第十三章高等植物基因工程 - 濟(jì)南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院

第十三章高等植物基因工程主講：何文興醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)

生物技術(shù)系163.x@163.comDNAISEVERYWHERE植物？動物？物種？Transgenictomatoplantsshowresistance(left)whilenon-transformedplantsaresusceptibletocucumbermosaicvirusunderfieldconditions(right)

/online/feature/BioTechnology/Images/2.4.jpgFieldafteroneroundofapplicationofRoundupherbicideInsectinfestationonBt(right)andnon-Bt(left)cottonbolls/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpgWild-typecornshowinginfestation-BtcornisresistanttothisPotatoesareoneofmanyplantsbeingusedtoproducevaccines（蔬果疫苗）/sept_issue/images/breakthrough/veggievaccine.jpgGoldenriceandnormal(white)

/wsjbiotech.html嗯？！真的？吃了預(yù)防傳染??！美國（俄勒岡州立大學(xué)、卡爾·瓊斯）最近培育出具有預(yù)防癌癥和心肌梗塞功能的轉(zhuǎn)基因西紅柿。

丹麥培育出地雷探測草。轉(zhuǎn)基因快訊~~~北大克隆出多種耐逆功能基因。美國（康涅狄格州大學(xué)、馬克·布蘭德）最近培育出含青蛙基因轉(zhuǎn)基因杜鵑花抗病新品種。第一節(jié)植物基因工程發(fā)展現(xiàn)狀

第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選第二節(jié)植物基因工程方法第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)第五節(jié)植物基因工程應(yīng)用第十三章高等植物基因工程第一節(jié)植物基因工程發(fā)展現(xiàn)狀

中國植物轉(zhuǎn)基因現(xiàn)狀高層導(dǎo)向：“轉(zhuǎn)基因生物新品種培育”被列為國家“十一五”重大專項(xiàng)重點(diǎn)實(shí)施內(nèi)容和目標(biāo)之一；“中國高技術(shù)研究發(fā)展計劃”、“國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃”中均專門設(shè)立了“國家轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化”專項(xiàng)。轉(zhuǎn)基因安全評價申請、受理、審批到2006年6月止農(nóng)業(yè)部共發(fā)放農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書424項(xiàng)農(nóng)業(yè)部共受理了192家國內(nèi)外研究單位的安全評價申請1525項(xiàng)。國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會評審共批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因生物中間試驗(yàn)456項(xiàng)、環(huán)境釋放211項(xiàng)、生產(chǎn)性試驗(yàn)181項(xiàng)。

關(guān)于調(diào)整2008年轉(zhuǎn)基因生物安全評價時間的通知

日期：2008-02-1508:43來源：農(nóng)業(yè)部科技教育司

農(nóng)科（基安）函[2008]第22號各有關(guān)單位：為滿足農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物試驗(yàn)的需要，經(jīng)研究，我辦決定2008年在過去每年進(jìn)行兩次安全評審的基礎(chǔ)上增加一次，共進(jìn)行三次評審。每次安全評價資料申報受理截止時間分別為3月1日、7月1日和11月1日。每次受理后約45天發(fā)布審批文件。請各單位及時將此信息通知研發(fā)人員抓緊準(zhǔn)備申請材料，并酌情選擇申報時間。

二〇〇八年二月十四日2007年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物播種面積同比增長12%

日期：2008-02-1515:30來源：ISAAA

據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用推廣協(xié)會（ISAAA）稱，2007年全球23個國家1200萬農(nóng)戶種植了1.143億公頃轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，2006年有21個國家1030萬農(nóng)戶種植了1.02萬公頃轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。

2007年新加入的國家是智利和波蘭。種植轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的主要國家仍是美國，2007年種植規(guī)模為5770萬公頃（2006年為5460萬公頃），阿根廷1910萬公頃（1800萬公頃），巴西1500萬公頃（1150萬公頃），加拿大700萬公頃（610萬公頃），印度620萬公頃（380萬公頃），中國380萬公頃（350萬公頃）。

2007年種植最廣泛的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物是大豆，種植規(guī)模達(dá)到了5860萬公頃，這與2006年持平。其次是玉米，種植面積為3520萬公頃，高于2006年的2520萬公頃。棉花種植面積為1500萬公頃，高于2006年的1340萬公頃。油菜籽為550萬公頃，高于2006年的480萬公頃。國際轉(zhuǎn)基因植物現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因爭議？！歐盟建議禁止轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)口。澳大利亞兩個州取消轉(zhuǎn)基因油菜籽禁令。

