理學(xué)10、納米診斷試劑

第10章納米診斷試劑生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展對(duì)傳統(tǒng)的檢測(cè)及診斷方法提出了新的挑戰(zhàn)，要求建立活體(invivo)、原位(insitu)、實(shí)時(shí)(realtime)、動(dòng)態(tài)(dynamic)的檢測(cè)及診斷新方法。傳統(tǒng)的光、電生物化學(xué)傳感器已不能適應(yīng)這些新的要求，使用這些傳感器經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)損傷及相關(guān)的生化惡果。因此，發(fā)展新型、無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)及診斷探針已經(jīng)成為人們的一個(gè)研究熱點(diǎn)。近年來，隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，以納米粒子為基礎(chǔ)的新型生物傳感技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這些新型生物傳感器，不僅可以解決一些生命活動(dòng)中的重大問題，還將在疾病的早期診斷及治療中發(fā)揮巨大的作用。國(guó)家863計(jì)劃將生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域中的納米生物技術(shù)研究集中在醫(yī)用納米生物傳感器和成像技術(shù)、納米藥物制劑或載體、納米生物農(nóng)藥等三個(gè)方面［1］。目前已開發(fā)出基于熒光納米顆粒的白血病、紅斑狼瘡和某些癌癥的早期診斷方法，用這樣的生物納米試劑診斷白血病比現(xiàn)有試劑的靈敏度高數(shù)千倍［2］。用于疾病早期診斷的納米試劑很多，如半導(dǎo)體量子點(diǎn)、納米金及磁性納米粒子納米診斷試劑等。本章前三節(jié)將重點(diǎn)介紹這三類納米粒子及其診斷試劑的最新研究進(jìn)展，第四節(jié)將簡(jiǎn)要介紹其它納米診斷試劑的進(jìn)展情況，最后一節(jié)介紹芯片技術(shù)在疾病診斷中的應(yīng)用。量子點(diǎn)及其在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用引言量子點(diǎn)是三維受限的、近似球狀的無(wú)機(jī)半導(dǎo)體納米晶體，尺寸通常在2-8nm之間，由200-10000個(gè)原子組成［3］。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，熒光量子點(diǎn)具有極其優(yōu)良的光譜特性：(1)發(fā)射波長(zhǎng)可通過控制它的粒徑大小和組成來“調(diào)諧”，大小均勻的量子點(diǎn)譜峰為對(duì)稱高斯分布，譜峰的半峰寬在30nm左右，且斯托克斯位移較大，因而幾種不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)用于不同靶點(diǎn)的同時(shí)監(jiān)測(cè)時(shí)，可避免光譜干擾；(2)激發(fā)光譜范圍寬，因而采用單個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)可同時(shí)激發(fā)不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光量子點(diǎn)，而激發(fā)不同熒光染料，通常需不同的激發(fā)波長(zhǎng)；(3)具有熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于對(duì)標(biāo)記對(duì)象進(jìn)行高靈敏、長(zhǎng)時(shí)間、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)；(4)具有空間兼容性，一個(gè)量子點(diǎn)可以偶聯(lián)兩種或兩種以上的生物分子或配體［4-5］。自1998年Chan，Bruchez等人首次將量子點(diǎn)用于生物體系研究以來叵7］，量子點(diǎn)作為一種新型熒光診斷試劑，在生物、藥物以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)，并且得到了越來越廣泛的應(yīng)用(如圖10－1所示［8］)。