紫外可見分光光度法

紫外可見分光光度法2023/1/131編輯ppt概述基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱吸光光度法，它包括比色法和分光光度法。紫外-可見分光光度法是研究物質(zhì)在紫外、可見光區(qū)的分子吸收光譜的分析方法。它屬于分子光譜法的一種，是利用某些物質(zhì)的分子吸收200～800nm光譜區(qū)的輻射來進行分析測定的方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于無機和有機物質(zhì)的定性、定量測定。2023/1/132編輯ppt當一束太陽光照射某一溶液時，太陽光中某一顏色的光被吸收，其互補色光透過溶液，刺激人的眼睛，使人感覺到它的顏色。溶液顏色與光吸收的關(guān)系可見光波長及其互補光實例：1)高錳酸鉀吸收綠光顯紫紅色；2)重鉻酸鉀吸收藍光顯黃色；3)鄰菲羅啉鐵溶液吸收藍綠光顯紅色。2023/1/133編輯ppt完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光2023/1/134編輯ppt

根據(jù)溶液的顏色，可以估計該溶液吸收的光的波長。/nm顏色互補色400-450紫黃綠450-480藍黃480-490綠藍橙490-500藍綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍610-650橙綠藍650-760紅藍綠2023/1/135編輯ppt分光光度法的發(fā)展過程分光光度法在發(fā)展過程中先后經(jīng)過了目視比色法，光電比色法和分光光度法三個階段。（1）目視比色法是一種用眼睛辨別顏色深淺，以確定待測組分含量的方法。（2）光電比色法是使用光電比色計測量溶液吸光度并計算待測組分含量。（3）分光光度法是應(yīng)用分光光度計，通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸光度，對該物質(zhì)進行定性、定量分析的方法。它包括紫外分光光度法、可見光分光光度法、紅外分光光度法等。

2023/1/136編輯ppt測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度(即吸光度A)，然后以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得到一條曲線，稱為吸收光譜曲線(簡稱吸收曲線)。吸收光譜示意圖吸收曲線及常用術(shù)語2023/1/137編輯ppt透過光的強度It與入射光的強度I0之比稱為透光度，用T表示。常用百分數(shù)表示：T=It/I0

為了表示物質(zhì)對光的吸收程度，常采用吸光度A這一概念，即透光度倒數(shù)的對數(shù)值。A=lg（I0/It）=lg（1/T）=－lgT

1.透光度T和吸光度A

朗伯—比耳定律2023/1/138編輯ppt2.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。

A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。

A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，其數(shù)學(xué)表達式為：

A=εbc

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。2023/1/139編輯ppt

A=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L-1；

ε：摩爾吸收系數(shù)，單位L·mol-1·cm-1。（講解78頁例題）

摩爾吸收系數(shù)越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。

ε>105：超高靈敏；

ε=(6～10）×104：高靈敏；

ε<2×104

：不靈敏。摩爾吸收系數(shù)2023/1/1310編輯ppt吸光度的加和性在某一波長下，當溶液中含有多種物質(zhì)成分時，如果它們之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，則體系在該波長的總吸光度等于各組分吸光度之和，稱之為吸光度的加和定律。

A＝A1十A2十…十An

＝e1bC1十e2bC2十…十enbCn2023/1/1311編輯ppt

光吸收定律的適用范圍朗伯—比耳定律適用于1.使用單色光為入射光；2.溶液均勻，非散射光；3.溶液為稀溶液。

在實際工作中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)標準曲線不成直線的情況，特別是當吸光物質(zhì)的濃度高時。

AC2023/1/1312編輯ppt引起偏離朗伯—比耳定律的原因

1非單色光作為入射光引起的偏離

為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。圖2-4非單色光的影響212023/1/1313編輯ppt2．溶液濃度的影響