轉(zhuǎn)基因食品安全存在巨大懸念？轉(zhuǎn)基因大豆:究竟安全不安全？方舟子:別怕，轉(zhuǎn)基因食品不是要轉(zhuǎn)你的基因！世界沒有轉(zhuǎn)基因，人類將會怎樣！轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)及其產(chǎn)品在中國的未來發(fā)展趨勢。轉(zhuǎn)基因食品有害難找證據(jù)？羅云波教授：轉(zhuǎn)基因食品并不比普通食品更危險。！轉(zhuǎn)基因風(fēng)險！斑蝶事件

1999年5月康奈爾大學(xué)一個研究小組在Nature雜志上發(fā)表文章稱：轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米花粉被美國大斑蝶幼蟲食用后導(dǎo)致44%死亡。墨西哥玉米事件

2001年11月，美國研究人員在Nature雜志上發(fā)表文章稱：墨西哥南部Oaxaca地區(qū)采集的6個玉米地方品種樣本中，發(fā)現(xiàn)了CaMV35S啟動子及NovartisBt11抗蟲玉米中的adh1基因相似序列。加拿大“超級雜草”事件……新華網(wǎng)柏林2007年6月21日電綠色和平組織21日公布的一份研究報告說，德國研究人員首次在用轉(zhuǎn)基因飼料喂養(yǎng)的奶牛產(chǎn)出的奶中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因作物的DNA（脫氧核糖核酸）片段。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告

根據(jù)《中華人民共和國種子法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》、《農(nóng)作物種子生產(chǎn)經(jīng)營許可證管理辦法》和《關(guān)于設(shè)立外商投資農(nóng)作物種子企業(yè)審批和登記管理的規(guī)定》等有關(guān)規(guī)定，我部批準(zhǔn)發(fā)放承德裕豐種業(yè)有限公司等17個單位《農(nóng)作物種子經(jīng)營許可證》，同意變更中國種子集團(tuán)公司等7個單位《農(nóng)作物種子經(jīng)營許可證》有關(guān)項(xiàng)目內(nèi)容；批準(zhǔn)發(fā)放河北五谷農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司等5個單位《轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子生產(chǎn)許可證》，同意變更河北眾信種業(yè)科技有限公司等3個單位《轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子生產(chǎn)許可證》有關(guān)項(xiàng)目內(nèi)容。特此公告附件：1.《農(nóng)作物種子經(jīng)營許可證》單位名單（第二十一批）

2.《轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子生產(chǎn)許可證》單位名單（第十四批）

第1027號

二○○八年四月三十日山東省制定農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件應(yīng)急預(yù)案

山東省是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的應(yīng)用和試驗(yàn)大省，為有效應(yīng)對轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件，保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人民健康，經(jīng)省政府審定同意，省農(nóng)業(yè)廳、省海洋與漁業(yè)廳、省發(fā)展改革委、省科技廳、省財政廳、省外經(jīng)貿(mào)廳、省衛(wèi)生廳、省環(huán)保局、山東檢驗(yàn)檢疫局等九部門日前聯(lián)合制定并下發(fā)了《山東省農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件應(yīng)急預(yù)案》。預(yù)案要求，對于每一個特定的轉(zhuǎn)基因生物，其基因操作要求在相適應(yīng)的安全級別實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行；對于每一個特定的轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行試驗(yàn)之前，必須報國務(wù)院農(nóng)業(yè)行政主管部門審查，經(jīng)國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會安全評價合格后才能進(jìn)入環(huán)境釋放試驗(yàn)；每個安全評價申請，在申報書中都有特定的應(yīng)急事故處理措施。對于已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因生物，一旦出現(xiàn)重大危害性事故，應(yīng)立即銷毀所有產(chǎn)品，并對所應(yīng)用區(qū)域進(jìn)行封鎖和監(jiān)控。從境外引進(jìn)轉(zhuǎn)基因生物用于研究、試驗(yàn)、生產(chǎn)和加工原料的，引進(jìn)單位必須向農(nóng)業(yè)部提出進(jìn)口申請，填寫安全登記表，并按規(guī)定進(jìn)行標(biāo)識，提供引進(jìn)過程中擬采取的安全防范措施，經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)后，方可引進(jìn)。任何單位和個人發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全事件或安全事件隱患時，應(yīng)當(dāng)及時向當(dāng)?shù)乜h（市、區(qū)）農(nóng)業(yè)或海洋與漁業(yè)行政主管部門報告。縣（市、區(qū)）農(nóng)業(yè)、海洋與漁業(yè)行政主管部門接到轉(zhuǎn)基因生物安全事件報告后，應(yīng)立即趕赴現(xiàn)場調(diào)查核實(shí)，初步認(rèn)定為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件的，應(yīng)當(dāng)在2小時內(nèi)報省級農(nóng)業(yè)或海洋與漁業(yè)行政主管部門。省級農(nóng)業(yè)或海洋與漁業(yè)行政主管部門認(rèn)定為重大農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件的，在2小時內(nèi)上報國務(wù)院農(nóng)業(yè)行政主管部門和省人民政府，并及時提請省人民政府啟動應(yīng)急預(yù)案。預(yù)案實(shí)行分級響應(yīng)機(jī)制。一級響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物對人類、動植物和生態(tài)環(huán)境存在較大危險或造成較大經(jīng)濟(jì)損失時，由國務(wù)院農(nóng)業(yè)行政主管部門依法宣布禁止生產(chǎn)、加工、經(jīng)營和進(jìn)口，收回農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書，銷毀有關(guān)存在危險的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物。二級響應(yīng)，一旦發(fā)生生物安全事故，應(yīng)立即強(qiáng)制封鎖現(xiàn)場（試驗(yàn)點(diǎn)和研發(fā)實(shí)驗(yàn)室），銷毀試驗(yàn)材料，進(jìn)行全方位的環(huán)境監(jiān)測，可采取物理控制、化學(xué)控制、生物控制、環(huán)境控制和規(guī)?？刂频榷喾N措施。各級農(nóng)業(yè)、海洋與漁業(yè)行政主管部門依照《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，對非法研究、試驗(yàn)、生產(chǎn)、加工、經(jīng)營或者進(jìn)口、出口的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)施封存或者扣押。從事轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)、加工、經(jīng)營和進(jìn)口的單位或個人，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因生物擴(kuò)散、殘留并造成危害的，必須立即采取有效措施加以控制、消除，并向當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)或海洋與漁業(yè)行政主管部門報告。省里成立由上述部門負(fù)責(zé)人組成的突發(fā)事件應(yīng)急指揮部，負(fù)責(zé)全省農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件應(yīng)急處理的決策和協(xié)調(diào)。縣級以上各級人民政府有關(guān)部門根據(jù)各自職責(zé)，按照指揮部分工，做好有關(guān)突發(fā)事件的應(yīng)急處理工作。突發(fā)事件發(fā)生期間，各級應(yīng)急指揮部實(shí)行24小時值班制度。省里成立農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件應(yīng)急處置專家指導(dǎo)組，開展突發(fā)事件的預(yù)警、預(yù)報、預(yù)防和應(yīng)急處置技術(shù)的研究，加強(qiáng)技術(shù)儲備，提供技術(shù)支撐。日期：2006-04-21