到目前為止，人們已經(jīng)發(fā)展了多種量子點(diǎn)表面修飾及偶聯(lián)方法，可以將量子點(diǎn)與一些生物識(shí)別分子如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、小分子等偶聯(lián)。同時(shí)，以量子點(diǎn)為基礎(chǔ)的多功能材料的制備也得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。最近，Science、NatureBiotechnology等多個(gè)國(guó)際著名雜志發(fā)表了關(guān)于量子點(diǎn)診斷試劑方面的評(píng)論性文章，評(píng)述了量子點(diǎn)的最新應(yīng)用進(jìn)展［9,10］。下面介紹量子點(diǎn)及其診斷試劑在一些疾病診斷與治療方面的進(jìn)展情況。

目數(shù)章文8070605040302010。O00202!目數(shù)章文8070605040302010。O00202!20份孫年202i2005002圖10-1近幾年量子點(diǎn)在生物、藥物以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用發(fā)表文章數(shù)目(2005年僅統(tǒng)計(jì)了1-9月份的數(shù)據(jù))。量子點(diǎn)的發(fā)光機(jī)理通常在半導(dǎo)體材料中，只有極少數(shù)電子填充在導(dǎo)帶，絕大部分電子填充在價(jià)帶，使價(jià)帶幾乎處于全滿狀態(tài)。當(dāng)加熱、加電壓或光照等外界刺激時(shí)，一些電子會(huì)從價(jià)帶躍遷到導(dǎo)帶，在價(jià)帶中形成空穴，空穴通常被認(rèn)為是帶有一個(gè)正電荷的離子。電子和空穴通過庫(kù)侖引力互相“鍵合”，形成準(zhǔn)粒子，這種互相“鍵合”的準(zhǔn)粒子被稱為“激子”[11]。激子被認(rèn)為是一種類氫粒子，因而可用玻爾近似方法計(jì)算激子中電子-空穴之間的距離，其計(jì)算公式如下：r=gh2/nme2rr表示激子中電子-空穴的距離，b是半導(dǎo)體的介電常數(shù)，mr是電子-空穴對(duì)的約化質(zhì)量，h是普朗克常數(shù)，e表示電子的電荷。不同的半導(dǎo)體具有不同的激子玻爾半徑，對(duì)于大多數(shù)半導(dǎo)體而言，其激子玻爾半徑在1?10nm之間。由于量子點(diǎn)的半徑小于或接近激子玻爾半徑，其帶隙隨著量子點(diǎn)尺寸的變化而變化。隨著量子點(diǎn)半徑的減小，帶隙逐漸增大，伴隨著激子吸收峰的位置發(fā)生紫移，其熒光發(fā)射光譜也會(huì)發(fā)生紫移。Brus等人曾經(jīng)提出一個(gè)公式用于計(jì)算不同大小量子點(diǎn)的帶隙DI。Eg(quantumdot)=Eg(bulk)+(h2/8R2)(1/me+1/mh)一1.8e2/4n￡0￡REg(quantumdot)表示量子點(diǎn)的帶隙，Eg(bulk)表示體相材料的帶隙，R是量子點(diǎn)的半徑，me表示電子的有效質(zhì)量，mh表示空穴的有效質(zhì)量，b0表示真空介電常數(shù)，b表示半導(dǎo)體的介電常數(shù)。對(duì)于CdSe量子點(diǎn)而言，當(dāng)其半徑從1nm變化到3.5nm時(shí)，其熒光發(fā)射峰將從450nm紅移到650nm。另外，不同組成的量子點(diǎn)，其發(fā)射光譜也不同。Nie等人研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于半徑2.5nm的不同組成的CdSexTe1-x量子點(diǎn)，其熒光發(fā)射峰將從610nm變化到800nm13](見圖10-2)。圖10—2CdSe量子點(diǎn)及CdSeTe量子點(diǎn)熒光性質(zhì)隨組成及尺寸的變化。A：CdSe量子點(diǎn)熒光發(fā)射光譜隨尺寸的變化；B：半徑為2.5nm的CdSexTe1x量子點(diǎn)熒光發(fā)射光譜隨組成的變化叵13］。XX量子點(diǎn)的制備方法高質(zhì)量量子點(diǎn)的制備是生物標(biāo)記、醫(yī)學(xué)診斷以及疾病治療的基礎(chǔ)，如何制備發(fā)射波長(zhǎng)窄而可調(diào)、量子產(chǎn)率高、性能穩(wěn)定的量子點(diǎn)一直是材料科學(xué)家追求的目標(biāo)和關(guān)注的熱點(diǎn)。