當溶液濃度較大時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了它對光的吸收。因此，朗伯-比耳定律只適用于稀溶液。3．化學(xué)反應(yīng)的影響溶液中存在著解離、締合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡，化學(xué)平衡與濃度、pH等其他條件密切相關(guān)。不同條件可導(dǎo)致吸光質(zhì)點濃度變化，吸光性質(zhì)發(fā)生變化而偏離朗伯-比耳定律。消除方法為控制反應(yīng)條件。例如，在鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：2CrO42-+2H+Cr2O72-+H2O。CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不同。用光度法測定CrO42-或Cr2O72-含量時，溶液濃度及酸度的改變都會導(dǎo)致平衡移動而發(fā)生對朗伯-比耳定律的偏離，為此應(yīng)加入強堿或強酸作緩沖溶液以控制酸度。4．非平行光和光散射的影響

當入射光是非平行光時，所有光通過介質(zhì)的光的光程不同，引起小的偏離。另外，當溶液中含有懸浮物或膠粒等散射質(zhì)點時，入射光通過溶液時就會有一部分光因散射而損失掉，使透過光強度減小，測得的吸光度增大，從而引起偏離吸收定律。2023/1/1314編輯ppt紫外可見分光光度計光源單色器吸收池檢測器顯示系統(tǒng)0.575光源單色器吸收池檢測器顯示2023/1/1315編輯ppt作用--提供入射光

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500

nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈，發(fā)射200～375nm的連續(xù)光譜。1.光源2023/1/1316編輯ppt

2.單色器

作用：將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。2023/1/1317編輯ppt3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。

在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。

注意：用作盛空白溶液的比色皿與盛試樣溶液的比色皿應(yīng)互相匹配，即有相同的厚度與相同的透光性。為了減少反射損失，比色皿的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。

不能用手指拿比色皿杯的光學(xué)面，用后要及時洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。

2023/1/1318編輯ppt4.檢測器

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.顯示系統(tǒng)

檢流計、數(shù)字顯示、計算機進行儀器自動控制和結(jié)果處理。2023/1/1319編輯ppt紫外可見分光光度計的類型按光路結(jié)構(gòu)可分為：1.單波長單光束分光光度計(如上分廠的721型、722型)；2.單波長雙光束分光光度計(如國產(chǎn)710型，730型)；3.雙波長雙光束分光光度計(如國產(chǎn)WFZ800-5型）2023/1/1320編輯ppt紫外可見分光光度的使用2023/1/1321編輯ppt2023/1/1322編輯ppt721分光光度計操作步驟1.預(yù)熱儀器。為使測定穩(wěn)定，將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。預(yù)熱儀器和不測定時應(yīng)將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。2.選定波長。根據(jù)實驗要求，轉(zhuǎn)動波長調(diào)節(jié)器，使指針指示所需要的單色光波長。3.固定靈敏度檔。旋動靈敏度檔，使其固定于某一檔，在實驗過程中不再變動。一般測量固定在“1”檔。4.調(diào)節(jié)“0”點。輕輕旋動調(diào)“0”電位器，使讀數(shù)表頭指針恰好位于透光度為“0”處（此時，比色皿暗箱蓋是打開的，光路被切斷，光電管不受光照）。5.調(diào)“0”和調(diào)“100％”。比色皿中裝入?yún)⒈热芤航?/5,放入比色皿座架的第一格內(nèi)，其它格內(nèi)放入樣品或標樣，把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上，用參比溶液重復(fù)調(diào)“0”和“100%”,至儀器穩(wěn)定。6.測定。輕輕拉動比色皿座架拉桿，使樣品或標樣溶液進入光路，此時表頭指針所示為該溶液的吸光度A。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。7.關(guān)機。實驗完畢，整理儀器，切斷電源。將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。2023/1/1323編輯ppt液晶顯示屏氘燈鎢燈室操作鍵盤比色皿室