姜言明王芳山東省農(nóng)業(yè)廳

GMOs:WhytheControversy?Geneticengineeringisapowerfulnewtechnologythatisingeneralpoorlyunderstoodandwhoselongtermeffectsareunknown.GMOsareaninnovationthathaveandwillcontinuetoimpactallfacetsoftheglobalagriculturaleconomy.PlantGeneticEngineeringProcess基因分離農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物表達(dá)載體基因槍轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化組織轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)基因植株受體植物克隆載體受精卵或其它細(xì)胞組織培養(yǎng)篩選栽培育種遺傳轉(zhuǎn)化第二節(jié)植物基因工程方法一、植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法

植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類：

（一）生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。

（二）直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。

1、農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與T-DNA的整合機(jī)制幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。（一）生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化PhenolicsProducedbyWoundedPlantcellPLANTCELLAGROBACTERIUMT-DNAT-DNAintegratesintoplantDNAandgallproductionisinitiated.GallFormation!BacterialPlasmidPVirAVirGBE2D1D2VIP1VIP2vir

T-DNAT-DNA長約23kb（15kb-30kb

）

，共有三套基因：AuxinCytokininOpine合成的植物生長素與細(xì)胞分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。

Ti質(zhì)粒（Tumorinducedplasmid）環(huán)狀ds-DNA,160-250kb，具六個功能區(qū)致瘤區(qū)：合成植物生長素和細(xì)胞分裂素冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與在不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移毒性區(qū)（Vir）（Virulenceregion)

：直接參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體DNA復(fù)制區(qū)（Rep）：參與Ti質(zhì)粒DNA復(fù)制根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化分子機(jī)理整個過程分為以下6個步驟：

1）農(nóng)桿菌對受體的識別

2）農(nóng)桿菌附著到受體細(xì)胞

3）誘導(dǎo)和啟動毒性區(qū)基因表達(dá)

4）類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配

5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)

6）T-DNA與受體基因的整合Ti質(zhì)粒作為載體的優(yōu)點(diǎn)宿主范圍廣，能轉(zhuǎn)化所有的雙子葉植物整合到染色體上后成為染色體的正常組分永遠(yuǎn)保留冠癭堿合成酶基因啟動子是一個強(qiáng)啟動子Ti質(zhì)粒的改造策略

天然的Ti質(zhì)粒不能作為表達(dá)載體使用的原因：

a.