1993年，Bawendi課題組口引采用有機(jī)金屬鹽高溫反應(yīng)體系合成了高效發(fā)光的CdSe量子點(diǎn)納米晶體，用氧化三辛基瞵(TOPO)作為有機(jī)配位溶劑，二甲基鎘［(CH3)2Cd］和TOPSe(TOP為三辛基膦)分別作為Cd和Se的前體，在340?360℃高溫條件下反應(yīng)，得到較高質(zhì)量的CdSe量子點(diǎn)。經(jīng)過尺寸選擇性沉降后，可以提高量子點(diǎn)的單分散性，所合成量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率約為10%，通過改變反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件，可以調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的粒徑(2.4?23nm)。然而由于［(CH3)2Cd］和TOP等試劑有劇毒、不穩(wěn)定，因而實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻。2001年，Peng課題組［均采用CdO代替(CH3)2cd，制備出高質(zhì)量的CdS、CdSe、CdTe量子點(diǎn)，并對(duì)CdSe量子點(diǎn)的成核規(guī)律進(jìn)行了詳細(xì)的研究，這種方法制備量子點(diǎn)具有制備方法簡(jiǎn)單、可制備的量子點(diǎn)種類多、并可用多種手段控制粒徑分布。但這種方法因采用TOP或三丁基膦(TBP)等一些劇毒、極易燃、易爆的化合物為原料從而導(dǎo)致的合成條件仍比較苛刻，在實(shí)驗(yàn)過程中必需使用手套箱，針對(duì)以上問題，本課題組采用一種更安全、廉價(jià)的試劑代替原有試劑，無(wú)需手套箱就可制得高質(zhì)量的CdSe量子點(diǎn)ns。盡管采用目前的技術(shù)已經(jīng)能夠制備出高質(zhì)量的CdSe量子點(diǎn)，然而，將CdSe量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移到水相之后，其熒光幾乎完全被猝滅。相比之下，核-殼量子點(diǎn)具有更好的穩(wěn)定性，將CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移到水相之后，量子點(diǎn)仍然能夠保持較高的熒光量子產(chǎn)率。目前，CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)在生物體系中得到廣泛的應(yīng)用。1996年，Hines和Guyot-Sionnest^］采用二甲基鋅和六甲基二硅硫烷為原料，成功合成了CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)。然而，由于原料中采用了易燃、易爆的金屬有機(jī)化合物二甲基鋅，從而限制了該方法的廣泛應(yīng)用。針對(duì)該方法所存在的缺陷，武漢大學(xué)Xie等人［18］采用醋酸鎘和醋酸鋅等簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)鹽代替金屬有機(jī)化合物，在相對(duì)溫和、安全的條件下，成功制備出CdSe/CdS和CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)。采用此方法，原料穩(wěn)定、易于儲(chǔ)存、成本低廉，使實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模制備成為可能。最近研究發(fā)現(xiàn)，CdSe-ZnS摻雜量子點(diǎn)購(gòu)及CdSe/CdS/ZnS核-殼-殼量子點(diǎn)的比CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)具有更好的穩(wěn)定性，預(yù)計(jì)不久的將來，這些新型的量子點(diǎn)將會(huì)代替目前使用的CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)，用于生物醫(yī)學(xué)分析。水溶性量子點(diǎn)的制備由于在高溫有機(jī)溶劑中合成的量子點(diǎn)表面被一些烷基鏈保護(hù)，所合成的量子點(diǎn)僅僅溶于非極性或弱極性有機(jī)溶劑，如正己烷、氯仿等。使用前一般需要對(duì)量子點(diǎn)表面進(jìn)行修飾，使其表面覆蓋極性的基團(tuán)，從而能夠分散在水或緩沖溶液中。到目前為止，已經(jīng)發(fā)展了多種制備水溶性量子點(diǎn)的方法。