免疫學(xué)常用實驗方法

CommonlyusedimmunologicalmethodsZhihaiQinInstituteofBiophysicsChineseAcademyofSciencesZhihai@Ag-Abreation:

ELISA,Immunohistochemistry,FACS,Westernblot,Hybridoma&monoclonalantibodyCellfunction:

proliferation3H－TdRMTTCFSECytotoxicity51CrAnimalexperiment非共價鍵結(jié)合I.Antigen-AntibodyReaction抗體的互補決定區(qū)(CDRs)抗原決定簇(antigenicdeterminant)又稱表位(epitope)非共價鍵結(jié)合CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3CDR:ComplementarityDeterminingRegionFR:FrameworkRegionFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4HLComplementarity-determiningregions(CDRs):

AntigenicDeterminantSpecificity特異性

FeaturesofAg-AbReactionReversibility可逆性

Ag+Ab→Ag·Ab

解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。在一定條件下(如低pH、高濃度鹽等)可以解離。Ratio最適比例Sensitivity敏感性化學(xué)比色法：mg/ml酶反應(yīng)測定法：5-10μg/ml(免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿)標記的免疫測定法：ng/ml水平(例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml)

ELISA------酶聯(lián)免疫吸附試驗Immunohistochemistry--------免疫組織化學(xué)FACS------流式細胞術(shù)WesternBlotting-------免疫印跡技術(shù)Oftenusedmethods1.ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)RIA(radioimmunoassay,Berson&Yalow，1960)IRMA(immunoradiovelricassay,Miles&Hiles,1968)E(L)I(S)A(Engvall&Perlmann,vanWeemenandSchuurs,1971)Copyright?2005AmericanAssociationforClinicalChemistryLequin,R.M.ClinChem2005;51:2415-2418Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2005Figure.Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2005.ThesearchwasdoneinFebruary2005inPubMed/NationalLibraryofMedicine,NIH,withthesearchterms:enzyme-immunoassay,enzyme-linkedimmunosorbentassay(EIA/ELISAcombined),andRIA.(Ordinate),numberofarticlesinwhichthekeywordsarequoted.(Abscissa),5-yearperiodsfrom1960to2005.

,combinedEIA/ELISA;

,RIA.[Note:Idonotpretendthatthenumbersinthisfigureareprecise;thetrends,however,areevident.]

基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化抗原或抗體的酶標記用途：目標蛋白的定性或定量分析

三個必要試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）;（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。

ELISAa.包被b.抗原抗體反應(yīng)c.酶促反應(yīng),顯色d.終止顯色，讀取數(shù)據(jù)。ELISA基本的實驗過程對照和標準曲線陽性對照陰性對照定量測定：標準品制作標準曲線待測樣品的合理稀釋不同類型的檢測方法2.Immunohistochemistry(免疫組化)原理：抗原抗體反應(yīng)，抗體標記技術(shù)（熒光、酶）用途：組織或細胞內(nèi)抗原的定性和定位流程：Copyright?2007AmericanAssociationforCancerResearchZhao,X.etal.CancerRes2007;67:4443-4450Figure3.mTNFinducesinfiltrationofinnateimmunecellsandangiostasisintumorsfromTNFR1–/–butnotTNFR1–/–/R2–/–mice.AtoF,TNFR1–/–miceorTNFR1–/–/R2–/–micewereinjecteds.c.with5x106ofJ-mTNF10cells.Tendaysaftertumorcellchallenge,tissuesectionsoftheinjectionsitewerestainedforMac-1+(AandB),Gr-1+(CandD),andCD31+(EandF)cellsasindicated.GandH,forconfocalmicroscopyanalysis,tissuesectionswerestainedwithCy3-labeledanti-CD31forbloodvesselendothelialcells(green)andtheVasoTACSinsitukittodetectapoptosis(red).Arrows,apoptoticendothelialcellsinthetumor.成敗的關(guān)鍵因素：組織的固定、包埋抗體（特異性、濃度、孵育溫度和時間）非特異性抗原的封閉內(nèi)源性酶或自發(fā)熒光的消減顯色思考：為什么有的抗體能用于冰凍切片卻不能用于石蠟切片？3.FlowCytometricanalysis(流式細胞術(shù))FACS:(Fluorescence-ActivatedCellSorter)BDFACSVantageBD-Calibur測量對象

大小懸浮在溶液中的相互離散顆粒大小范圍：0.2μm-300μm

高等真核細胞類型酵母細胞類型細菌 多細胞的聚集體，如胰島等。細胞核非生命顆粒染色體其它細胞器以及乳化微球等。

細胞表型分析胞內(nèi)細胞因子的檢測細胞周期和DNA倍體分析細胞分選主要用途（1）多參數(shù)定量分析每一個細胞；

（2）細胞分選；高純度：99%以上；可分析小于1/10000比例的稀有細胞群、單細胞克隆等。

(3）高通量（分析分選）．分析150，000個/秒分選100，000個/秒

特點

基本結(jié)構(gòu)工作原理二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光a.光信號收集分離，導(dǎo)向，各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)