植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長素和分裂素，阻止了生長在培養(yǎng)基上的細(xì)胞再生長為整株植物，因此，必須除去生長素和分裂素基因。

b.

有機(jī)堿的合成與T-DNA的轉(zhuǎn)化無關(guān)，而且會影響植物細(xì)胞生長，因?yàn)橛袡C(jī)堿合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必須去除有機(jī)堿合成基因（tmt）。

c.

Ti質(zhì)粒過大，重組操作非常困難，也很難找到單一的酶切位點(diǎn)。

d.Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制。Ti質(zhì)粒的改造為了使重組質(zhì)粒DNA的大量擴(kuò)增，添加大腸桿菌復(fù)制子；加入植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，如neor基因（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）；使用植物細(xì)胞啟動子及末端polyA化信號；加入多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。

植物中一般不存在質(zhì)粒，為利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，發(fā)展了共整合系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)，避免了在大的Ti質(zhì)粒上進(jìn)行分子重組操作的困難。

Ti質(zhì)粒載體TiPlasmidCloningVector（克隆載體）

Cointegratevectors（共整合載體）Binaryvectors（雙元載體）

TiPlasmidCloningVector一元載體系統(tǒng)Transgenicplant目的基因oriSelectableMarkerGene中間載體Ti質(zhì)粒AuxinCytokininOpineL/RBorder1、Ti質(zhì)粒進(jìn)行卸甲處理。2、將目的基因構(gòu)建于中間載體上。3、在卸甲載體T-DNA區(qū)插入一段與中間載體同源的質(zhì)粒序列。4、然后將中間載體轉(zhuǎn)移到含有卸甲載體的根癌農(nóng)桿菌中，中間載體通過同源重組整合到卸甲載體的T-DNA區(qū)，并與卸甲Ti質(zhì)粒一起復(fù)制。5、根據(jù)中間載體上所攜帶的抗性基因進(jìn)行抗性篩選，獲得遺傳重組根癌農(nóng)桿菌菌株。6、使用這種菌株去侵染植物組織細(xì)胞，就可以獲得含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。卸甲載體中間載體共整合系統(tǒng)（一元載體系統(tǒng)）要點(diǎn)二元載體系統(tǒng)TransgenicplantvirorirepMCSTi質(zhì)粒AuxinCytokininOpineL/RBorder目的基因二元載體系統(tǒng)（雙元載體系統(tǒng)）要點(diǎn)1、微型Ti質(zhì)粒缺失Vir區(qū)，T-DNA區(qū)進(jìn)行卸甲處理；2、引入多個酶切位點(diǎn)和廣譜的復(fù)制元件；3、把外源基因重組于微型Ti質(zhì)粒上；4、輔助質(zhì)粒去掉T-DNA區(qū)，Vir區(qū)仍然存在；5、把微型質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有輔助質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌中，隨后侵染植物組織；6、兩種Ti質(zhì)?？赏ㄟ^反式作用將含有外源基因的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)移到植物組織細(xì)胞中。微型Ti質(zhì)粒輔助Ti質(zhì)粒Agrobacterium

tumefaciensTiplasmidAgrobacteriumGenomicDNAPlantcellGenomicDNA(carriesthegeneofinterest)+TiplasmidwiththegeneofinterestGeneofinterestEmptyplasmidRestrictionenzymeARestrictionenzymeAAgrobacteriumTiplasmidwiththenewgenePlantcellcell’sDNATransgenicplantCelldivisionThenewgene+TransformationAgrobacterium

tumefaciens重點(diǎn)回顧：1、現(xiàn)狀……2、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化分子機(jī)理3、一元載體系統(tǒng)4、二元載體系統(tǒng)

（1）選擇外植體葉片、子葉、胚軸、…

選擇轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)幼期外植體最佳感受態(tài)時期外植體易于組培，再生外植體要暴露分生組織細(xì)胞，增加農(nóng)桿菌與分生組織細(xì)胞接觸面。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一般步驟（2）共培養(yǎng)

農(nóng)桿菌溶液接種到外植體損傷切面浸泡一段時間，然后洗掉非傷面菌液轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上共培養(yǎng)（將接種農(nóng)桿菌的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，此時農(nóng)桿菌隨外植體的細(xì)胞分裂而繁殖并進(jìn)行侵染，T-DNA轉(zhuǎn)移整合，此過程叫共培養(yǎng)）。

（3）脫菌共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到含有殺農(nóng)桿菌抗生素的培養(yǎng)基上脫菌。