一般來說，可以分為兩類：一類方法是將量子點(diǎn)表面的試劑用修飾試劑取代；另一類方法是通過兩性聚合物與量子點(diǎn)表面作用，改變量子點(diǎn)表面的極性，從而使量子點(diǎn)能夠分散在水或緩沖溶液中。1998年，Nie課題組⑹發(fā)明了用巰基乙酸修飾量子點(diǎn)的方法，成功將量子點(diǎn)從有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)移到水中。此后，巰基丙酸、巰基乙醇等一些帶巰基的試劑均用來制備水溶性量子點(diǎn)。由于巰基上的S容易與Cd或Zn作用，而極性羧基可以增加量子點(diǎn)的水溶性，用這些簡(jiǎn)單的巰基試劑修飾量子點(diǎn)具有操作簡(jiǎn)便、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，然而，所制備的量子點(diǎn)穩(wěn)定性并不太好。Bruchez等人⑺采用硅烷化試劑修飾量子點(diǎn)，有效地解決了穩(wěn)定性的問題，但其制備過程非常復(fù)雜，不易重復(fù)。其它的修飾方法如二硫蘇糖醇①TT）［21］、二氫硫辛酸（DHLA）［22］、枝狀有機(jī)化合物以2引等均在不同程度上增加了量子點(diǎn)在水溶液中的穩(wěn)定性，但這些方法同樣存在操作復(fù)雜、所制備的水溶性量子點(diǎn)量子產(chǎn)率低等不足。2002年，Dubertret等人幽采用磷脂膠束直接與量子點(diǎn)表面的憎水基團(tuán)（如：TOPO）作用，成功制備出高量子產(chǎn)率的水溶性量子點(diǎn)，這種方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，所制備水溶性量子點(diǎn)的穩(wěn)定性好，但由于磷脂膠束不易合成，限制了此法的推廣及應(yīng)用。Osaki等人網(wǎng)采用類似的方法，成功將多糖修飾到量子點(diǎn)表面，并制備出不同大小的微球。最近，Gao等人［27］將高分子共聚物吸附在量子點(diǎn)表面的憎水基團(tuán)上，所制備的水溶性量子點(diǎn)穩(wěn)定性好，當(dāng)pH值從1變化至U14,鹽濃度從0.01mol/L變化至U1.0mol/L時(shí)，量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)不發(fā)生改變。可以預(yù)計(jì)，利用兩性聚合物制備水溶性量子點(diǎn)的方法將是未來的發(fā)展趨勢(shì)（見圖10－3）。圖10—3多功能水溶性量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)示意圖，其表面修飾的分子有TOPO、兩性共聚物、腫瘤識(shí)別試劑（如：蛋白質(zhì)、抗體、小分子抑制劑等）及聚乙二醇叵27］。量子點(diǎn)診斷試劑的制備采用巰基羧酸制備的水溶性量子點(diǎn)，在中性緩沖溶液中其表面帶有很多負(fù)電荷，因而可以通過靜電引力將帶有正電荷的分子如：親和素、鋅指蛋白［28,29］等吸附到量子點(diǎn)表面。再將生物素化的分子與親和素修飾的量子點(diǎn)結(jié)合，鋅指蛋白用于分離未結(jié)合的分子。一些含有氨基或巰基的生物分子可以直接與量子點(diǎn)表面的Cd或Zn配位，取代量子點(diǎn)表面的修飾分子。另外，共價(jià)偶聯(lián)也是制備量子點(diǎn)診斷試劑的一種方法，一些偶聯(lián)試劑如：1-乙基-3［3-(二甲氨基)丙基］碳二亞胺(EDC)［6］、丁二酰亞胺基-4-馬來酰亞胺基環(huán)己烷-1-羧化酯(SMCC)W］等常用于生物分子與量子點(diǎn)偶聯(lián)。量子點(diǎn)在疾病診斷及治療中的應(yīng)用量子點(diǎn)用于基因芯片病毒測(cè)定人類疾病基因型的確認(rèn)以及病毒的檢測(cè)，主要依賴于相關(guān)核酸及蛋白質(zhì)的測(cè)定。生物芯片技術(shù)在基因型病毒的檢測(cè)上具有高通量、方便、試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)［31］。量子點(diǎn)以其獨(dú)特的優(yōu)越性在生物芯片中具有廣闊的應(yīng)用前景。Parak等人的用sulfo-SMCC偶聯(lián)試劑將表面帶有巰基的硅烷化量子點(diǎn)與氨基修飾的單鏈DNA偶聯(lián)，將其與固定在玻片表面的DNA雜交，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)玻片上的DNA與量子點(diǎn)偶聯(lián)的DNA互補(bǔ)時(shí)，可以觀察到量子點(diǎn)結(jié)合到玻片表面，反之則觀察不到這種現(xiàn)象。