergillusoryzae）2023/1/1213菌落成熟后產紅色色素，顏色較深腐生真菌，能耐受和10%酒精，尤嗜乳酸主要酶品種-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、麥芽糖酶、酯酶等紅曲霉屬（Monascus）2023/1/1214腐生真菌，存在于空氣中及腐爛的物質表面主要菌種和酶的種類產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）葡萄糖氧化酶、纖維素酶、果膠酶、青霉素?；傅乳偾嗝梗≒enicilliumcitrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶、核酸酶等青霉屬（Penicillium）2023/1/1215青霉屬（Penicillium）2023/1/1216主要酶種類纖維素酶亦用于生產17-羥化酶，用于甾體轉化木霉（Trichoderma）綠色木霉(T.viride)的菌落哈茨木霉(T.harzianum)的顯微形態(tài)2023/1/1217主要產酶品種糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等具有11-羥化酶，用于甾體藥物轉化根霉（Rhizopus）2023/1/1218能糖化淀粉，能分解大豆蛋白，多用來做豆腐乳、豆豉主要產酶品種蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等毛霉（Mucor）2023/1/1219廣泛應用于食品工業(yè)，細胞呈圓形、卵形、橢圓形，在麥芽汁培養(yǎng)基上菌落白色有光澤主要產酶品種醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、轉化酶等啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2023/1/1220細胞呈圓形、卵形或長形，出芽成假菌絲，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落乳白色或奶油色主要產酶品種脂肪酶、尿酸酶、轉化酶、醇脫氫酶、17-羥化酶、具烷類代謝的酶系等假絲酵母屬（Candida）2023/1/1221美國食品加工酶及菌種數(shù)目中國食品加工酶及菌種數(shù)目2023/1/1222Howto

Screen

NewEnzymes？采樣產酶菌種篩選產酶菌種改良富集培養(yǎng)，菌種分離2023/1/1223為獲得降解某種物質的產酶菌種，通常在該物質較豐富的地方尋找。a.采樣2023/1/1224木質素酶or纖維素酶

尿酸酶污染物降解酶

2023/1/1225嗜熱酶thermophilicenzyme

嗜冷酶psychrophilicenzyme

嗜酸/嗜堿酶acidphilic/alkaliphilicenzyme

嗜鹽酶halophilicenzyme

極端酶2023/1/1226b.產酶菌種篩選對分離出的菌種做產酶能力檢測，選出理想產酶菌株，包括初篩和復篩兩個階段。初篩：挑出產目的酶的菌株，方法快速、簡便，多采用平板培養(yǎng)透明圈法。復篩：篩選產酶量高、性能更符合要求的菌株，方法更準確，培養(yǎng)方式更符合工業(yè)生產，搖瓶/固體培養(yǎng)。2023/1/1227以淀粉為碳源，在含KI-I2的淀粉培養(yǎng)基上，菌落周圍因分泌出的-淀粉酶將淀粉水解而導致藍色消失，生成“水解圈”。例：-淀粉酶生產菌的篩選2023/1/1228在培養(yǎng)基中添加酪蛋白，經蛋白酶的水解，培養(yǎng)基相應位置變?yōu)槌吻宓摹八馊Α薄＠旱鞍酌干a菌的篩選2023/1/1229c.產酶菌種改良原菌株細胞或孢子懸浮液制備誘變劑處理中間培養(yǎng)初篩復篩突變株分離生產性實驗誘變育種目的基因獲取基因表達載體構建目的基因導入受體細胞目的基因檢測與鑒定基因工程育種2023/1/123023145案例：纖維素酶高產菌誘變育種出發(fā)菌株選擇菌懸液的制備斜面培養(yǎng)基30℃2-4d;斜面孢子搖瓶振20min;過濾稀釋至105-107個/mL菌懸液出發(fā)菌株黑曲霉LH24纖維素酶活力平均12030U/g紫外線誘變處理5mL菌懸液紫外燈30W距30cm,照射1min，打開培養(yǎng)皿照射5min，暗冷藏1-2h誘變菌液于培養(yǎng)基平板,篩出生長良好菌株發(fā)酵,得9株高產株,產酶量14000U/g初篩復篩初篩菌株接種到培養(yǎng)液,3h后測酶活復篩，得3株產酶量>16000U/g