羧卞青霉素250mg/L

頭孢500mg/L

羧吩青霉素四環(huán)素和利福平（4）再生篩選葉盤法轉(zhuǎn)化操作葉片消毒切割預(yù)培養(yǎng)接種共培養(yǎng)脫菌篩選長芽生根

2、病毒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化植物病毒廣泛存在，而且不受單子葉或雙子葉的限制。因此病毒作為植物基因工程的載體日益受到人們的重視。在已知300種特征清楚的植物病毒中，雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。RNA不適合于作為克隆載體，因?yàn)镽NA的操作非常困難。在植物上已知有兩種DNA病毒，花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV）和雙聯(lián)體病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想載體。

花椰菜花葉病毒載體已用來克隆了一個基因進(jìn)入蕪箐甘藍(lán)，有兩個因素限制了其應(yīng)用：

1）花椰菜花葉病毒基因組的大小，即使是切除了非必需序列，花椰菜花葉病毒載體的承載插入片段的能力還是有限的，只能插入很小的片段。

2）花椰菜花葉病毒的寄主范圍非常窄，主要是蕓苔屬植物如蕪菁、甘藍(lán)和花椰菜等。

二價病毒可能比較有潛力，侵染重要的作物，如玉米和小麥，然而在侵染過程中，二價病毒重新排列并刪除部分序列，攪亂插入的DNA序列。這種病毒可引起破壞性的侵染，需要嚴(yán)格的防護(hù)，防止載體從寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花葉病毒和二價病毒作為克隆載體還需要進(jìn)一步的改造。（二）DNA直接轉(zhuǎn)移法農(nóng)桿菌侵染雙子葉植物獲得轉(zhuǎn)基因植株是非常成功的，但自然界中的農(nóng)桿菌只侵染雙子葉植物，對單子葉植物不敏感。雖然通過添加乙酰丁香酮類物質(zhì)可使農(nóng)桿菌侵染單子葉植物，但單子葉植物的再生比較困難，因而農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物仍然是比較困難的。超螺旋結(jié)構(gòu)的細(xì)菌質(zhì)粒，雖然不能在植物細(xì)胞中復(fù)制，但可以重組整合到植物染色體內(nèi)。受這一現(xiàn)象的啟發(fā)產(chǎn)生了基因直接轉(zhuǎn)移技術(shù)。重組機(jī)制并不清楚，因?yàn)榧?xì)菌質(zhì)粒與植物DNA之間沒有同源性，事實(shí)上整合是隨機(jī)發(fā)生在植物染色體的任何位點(diǎn)。DNA直接轉(zhuǎn)移法種類基因槍法原生質(zhì)體法脂質(zhì)體法花粉管通道法電激轉(zhuǎn)化法PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等。1.基因槍法（1）定義基因槍法（particlegun）又稱微彈轟擊法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。它是把遺傳物質(zhì)或其它物質(zhì)附著于高速微彈上直接射入組織、細(xì)胞、細(xì)胞器內(nèi)，完成整合并表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化方法。最早是由Cornell大學(xué)研制的火藥基因槍。1990年，美國杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統(tǒng)?；驑層桑狐c(diǎn)火裝置、發(fā)射裝置、擋板、樣品室、真空系統(tǒng)組成?！癎eneGun”TechniqueDNAcoatedgoldenparticlesGenegunCelldivisionAplantcellwiththenewgeneTransgenicplantPlantcellCell’sDNA（2）動力系統(tǒng)炸藥爆破力

高壓氣體高壓放電（3）DNA顆粒載體的制備利用CaCl2對DNA沉淀作用；亞精氨、PEG的粘附等作用將DNA固定在顆粒表面。（4）金屬顆粒

金粉：規(guī)則的球形，比表面積大，DNA吸附力強(qiáng)。

鎢粉：廉價，但易在細(xì)胞表面形成有害的氧化物。PDS-1000/H臺式基因槍PDS-1000/H臺式基因槍可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的原位轉(zhuǎn)導(dǎo)；

應(yīng)用于包括培養(yǎng)細(xì)胞、組織、器官、植物、動物、細(xì)菌和細(xì)胞器官等各種不同的目標(biāo)。

目標(biāo)區(qū)域：大（40c㎡）；

壓力范圍：450-2200psi；

目標(biāo)類型：動物、植物細(xì)胞；小的整株植物；培養(yǎng)細(xì)胞；外植體；真菌，細(xì)菌和其他微生物細(xì)胞器，葉綠體，線粒體。GJ-1000氣體基因槍有一個產(chǎn)生氣體沖擊波的特殊結(jié)構(gòu)，在恰當(dāng)?shù)臍鈮悍秶鷥?nèi)從3.5Mpa-10Mpa，具有相應(yīng)不同的可破裂膜，將包覆DNA的粒子穿越，射入在轟擊室底部的靶細(xì)胞中（最大靶直徑Φ50mm），基因槍適用于動植物、細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎、細(xì)菌及小型動物的轉(zhuǎn)基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點(diǎn)。（四川大學(xué)，中科院遺傳所，神經(jīng)科學(xué)研究所，復(fù)旦大學(xué)，浙江大學(xué)。）基因槍轉(zhuǎn)化率