Gerion等人即將DNA標(biāo)記的量子點(diǎn)進(jìn)一步用于DNA芯片的研究，表明DNA標(biāo)記的量子點(diǎn)可在芯片上進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析以及多色雜交，并對(duì)雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化，這是首次將不同顏色量子點(diǎn)標(biāo)記的DNA探針用于芯片雜交檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，他們將DNA標(biāo)記的量子點(diǎn)用于乙肝、丙肝病毒的檢測(cè)，取得了較好的效果。這使量子點(diǎn)同時(shí)高靈敏度檢測(cè)多種病原體成為可能，例如：同時(shí)檢測(cè)甲、乙、丙、丁、戊肝病毒以及艾滋病毒等。在不久的將來，以量子點(diǎn)為基礎(chǔ)的量子點(diǎn)診斷試劑可能會(huì)作為目前聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)的一種補(bǔ)充，而廣泛用于臨床診斷。量子點(diǎn)用于免疫分析及疾病診斷免疫分析是目前疾病診斷的一項(xiàng)重要手段，在現(xiàn)有的免疫診斷方法中，固相免疫法以放射免疫檢測(cè)法(RIA)和酶免疫檢測(cè)法(EIA)應(yīng)用最為廣泛陽(yáng)。Goldman等人［34］使用熒光免疫分析法成功將抗體標(biāo)記的量子點(diǎn)診斷試劑用于葡萄球菌腸毒素B(SEB)的檢測(cè)，SEB的檢測(cè)限為2ng/mL。然而，由于固相免疫法操作復(fù)雜，存在誤檢；相比較而言，液相法的免疫反應(yīng)和信號(hào)測(cè)定在溶液中一步完成，因此反應(yīng)速度較快，操作也相對(duì)簡(jiǎn)單。Goldman等人閡用多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體進(jìn)行多元熒光免疫分析，在溶液中成功實(shí)現(xiàn)了志賀樣毒素(SLT)、SEB、霍亂毒素(CT)、篦麻毒素(ricin)四種蛋白質(zhì)毒素的同時(shí)測(cè)定，使量子點(diǎn)探針用于實(shí)際樣品中多種毒素及其相關(guān)疾病的同時(shí)檢測(cè)成為可能。以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)為基礎(chǔ)的均相免疫分析方法不僅可以測(cè)定生物大分子(抗原、抗體)，在小分子(半抗原)的測(cè)定上也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，是最簡(jiǎn)便的均相測(cè)定方法之一。熒光共振能量轉(zhuǎn)移也稱為非輻射能量轉(zhuǎn)移，即處于激發(fā)態(tài)的供體以偶極-偶極相互作用形式將激發(fā)能轉(zhuǎn)移給鄰近的處于基態(tài)的受體。供體-受體對(duì)之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率與供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜重疊的程度以及供體與受體之間的距離密切相關(guān)［36］。量子點(diǎn)作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體有許多優(yōu)點(diǎn)：量子點(diǎn)具有寬的激發(fā)光譜、窄而對(duì)稱的發(fā)射光譜、大的吸收截面積，這樣就可以通過選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)盡可能減少對(duì)受體分子的直接激發(fā)，從而提高熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率。相對(duì)一般有機(jī)染料而言，量子點(diǎn)的體積較大，單個(gè)量子點(diǎn)表面可以結(jié)合多個(gè)受體分子或染料標(biāo)記蛋白質(zhì)，形成多受體體系，大大提高熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。