42023/1/1231案例：高產N-乙酰神經氨酸裂合酶的基因工程育種12345按nanA基因設計合成引物;PCR擴增nanA基因酶切PCR產物和質粒;連接轉化培養(yǎng);凝膠電泳重組質粒構建PCR擴增基因基因誘導表達將陽性克隆培養(yǎng);接種于LB培養(yǎng)基;誘導表達離心收集菌體;取上清SDS–PAGE電泳;酶表達量凝膠電泳分析NPL活力測定酶促反應;580nm測吸光度;工程菌酶活提高2023/1/1232d.富集培養(yǎng)，菌種分離菌種分離：自然條件下各類微生物混雜，須分離獲得純種。通常采用平板劃線法和反復稀釋法。

富集培養(yǎng)：通常樣品中所需菌很少，需使所需菌大量生長，不需菌少或不生長，以利于篩選?？煽刂茰囟?、pH，或用底物作營養(yǎng)成分，使所需菌快速生長。2023/1/1233酶的生產及提高酶產量的措施2023/1/1234HOW

AREINDUSTRIALENZYMESMADE？2023/1/1235SeedfermenterAirpetridishflaskFood&NutrientsCellRomovalCellstoCompostingConcentrationPurificaitonModificationpreservativesBlendingDrying

HeatLiquids

PowdersShiptocustomersAirLargefermenterRefinningProductionDownstream2023/1/1236案例：枯草桿菌液態(tài)發(fā)酵產納豆激酶菌種斜面搖瓶培養(yǎng)種子罐發(fā)酵罐發(fā)酵液低溫離心超濾濃縮低溫沉淀離心真空抽干粉碎成品碳源：麥芽糖,木糖,蔗糖(1.5-4%)或麥芽汁+酵母膏(0.1-2%)氮源：大豆蛋白胨、豆餅粉(2-5%質量比)或豆?jié){無機鹽：KH2PO4(0.1%),K2HPO4(0.3%),MgSO4(0.05%),CaCl2(0.02%)發(fā)酵罐：通氣量/min1:0.5~1:1(V/V),攪拌200-400r/min，罐溫36.5-37.5℃,罐壓2023/1/1237WhatFactorsAffectEnzymeProduction？2023/1/1238CulturemediumpHTemperatureDissolvedO2

etc.Fermentationprocess

Biosynthesisprocess

2023/1/12392.2.1酶生物合成的調節(jié)蛋白質的生物合成——翻譯中的生物調節(jié)RNA的生物合成——轉錄中的生物調節(jié)（基因調節(jié)）2023/1/12402023/1/1241a.大腸桿菌生產——半乳糖苷酶，-半乳糖苷酶，硫代半乳糖苷轉乙酰酶E.Coligrwonin

glucosemedium，

grwonin

lactosemedium，

b.大腸桿菌生產——色氨酸合成酶E.Coligrwonin

glucosemedium，

grwonin

glucosemediumaddingtryptophan，Why？

c.大腸桿菌生長E.Coligrwonin

glucoseandlactosemedium———“biphasicgrowth”葡萄糖耗盡后才利用乳糖，兩個對數(shù)生長期2023/1/1242調節(jié)基因操縱基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關閉啟動子ORPLacZLacYLaca調節(jié)基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達mRNAa.酶的誘導：乳糖操縱子乳糖酶的誘導