線性線性

線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果b.數(shù)據(jù)處理c.細胞分選488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細胞溶解后）顆粒度細胞大小流式細胞儀數(shù)據(jù)分析非熒光信號直方圖分析熒光信號點狀圖分析設(shè)門分析

可以通過設(shè)“門”(Gate)，分析、分選感興趣的細胞。

實驗對照的設(shè)計

陰性對照：常用同型抗體對照陽性對照：單陽性對照（多色分析時用于儀器校正）

抗體的選擇

首選直標抗體熒光分子

實驗標本的處理

單細胞懸液的制備抗體濃度非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉

4.WesternBlott5.HybridomaTechnique&MonoclonalAntibodyPreparationJerme，K?hlerandMilstein1984NobelPrizeBcellMyelomaSecreteAbClonalAclonalcelllinesecretingspecificAb?BcellMyelomaFusionBcellBcell+BcellBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaaliveBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaDNAA(氨基喋呤)HGPRT+，TK+

H,次黃嘌呤

T,胸腺嘧啶HGPRT-，TK-DieHGPRT-，TK-

H,次黃嘌呤

T,胸腺嘧啶AclonalcelllinesecretingspecificAb---HybridomaHGPRT次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)TK胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase)PreparingmAbsfrommurineascitesPristane(i.p.)Hybridoma(i.p.)ascitesMonoclonalantibodyELISAII.AssayforcellfunctionProliferation:Tcell,tumorcell,…Cytotoxicassay:Tcell,NKcell,…CellProliferationStimulatorsNonspecific:Mitogen:LPS,ConA,PHASuperantigen(超抗原):SEBCytokine:IL2,IL4,TNFAntibody:CD3,TCR,CD28Specific:specificantigen:破傷風(fēng)類毒素，PPD(純結(jié)核蛋白衍生物)MHC:同種異體細胞(MLR,混合淋巴細胞培養(yǎng))AssayforTcellproliferation3H-TdRwashStimulateAssaya.3H-TdRb.MTTAssayMechanism:

操作簡單，重復(fù)性差c.CFSEFigure15.67FollowingcellproliferationinhumanperipheralbloodlymphocytesusingtheCellTraceCFSECellProliferationKitC34554).HumanperipheralbloodlymphocyteswereharvestedandstainedwithCellTraceCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester;5(6)-CFDA,SE)onDay0.AportionofthepopulationwasarrestedattheparentgenerationusingmitomycinC(redpeak).Theremainderofthesamplewasstimulatedwithphytohemagglutininandallowedtoproliferatefor5days.Solidgreenpeaksrepresentsuccessivegenerations./handbook/figures/2018.html

CELLproliferationAssayforTcellcytotoxicityTargetcell51CrlabeledTargetcellCTLTargetcellCr51releaseAssayCTL51CrreleaseIsolationofstemcells密度梯度離心法單抗貼壁鋪展法免疫磁珠分選流式細胞分選法III.TechnologyinvolvedinstemcellresearchIndentificationofstemcellsFACS：造血干細胞可鑒定如下marker—CD34，CD33，Sca-1，c-Kit顯微鏡技術(shù)：生長形態(tài)，核型人類骨髓干細胞體內(nèi)分化：胚胎干細胞在裸鼠體內(nèi)生長分化，形成包含三個胚層來源的良性畸胎瘤基因芯片：分析基因表達差異Cultureofisolatedstemcells以鼠胚胎干細胞培養(yǎng)為例：1，飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)2，飼養(yǎng)層的制備—MEF分離3，小鼠胚胎干細胞分離培養(yǎng)1）內(nèi)細胞團的分離與培養(yǎng)2）ES樣細胞擴增3）單細胞克隆建系4）鑒定—絲裂霉素C處理或Gγ射線照射DifferentiationofStemCells懸浮培養(yǎng)法—不同的培養(yǎng)基及細胞因子共培養(yǎng)—與不同的支持細胞共培養(yǎng)III.AnimalexperimentImmunedeficientmice裸小鼠(nudemice)，無毛，先天性胸腺發(fā)育不良，T細胞功能缺失。SCID：Severecombinedimmunedeficiency嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠T、B淋巴細胞功能均缺失Avarietyofknock-outmice:

μMT,RAG1-/-,RAG2-/- IFNγ-/-,IL4R-/-…Transgenicmice:GFP-transgenicmiceGenerationoftransgenicmiceAnimalexperimentsIsolatelymphocytesfromspleenorlymphnodesIsolatetumorcellsfromtumortissue.Adoptivetransfer:T,B,sera…

BoneMarrowChimeraAdvancedanimalexperimentSkingraftThankYou!TopicsImmune-mediatedangiostasisintumor