另外，由于量子點(diǎn)的發(fā)射光譜可以通過其成分及大小來調(diào)節(jié)，因而，針對(duì)不同的受體分子，通過調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的組成或尺寸可以使供體(量子點(diǎn))的發(fā)射光譜和受體(染料)的吸收光譜達(dá)到最大的重疊卬-39】。Willard等人140］將生物素化的牛血清白蛋白(bBSA)偶聯(lián)到水溶性的CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)表面，與四甲基羅丹明(TMR)標(biāo)記的親和素作用，通過生物素-親和素之間特異的相互作用，觀察到量子點(diǎn)與四甲基羅丹明之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。Mattoussi及其合作者［41］將大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)通過自組裝的方式結(jié)合到量子點(diǎn)表面，當(dāng)MBP的糖結(jié)合部位預(yù)先結(jié)合了猝滅劑beta-cyclodextrin-QSY9后，由于量子點(diǎn)與QSY9之間存在FRET，量子點(diǎn)的熒光就會(huì)被猝滅，當(dāng)體系中加入麥芽糖以后，麥芽糖會(huì)占據(jù)MBP的糖結(jié)合位點(diǎn)，beta-cyclodextrin-QSY9脫離MBP,量子點(diǎn)的熒光得到恢復(fù)(見圖10—4A)。他們還將beta-cyclodextrin-Cy3.5結(jié)合到Cy3標(biāo)記的MBP上，量子點(diǎn)發(fā)生兩次熒光共振能量轉(zhuǎn)移，加入麥芽糖以后，beta-cyclodextrin-Cy3.5脫離MBP,僅發(fā)生一次熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而建立了麥芽糖檢測(cè)新方法(見圖10—4B)。Clapp等人附將不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)(510，530，555nm)表面修飾不同量Cy3標(biāo)記的MBP，研究發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)的發(fā)射光譜與Cy3的吸收光譜重疊越大，量子點(diǎn)表面修飾的Cy3標(biāo)記的MBP越多，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率越高。Medintz等人［43］研究了羅丹明紅(RR)標(biāo)記的MBP與最大發(fā)射波長(zhǎng)在555nm的量子點(diǎn)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，一個(gè)量子點(diǎn)表面連接六個(gè)RR-MBP，他們通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)計(jì)算出每個(gè)RR-MBP與量子點(diǎn)中心的距離，及其在量子點(diǎn)表面的位置，為發(fā)展新型量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器、診斷試劑以及一些疾病標(biāo)志物的快速檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。B圖10—4麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)功能化量子點(diǎn)用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)定麥芽糖。A一次熒光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè)麥芽糖；B：兩次熒光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè)麥芽糖［41］。量子點(diǎn)用于多元光學(xué)編碼高通量分析診斷2001年，Han等人［44］首先提出用量子點(diǎn)進(jìn)行多元光學(xué)編碼及高通量分析診斷。他們將不同數(shù)量、不同尺寸的量子點(diǎn)包埋到聚苯乙烯微球中，然后將單鏈DNA偶聯(lián)到微球表面，進(jìn)行高通量核酸雜交分析。