基因槍轉(zhuǎn)化率差異很大，一般在10-3~10-2之間（McCabe在大豆上的轉(zhuǎn)化高達(dá)2%），相對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率要低得多，而且基因槍轉(zhuǎn)化成本高；嵌合體比率大、遺傳穩(wěn)定性差。基因槍法優(yōu)點(diǎn)：

a)無宿主限制

b)受體類型廣泛

c)可控度高

d)操作簡便迅速。

正因?yàn)榛驑屵@些優(yōu)點(diǎn)，使基因槍成功的應(yīng)用于：植物基因轉(zhuǎn)化，特別是單子葉植物的轉(zhuǎn)化；外源基因?qū)胫参锛?xì)胞器；種質(zhì)轉(zhuǎn)化（莖尖分生組織、配子體、胚胎細(xì)胞）；植物基因表達(dá)調(diào)控研究。2.多聚物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化：利用多聚物PEG、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等在二價陽離子作用下，促進(jìn)DNA在原生質(zhì)體表面形成沉淀，繼而通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。多聚物促進(jìn)細(xì)胞融合的原理：

多聚物使細(xì)胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促進(jìn)相互間的接觸和粘連，在細(xì)胞融合的過程中，DNA進(jìn)入細(xì)胞。磷脂介導(dǎo)（Phospholipidsasgene-deliveryvehicles）

脂質(zhì)體(liposomes)是一種人造的脂質(zhì)小泡，外周是脂雙層，內(nèi)部是水腔。內(nèi)部水腔雙層膜脂質(zhì)溶液外源DNA脂質(zhì)體混合加入細(xì)胞培養(yǎng)皿脂質(zhì)體細(xì)胞核脂質(zhì)體細(xì)胞核外源基因的轉(zhuǎn)化及表達(dá)3.電穿孔法將高濃度的質(zhì)粒DNA加入到植物細(xì)胞的原生質(zhì)體懸浮液中，混合物在200-600V/cm的電場中處理若干秒鐘，然后將原生質(zhì)體在組織培養(yǎng)基中生長1-2周，再生出整株植物。DuracellDNAcontainingthegeneofinterestPlantcellProtoplastElectroporationTechniquePowersupplyDNAinsidetheplantcellTheplantcellwiththenewgene（1）定義：利用顯微注射儀通過機(jī)械方法將DNA注入細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)。4.顯微注射法（microinjection):

Microinjection（2）細(xì)胞固定（對植物來言）：瓊脂糖包埋法多聚賴氨酸粘連吸管支持法（3）優(yōu)缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高，10-20%甚至60%

繁瑣耗時，需要專門的顯微注射儀，要求精密操作技術(shù)和低密度培養(yǎng)技術(shù)。在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。該方法于80年代初期由我國學(xué)者周光宇提出，我國目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握。

利用花粉管通道將DNA轉(zhuǎn)移至胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具正常細(xì)胞壁的卵、合子及早期的胚胎組織。目前已應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的轉(zhuǎn)基因研究。5、花粉管通道法農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法回顧第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選

采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅有少數(shù)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化。只有采取有效的篩選方法，才能高效準(zhǔn)確地選擇到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。篩選方法主要有兩種：

解毒基因篩選選擇基因?yàn)橐唤舛净?，可以消除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)（如抗生素、除草劑等）對細(xì)胞生長的抑制作用；而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能在含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長。

營養(yǎng)缺陷型篩選

受體細(xì)胞為營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，不能在選擇性培養(yǎng)基中增殖，而選擇基因可以補(bǔ)償這種缺陷，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長。一、植物基因工程中的選擇基因植物基因工程中的選擇標(biāo)記基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。1、新霉素抗性基因（neor）2、慶大霉素抗性基因（gentr）3、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）4、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）1、新霉素抗性基因（neor）由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離。選擇試劑：卡那霉素、新霉素、G418。卡那霉素、新霉素與核糖體小亞基結(jié)合抑制蛋白質(zhì)合成；G418抑制80S核糖體功能而阻斷真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成。neor可使選擇試劑磷酸化而失效（即催化ATP上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到諸如新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等抗生素分子的某些基團(tuán)上。）。該基因廣泛應(yīng)用于雙子葉植物，單子葉中也有成功應(yīng)用。2、慶大霉素抗性基因（gentr）gentr編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶。選擇試劑：慶大霉素。gentr編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶可使慶大霉素乙?；Щ睢Ｔ摶蛟诎珷颗?、煙草和番茄轉(zhuǎn)基因篩選中有較廣泛應(yīng)用。3、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞生長抑制劑，對許多植物都有毒性。選擇試劑：潮霉素。hpt