乳糖

阻遏蛋白（有活性）-Galactosidase，permease，acetylase2023/1/1243調節(jié)基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達調節(jié)基因操縱基因結構基因輔阻遏物trp代謝產物與阻遏蛋白結合，使構象變化，與操縱基因結合，結構基因不能表達b.酶的反饋阻遏：色氨酸操縱子2023/1/1244c.酶的分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關系cAMPcAMP：環(huán)腺苷酸；CAP：環(huán)腺苷酸受體蛋白或降解物基因活化蛋白降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)2023/1/1245酶的誘導和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑2023/1/1246調控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結合阻遏效應舉例酶的誘導有活性－＋不轉錄，繼而不翻譯誘導物－轉錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調控作用對比2023/1/12473水解4蛋白質水解2阻遏作用1Addinducer2Controlrepression3ReducemRNAhydrolysis1誘導活化5形成包含體6缺少輔因子4Reduceproteasesorincreasechaperon5ReduceproteinsynthesisbyT6Increasecofactorsynthesis2023/1/12482.2.2酶發(fā)酵過程的控制

2.2.2.3.發(fā)酵條件對產酶的影響2.2.2.2.發(fā)酵產酶動力學2.2.2.1.酶生物合成的模式GoGoGo2023/1/12492.2.2.1.酶生物合成的模式微生物細胞生長曲線（四階段）0-A調整期（延遲期）A-B生長期（對數(shù)生長期）B-C平衡期C-D衰退期總細胞濃度活細胞濃度2023/1/1250時間細胞/酶濃度時間細胞/酶濃度時間細胞/酶濃度時間細胞/酶濃度同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型酶的生物合成模式

—根據(jù)酶產生與細胞生長的關系細胞濃度酶濃度2023/1/1251酶的生物合成與細胞生長同步進行（生長偶聯(lián)型）大部分組成酶和部分誘導酶屬于此類。酶對應的mRNA很不穩(wěn)定時間細胞/酶濃度A.同步合成型組成酶：細胞中一直存在的酶，其合成僅受遺傳物質控制。在細胞中的量比較恒定，環(huán)境因素影響不大。誘導酶：在環(huán)境中有誘導物存在時而產生的酶，其合成取決于基因控制和環(huán)境影響。在細胞中含量變化很大。細胞濃度酶濃度2023/1/1252例：米曲霉在含有單寧或沒食子酸的培養(yǎng)基中生產單寧酶[tanaseEC3.1.1.20]細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細胞濃度活細胞濃度胞外酶濃度胞內酶濃度2023/1/1253酶合成隨細胞生長而開始，細胞進入平衡期后，酶能延續(xù)合成一段時間。屬此類的酶可以是組成酶，也可以是誘導酶。酶所對應的mRNA穩(wěn)定性好。時間細胞/酶濃度B.延續(xù)合成型細胞濃度酶濃度2023/1/1254例：黑曲霉在以半乳糖醛酸或純果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中，誘導產生聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，）細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導物細胞濃度酶濃度2023/1/1255酶合成在細胞生長一段時間后才開始，細胞進入平衡期后酶的合成隨之停止酶合成受產物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏作用酶所對應的mRNA穩(wěn)定性較差時間細胞/酶濃度C.中期合成型細胞濃度酶濃度2023/1/1256例：枯草桿菌堿性磷酸酶[EC3.1.3.1]受其水解產物磷酸的反饋阻遏作用細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度酶濃度2023/1/1257當細胞生長一段時間或進入平衡期后，才開始合成并大量積累酶。許多水解酶屬于此類。阻遏物延緩了酶的合成。此類酶mRNA穩(wěn)定性好。時間細胞/酶濃度D.滯后合成型細胞濃度酶濃度2023/1/1258例：黑曲霉生產羧基蛋白酶[EC3.4.23.6]細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度酶濃度2023/1/1259酶的生物合成模式總結關鍵因素酶對應的mRNA穩(wěn)定性培養(yǎng)基中是否存在阻遏物延續(xù)合成型是最理想的合成模式通過基因工程、代謝工程、細胞工程等手段，篩選優(yōu)良菌株，使合成模式接近延續(xù)合成型mRNA穩(wěn)定性阻遏物2023/1/12602.2.2.2.發(fā)酵產酶動力學產酶動力學主要研究細胞產酶速率以及各種環(huán)境因素對產酶速率的影響規(guī)律。宏觀產酶動力學：從整個發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細胞的產酶速率微觀產酶動力學：從細胞內部著眼，研究細胞中酶合成速率2023/1/1261宏觀產酶動力學表明，產酶速率與細胞比生長速率