從原理上講，使用六種不同顏色的量子點(diǎn)，并將每種量子點(diǎn)區(qū)分為十個(gè)強(qiáng)度，就可以實(shí)現(xiàn)一百萬(wàn)個(gè)寡聚核苷酸序列的編碼和檢測(cè)。單個(gè)光源就可以讀出所有微珠的編碼。成像及光譜測(cè)定表明這些量子點(diǎn)標(biāo)記的微珠具有高度統(tǒng)一性，并可多次重復(fù)使用，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下生成微珠的精確度高達(dá)99.99%。Xu等人呻隨后將多元編碼微珠用于單個(gè)核苷酸多態(tài)性分析，得到了滿意的結(jié)果，并證明量子點(diǎn)多元編碼微珠分析非常精確可靠。Nie課題組［46］在研究中還發(fā)現(xiàn)，使用聚苯乙烯微球包埋量子點(diǎn)時(shí)，量子點(diǎn)僅僅進(jìn)入微球表面，很難進(jìn)入微球的內(nèi)部，他們改用多孔硅包埋量子點(diǎn)，大大提高了微球的亮度，然而多孔硅的單分散性還不太好，他們又采用多孔聚苯乙烯微球包埋量子點(diǎn)［47］，大大提高了微球的亮度及單分散性，與同樣大小的無(wú)孔聚苯乙烯微球相比，多孔聚苯乙烯微球包埋量子點(diǎn)的亮度提高了約1000倍。最近，Gao等人［27］將這種編碼微球用于檢測(cè)小鼠前列腺的癌細(xì)胞，取得了很好的效果。這種技術(shù)與DNA芯片相結(jié)合，可大大簡(jiǎn)化分析過程，并提高分析的靈敏度。這些編碼微珠可望用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、高通量藥物篩選及醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域。量子點(diǎn)用于細(xì)胞中疾病標(biāo)志物的測(cè)定及細(xì)胞成像分析診斷細(xì)胞是相對(duì)獨(dú)立的生物功能體，對(duì)單個(gè)活細(xì)胞的一些活動(dòng)過程進(jìn)行高效、靈敏的監(jiān)測(cè)，將有助于闡明一些重要的細(xì)胞生理過程和藥物代謝機(jī)制，有利于了解生物體的復(fù)雜性及動(dòng)力學(xué)特性。量子點(diǎn)在細(xì)胞成像分析診斷中主要有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)亮度高，可在單個(gè)量子點(diǎn)水平對(duì)細(xì)胞過程進(jìn)行分析；(2)光穩(wěn)定性好，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控；(3)寬的激發(fā)光譜，可以一元激發(fā)，多元發(fā)射；(4)窄而對(duì)稱可調(diào)的發(fā)射光譜，可以避免細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾；(5)高的光化學(xué)穩(wěn)定性，低的背景，且比較容易通過生物素-親和素作用與蛋白質(zhì)、核酸、小分子等細(xì)胞靶分子偶聯(lián)；(6)偶聯(lián)試劑一般對(duì)量子點(diǎn)的熒光無(wú)干擾；(7)空間兼容性好，允許一個(gè)量子點(diǎn)偶聯(lián)兩種或兩種以上的生物分子或配體［48-50］。Wu等人［51,52］將免疫球蛋白G(IgG)、鏈親和素等偶聯(lián)到量子點(diǎn)表面，并證明了這些功能化的量子點(diǎn)探針能特異地識(shí)別亞細(xì)胞水平的分子靶點(diǎn)。他們首先將SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞與單克隆的抗-Her2抗體結(jié)合后，再將偶聯(lián)抗鼠IgG的QD535及QD630與細(xì)胞一起培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)合抗-Her2抗體的細(xì)胞可以被量子點(diǎn)特異性標(biāo)記，而沒有結(jié)合抗-Her2抗體的細(xì)胞則不能被量子點(diǎn)特異性標(biāo)記，只有很弱的非特異性吸附信號(hào)(見圖10－5)。同時(shí)，他們還用生物素-親和素模型檢測(cè)了細(xì)胞表面的Her2標(biāo)志物。