島津UV1700紫外可見分光光度計2023/1/1324編輯ppt分光光度計使用注意事項

對儀器工作環(huán)境的要求

穩(wěn)固的工作臺

溫度、濕度合適

儀器保養(yǎng)和維護方法

儀器工作電源光源使用注意事項單色器使用注意事項正確使用吸收池2023/1/1325編輯ppt比色皿的使用(1)要根據(jù)所使用的波長來選擇比色皿。石英比色皿和普通硅酸鹽玻璃比色皿兩種。(2)選擇配對良好的比色皿。根據(jù)國家檢定規(guī)程的要求比色皿間的偏差不得超過0.5%，所以比色皿在使用之前，要對比色皿進行透光測定，把偏差小于0.5%的比色皿配對使用。(3)選擇合適厚度的比色皿。常用比色皿厚度有1、2、3、5、10cm等，在實際分析工作中，通常根據(jù)溶液濃度的不同，選用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7之間。(4)對有揮發(fā)性的樣品，選擇帶蓋比色皿。1.比色皿的選擇2023/1/1326編輯ppt2.比色皿的使用方法(1)拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。(2)不得將光學(xué)面與硬物或臟物接觸。(3)測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液潤洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。(4)盛裝溶液時，高度為比色皿的4/5處即可。(5)比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。(6)凡含有腐蝕玻璃的物質(zhì)的溶液，不得長期盛放在比色皿中。(7)不能將比色皿放在火焰或電爐上進行加熱或干燥箱內(nèi)烘烤。2023/1/1327編輯ppt3.比色皿的清洗(1)每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈比色皿。清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1:2）浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或鉻酸洗液等氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。(2)不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。2023/1/1328編輯ppt顯色和分析條件的選擇1.入射光波長的選擇

一般應(yīng)該選擇λmax為入射光波長。這樣可以提高分析結(jié)果的準確度和靈敏度。如果λmax處有共存組分干擾時，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。2023/1/1329編輯ppt濃度測量值的相對誤差（Δc/c）不僅與儀器的透光度誤差ΔT有關(guān)，而且與其透光度讀數(shù)T的值也有關(guān)。ΔT=1%，溶液濃度相對誤差Δc/c與其透光度T的關(guān)系曲線如右圖。由圖可見ΔT=1%，T在20%～65%之間時，濃度相對誤差較小，此為最佳讀數(shù)范圍。所以要求選擇適宜的吸光度范圍（0.2-0.7），以使測量結(jié)果的誤差最小。3.吸光度范圍的控制

措施：（a）控制溶液的濃度；（b）選擇不同厚度的比色皿，改變光程長度。2.狹縫寬度的選擇2023/1/1330編輯ppt

1.顯色反應(yīng)2.對顯色反應(yīng)的要求*靈敏度高:一般ε>104。*選擇性好：顯色劑僅與被測離子發(fā)生顯色反應(yīng)。*對照性好：顯色劑在測定波長處無明顯吸收,

λmax>60nm。*反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定。*顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。反應(yīng)條件的選擇2023/1/1331編輯ppt顯色反應(yīng)條件的選擇1.顯色劑用量

吸光度A與顯色劑用量CR的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。2.反應(yīng)體系的酸度

在相同實驗條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應(yīng)的pH范圍。3.顯色時間與溫度

實驗確定。4.溶劑

一般盡量采用水相測定。吸光度與pH的關(guān)系曲線2023/1/1332編輯ppt參比溶液的選擇一般有一下幾種情況：1.溶劑參比若僅待測組分與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物在測定波長處有吸收，而被測試液、顯色劑及其他試劑均無吸收，則可用純?nèi)軇┳鲄⒈热芤骸?/p>