、細胞濃度以及細胞產酶模式有關。式中X——細胞濃度(g/L)

——細胞比生長速率(h-1) ——生長偶聯(lián)的比產酶系數(shù)(IU/g) ——非生長偶聯(lián)的比產酶速率(IU/(gh))E——酶濃度(IU/L)t——時間(h)產酶動力學方程：2023/1/1262生長偶聯(lián)型（同步/中期合成型）部分生長偶聯(lián)型(滯后合成型)非生長偶聯(lián)型(延續(xù)合成型)

2023/1/12632.2.2.3.發(fā)酵條件對產酶的影響A.細胞活化與擴大培養(yǎng)B.培養(yǎng)基C.pH值D.溫度E.溶解氧2023/1/1264A.細胞活化與擴大培養(yǎng)菌種保藏：短期保藏、長期保藏菌種活化：使用前接種于新鮮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)以恢復細胞生命活動能力擴大培養(yǎng)：為保證發(fā)酵時有足夠數(shù)量的優(yōu)質細胞，活化細胞要經一級至數(shù)級擴大培養(yǎng)一般培養(yǎng)到細胞處于對數(shù)生長期為宜采用孢子接種，則應培養(yǎng)至孢子成熟期2023/1/1265培養(yǎng)基的組成碳源、氮源、水、無機鹽、生長因子……根據(jù)微生物種類和生長條件確定培養(yǎng)基，同種細胞用于不同的酶生產，培養(yǎng)基成分不一樣生長、增殖、發(fā)酵、產酶等各階段所需有區(qū)別種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基不一樣盡量減少培養(yǎng)基中對產酶的阻遏作用的物質B.培養(yǎng)基的影響2023/1/1266pH值對發(fā)酵產酶的影響影響酶解離、電荷分布、構象和酶活、膜通透性、底物和產物的性質改變酶之間的產量比例產酶最適pH值：通常接近酶反應最適pH值，但一般不同于細胞生長的最適pH值pH的變化：隨細胞生長培養(yǎng)基pH會發(fā)生變化pH的調控：培養(yǎng)基組分、比例、緩沖液、酸堿、補料C.pH值的調節(jié)和控制2023/1/1267產酶溫度產酶溫度往往低于生長溫度較低溫度mRNA穩(wěn)定性較高，延續(xù)酶的合成溫度過低微生物代謝減慢，延長發(fā)酵周期溫度的變化因細胞新陳代謝和熱量擴散，溫度不斷變化溫度的調節(jié)熱水升溫冷水降溫D.溫度的調節(jié)和控制2023/1/1268KO2

——

耗氧速率，指單位時間內單位體積培養(yǎng)液中細胞的耗氧量，(mmolO2)·h-·L-1QO2

——

細胞呼吸強度，指單位細胞量在單位時間內的耗氧量，(mmolO2)·h-1·(gDC)-1Ccell

——

細胞濃度，單位體積培養(yǎng)液中細胞質量，(gDC)·L-1E.溶解氧的調節(jié)控制

Kd

——溶氧速率（溶氧系數(shù)），單位體積發(fā)酵液在單位時間溶解氧的量，(mmolO2)·h-1·L-1當Kd=KO2時，培養(yǎng)液中溶氧量保持恒定2023/1/1269溶氧量的調節(jié)方法通氣量：增大通氣量提高KdO2

分壓：提高O2

分壓，可增加O2

溶解度，提高Kd氣液接觸時間：延長接觸時間，可增加O2

溶解量氣液接觸面積：增大接觸面積能提高Kd培養(yǎng)液黏度：黏度大易產生泡沫，影響O2溶解2023/1/1270HowtoImproveEnzymeOutput？2023/1/12712.2.3.1.添加誘導物對于誘導酶的發(fā)酵生產，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物一般可以分為3類酶的作用底物酶的催化反應產物作用