可使選擇試劑磷酸化而失活。該基因廣泛應(yīng)用于單子葉植物，特別是水稻的轉(zhuǎn)基因研究，是一種選擇效率很高的選擇基因。4、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）由吸水鏈霉菌中克隆。選擇試劑：膦絲菌素（basta)。膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞氨的致死性積累。Bar編碼的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶可使膦絲菌素乙?；Щ睢Ｔ摶驈V泛應(yīng)用于禾谷類作物以及大豆、油菜等油料作物的轉(zhuǎn)基因研究。報告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于檢測外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組織），是否啟動表達(dá)的一類特殊用途基因。報告基因與選擇基因的區(qū)別在于：選擇基因往往需要與外界的篩選壓力如抗生素等相互作用，以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；二報告基因的應(yīng)用不需要外界選擇壓力的存在。二、植物基因工程中的報告基因理想報告基因應(yīng)具備的條件1、受體細(xì)胞不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因活性；2、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會損害受體細(xì)胞；3、具有檢測快速、靈敏、價廉且可定量、重復(fù)測定特性。目前常用報告基因1、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）2、胭脂堿和章魚堿3、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）4、熒光素酶基因（

luc

）5、綠色熒光蛋白基因（gfp）1、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus

基因存在于某些細(xì)菌體內(nèi)。編碼β-葡萄糖苷酸酶。檢測的底物有3種，

1）X-gluc5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷、5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-glucuronide

；

2）PNPG

對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside

。

3）4-MUG

4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸、4-methylumbelliferyl?-D-glucuronide

X-gluc5，5’-二溴-4，4’-二氯靛藍(lán)（藍(lán)色）

(5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸)4-MUG

4-甲基傘形酮（熒光物質(zhì)）＋β-D-葡萄糖醛酸（4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）PNPG對硝基苯酚（溶液呈黃色，PH=7.15，400~420nm）（4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）GUSGUS（1）GUS基因的檢測十分簡單、方便和靈敏。（2）絕大多數(shù)植物中沒有檢測到該酶的背景活性。（3）GUS基因還可用來進(jìn)行嵌合基因的構(gòu)建和分析。優(yōu)點(diǎn)：GUS2、胭脂堿和章魚堿檢測

這兩種報告基因在植物的根、莖、葉中均能表達(dá)。將植物材料直接擠壓在電泳圖譜紙上，進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳的胭脂堿和章魚堿，用敏感的熒光染料菲醌進(jìn)行染色，即可觀察到植物樣品中是否含有胭脂堿或章魚堿，從而判斷出轉(zhuǎn)化是否成功。冠癭堿（胭脂堿和章魚堿）＋菲醌（2天后呈藍(lán)色）紫外光下呈黃色熒光3、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因

cat基因是由大腸桿菌易位子Tn9所編碼的，它可以催化乙酰CoA轉(zhuǎn)乙?；铰让顾胤肿?導(dǎo)致氯霉素分子發(fā)生乙?；饔?，從而失去活性。真核生物無該基因，無該酶內(nèi)源活性。該酶活性可以通過反應(yīng)底物乙酰CoA的減少或反應(yīng)產(chǎn)物還原型乙酰CoA的生成來測定，目前常用的方法有硅膠G薄層層析法及DTNB分光光度法。

CAT1—乙酰氯霉素

CoA

＋氯霉素2—乙酰氯霉素（氯霉素失效）

3—乙酰氯霉素優(yōu)點(diǎn)：克服了受體細(xì)胞非特異性酶本底較高的缺點(diǎn)，且CAT酶定量分析準(zhǔn)確。4、熒光素酶（LUC）基因來源：從北美熒光蟲和叩頭蟲的cDNA文庫中克隆出來的。功能：luc基因所編碼的熒光素酶是生物體催化自身發(fā)光的一種蛋白。該酶在有ATP、Mg2+、O2和熒光素存在的條件下可發(fā)射出熒光，熒光持續(xù)數(shù)秒到數(shù)分鐘即消失，可用微光測定儀檢測到非常微弱的熒光素酶分子。（1）LUC測定靈敏度非常高（2）LUC檢測法成本低（3）免于放射性同位素檢測對人體健康和生態(tài)環(huán)境所造成的危害。（4）該酶的活性不需要轉(zhuǎn)錄后修飾，可以在幾乎所有的宿主細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：插入了螢火蟲熒光素酶基因的煙草,由于熒光素酶基因的表達(dá)使得煙草發(fā)光.5、綠色熒光蛋白（GFP）基因來源：海洋生物水母，其基因可在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光。功能：gfp