2.試劑參比若顯色劑或其他試劑在測定波長處略有吸收，而試液本身無吸收，則可用“試劑空白”（不加被測試樣的試劑溶液）作參比溶液。3.試液參比

若待測試液本身在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，可用“試樣空白”（不加顯色劑的被測試液）作參比溶液。4.其它參比若顯色劑、試液中其他組分在測定波長處有吸收，則可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑作為參比溶液。5.選擇適當?shù)膮⒈热芤?023/1/1333編輯ppt1.干擾(1)與試劑生成有色配合物。如用鉬藍法測定硅時，磷也能生成磷鉬藍，使測定結(jié)果偏高。(2)干擾離子本身有顏色。(3)與試劑反應(yīng)，生成的配合物雖然無色，但要消耗大量顯色劑，使被測離子的顯色反應(yīng)不完全。(4)與被測離子結(jié)合成離解度小的另一種化合物。使被測離子與顯色劑不反應(yīng)。共存離子的干擾及消除方法2023/1/1334編輯ppt（1）控制酸度提高反應(yīng)的選擇性，保證主反應(yīng)進行完全，以避免干擾。（2）加入掩蔽劑選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應(yīng)；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應(yīng)產(chǎn)物不干擾待測組分的測定。（3）選擇適當?shù)膮⒈热芤海?）選擇適當?shù)牟ㄩL（5）利用氧化還原反應(yīng)改變干擾離子的價態(tài)，使干擾離子不與顯色劑反應(yīng)。例如用鉻天菁S光度法測定Al3+時，加入抗壞血酸作掩蔽劑將Fe3+還原為Fe2+，消除Fe3+的干擾。（6）分離干擾離子（7）利用導(dǎo)數(shù)光譜、雙波長等新技術(shù)干擾的消除方法2023/1/1335編輯ppt定量分析（1）標準曲線法（單組分分析）

配制一系列的標準溶液，其濃度包括待測樣品的濃度范圍，在干擾少的吸收峰波長處，測定其吸光度A與濃度c的標準曲線，待測樣品溶液在相同條件下進行測量，根據(jù)測得的吸光度Ai值，從標準曲線上即可查出相應(yīng)的濃度Ci。

CACiAi0紫外－可見光譜法的應(yīng)用2023/1/1336編輯ppt（2）標準對照法（單組分分析）

當樣品溶液遵守比耳定律時，可在同樣測量條件下測量標準溶液及待測樣品溶液，測量到的吸光度分別為A標和A樣，根據(jù)比耳定律可得到：

式中：C標是已知的，因此待測樣品溶液的濃度C樣可計算出來。這種方法的誤差比標準曲線法要大些，但不需做標準曲線因而要簡便些。

2023/1/1337編輯ppt（3）解聯(lián)立方程法（多組分分析）

以溶液中存在兩個組分為例來說明，可在兩個波長1及2處測量待測溶液的吸光度，設(shè)它們分別為A1及A2，則：

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1處測得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2處測得A2)xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y標液在1,2處分別測得2023/1/1338編輯ppt（4）雙波長分光光度法（多組分分析）

不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(λ1和λ2)；以參比波長λ1處的吸光度Aλ1作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。

ΔA

＝Aλ2－Aλ1＝(ελ2－ελ1)bc

兩波長處測得的吸光度差值ΔA與待測組分濃度成正比。ελ1和ελ2分別表示待測組分在λ1和λ2處的摩爾吸光系數(shù)。

2023/1/1339編輯ppt選擇波長組合λ1、λ2的基本要求是：

⑴選定的波長λ1和λ2處干擾組分應(yīng)具有相同吸光度，即：ΔAy=ΔAyλ2－ΔAyλ1=0故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2－εxλ1)bcx此時：測得的吸光度差ΔA只與待測組分x的濃度呈線性關(guān)系，而與干擾組分y無關(guān)。若x為干擾組分，則也可用同樣的方法測定y組分。

可采用作圖法選擇符合上述兩個條件的波長組合。

⑵在選定的兩個波長λ1和λ2處待測組分的吸光度應(yīng)具有足夠大的差值。2023/1/1340編輯ppt原理

普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當待測組分含量較高時，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差分光光度法，簡稱為示差法。采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。設(shè)：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度cs(cs<cx)。則：

Ax=εbcx

As=εbcsΔＡ＝Ａx

－Ａs=εb(cx－cs）=εbΔc

測得的吸光度相當于普通法中待測溶液與標準溶液的吸光度之差ΔＡ。示差法測得