開放閱讀框架長度約740bp，編碼238個氨基酸殘基，其肽鏈內(nèi)部第65～67位絲氨酸-脫氫酪氨酸-甘氨酸通過自身環(huán)化和氧化形成一個發(fā)色基團(tuán)，在長紫外波或藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光。檢測：可在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀中直接觀察基因的表達(dá)。GreenFluorescentProtein(GFP)外源基因是否整合到染色體上？整合方式如何？整合到染色體上的外源基因是否表達(dá)？基因表達(dá)是否產(chǎn)生了完整的蛋白質(zhì)？是否產(chǎn)生了目的性狀？

需要通過以下鑒定與證實(shí)分子生物學(xué)鑒定表型鑒定遺傳學(xué)鑒定第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)外源基因轉(zhuǎn)化驗(yàn)證內(nèi)容和技術(shù)外源基因是否整合

PCR技術(shù)(需要注意假陽性問題、外源基因仍有可能以游離形式存在問題)Southern雜交外源基因表達(dá)

RT-PCR技術(shù)(假陽性問題)Northern雜交

Western雜交第五節(jié)植物基因工程應(yīng)用NextGenerationofTransgenicCropsPlant-basedvaccinesEnhancednutritionalcontentFunctionalfoodsandphytoceuticalsTransgenicplantsforphytoremediationPlant-derivedplasticsandpolymersBygeneticallymodifyingplantswecan:

ReducepesticideuseConservefuelandwaterPreservenon-pestinsectpopulationsIncreasefoodproductionperhectareoffarmlandEnablecropstogrowinsub-optimalconditionsIncreasethenutritionalvalueoffoodCurrentProductsTransgenicSoybeanRoundupReadyResistanttoRoundupHerbicideReducestheamountofherbicideappliedtocropsAlteredFatty-acidcontentChangesthenutritionalvalueFieldafteroneroundofapplicationofRoundupherbicideCurrentProductsCanolaHerbicideresistantBetterfortheenvironmentAlteredfatty-acidcompositionAvalue-addedfoodhttp://www./ens/pics11/canolaprods.jpg

CurrentProductsTomatoFlavr

SavrTomatoDelayedsofteningConsumersgetabettertastingtomatoFailedVirusresistanttomatoResistanttopestsDecreasestheamountof

pesticideappliedtocropsTransgenictomatoplantsshowresistance(left)whilenon-transformedplantsaresusceptibletocucumbermosaicvirusunderfieldconditions(right)

/online/feature/BioTechnology/Images/2.4.jpgCurrentProductsCornBtCorn

TheMonarchButterflydebate:AmicrobialgeneaddedresultsinthecropbeingresistanttoinsectsDoesitimpacttheMonarchButterfly?WellplannedexperimentsarecriticaltothesurvivalofbiotechnologyWild-typecornshowinginfestation-BtcornisresistanttothisCurrentProductsCottonYes–clothescanbemadefromtransgeniccrops!

BollgardcottonInsectresistanceLowerspesticide

usageInsectinfestationonBt(right)andnon-Bt(left)cottonbolls/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpgCurrentProductsSquashVirusresistantReducescroplossduetoinfestationanddecreasespesticideuse/online/feature/BioTechnology/Images/2.3.jpgTransgenic‘FreedomII’squashshowingresistancetobothzucchiniyellowmosaicvirusandwatermelonmosaicvirus2(right)comparedtonon-transformedplantsthataresusceptible(left)CurrentProductsPapayaVirusresistantRestoredthepapayaindustryinHawaiiReducedcroplossJapanblockedimportsoftransgenicpapayaCurrentProductsGoldenRiceBiotechnology’sposterchild?AtruevalueaddedfoodVitaminAenrichedrice

preventsdiseaseandblindnessGoldenincolourGoldenriceandnormal(white)

/wsjbiotech.htmlCanGMO’shavehealthbenefits?SomeplantshavebeenalteredtoincreasethenutritionalvaluePharmaceuticals,Plantibodies,andEdibleVaccinesResearchhaslookedattransgenicplantsasproductionvehiclesforanti-cancerantibodiesEdiblevaccinesarecloserthanwethinkEdibleVaccinesPlantsproducingvaccinescouldeliminateorsimplifyvaccinedistributionproblemsindevelopingnationsHowatransgenicplantcontainingavaccineismade/final/infds/la_infds.htmEdibleVaccinesMayhaveadvantagesoverinjectedvaccinesPlantsbeingstudiedincludepotato,banana,papaya,tomato,lettuce,carrot,rice,wheat,cornandsoybean–Quiteasalad!Potatoesareoneofmanyplantsbeingusedtoproducevaccines/sept_issue/images/breakthrough/veggievaccine.jpgEdibleVaccinesTomatoandpotatoplantcanmakeantigensfromHepatitisB,E.ColiandV.choleraeFeedingtotestanimalsinducesanimmuneresponsePotatoesfedtohumanvolunteersinduced