當(dāng)SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞與單克隆的抗-Her2抗體結(jié)合后，再將細(xì)胞與生物素化的羊抗人IgG結(jié)合，然后將鏈親和素偶聯(lián)的量子點(diǎn)與細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：結(jié)合生物素化的羊抗人IgG的細(xì)胞可被鏈親和素偶聯(lián)的量子點(diǎn)特異性標(biāo)記，而空白實(shí)驗(yàn)中僅僅觀察到很低的非特異性吸附信號(hào)。為了研究量子點(diǎn)探針在醫(yī)療診斷中的可行性，他們將表達(dá)Her2的鼠乳腺腫瘤組織與兔的抗血清(這些抗血清可以與Her2的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域反應(yīng))、生物素化的羊抗兔IgG以及鏈親和素偶聯(lián)的QD630一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)可以特異性標(biāo)記這些腫瘤細(xì)胞。為了研究量子點(diǎn)探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)部蛋白的可行性，他們將鏈親和素偶聯(lián)的量子點(diǎn)與鼠3T3纖維細(xì)胞、抗-a-微管蛋白抗體以及生物素化的抗鼠IgG共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)鏈親和素偶聯(lián)的QD630量子點(diǎn)可以特異性標(biāo)記細(xì)胞微管。為了研究功能化量子點(diǎn)探針對(duì)細(xì)胞核靶點(diǎn)標(biāo)記的特異性，他們將固定的人類上皮細(xì)胞與人類抗核抗原(ANA)抗體、生物素化的抗人IgG以及鏈親和素偶聯(lián)的QD630一起培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核抗原可以被鏈親和素偶聯(lián)的QD630特異性標(biāo)記。為了進(jìn)一步研究鏈親和素偶聯(lián)的量子點(diǎn)探針的特異性，他們將人類上皮細(xì)胞與生物素標(biāo)記的二抗和特異性單抗以及鏈親和素偶聯(lián)的QD535及QD630一起培養(yǎng)，量子點(diǎn)探針可同時(shí)識(shí)別細(xì)胞表面的Her2和核抗原，也能同時(shí)識(shí)別胞漿微管蛋白和核抗原。這些開創(chuàng)性的研究工作，為量子點(diǎn)用于癌癥的早期診斷以及癌癥的治療奠定了基礎(chǔ)。圖10—5使用QD-IgG探針測(cè)定癌癥標(biāo)志物Her2。(A，C)固定的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞與抗Her2單克隆抗體及抗鼠IgG標(biāo)記的量子點(diǎn)一起培養(yǎng)，Her2被QD535-IgG(A)及QD630-IgG(C)標(biāo)記。(B，D)細(xì)胞與鼠IgG及QD-IgG共培養(yǎng)((B)QD535-IgG，(D)QD630-IgG)，只觀察到很弱的非特異性吸附信號(hào)［52］。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)與其受體酪氨酸激酶(RTKs)結(jié)合后，可導(dǎo)致受體的二聚化和自我磷酸化，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，控制細(xì)胞的一系列功能。Lidke等人［50］將生物素化的EGF結(jié)合到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)的表面，在4c時(shí)與親和素修飾的量子點(diǎn)共培養(yǎng)，可以觀察到量子點(diǎn)也結(jié)合到了細(xì)胞表面，再將溫度升到37℃，可觀察到細(xì)胞對(duì)量子點(diǎn)快速而廣泛的內(nèi)吞作用。他們將EGF修飾的量子點(diǎn)直接與CHO細(xì)胞共培養(yǎng)，也觀察到了同樣的內(nèi)吞作用。這些研究結(jié)果表明：量子點(diǎn)并沒有影響EGF的生物功能。他們還研究了細(xì)胞對(duì)EGF-QD內(nèi)吞作用的動(dòng)力學(xué)過程，表明量子點(diǎn)在空間上對(duì)試劑之間的結(jié)合沒有干擾。這些研究工作證明量子點(diǎn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方面具有巨大的優(yōu)越性，為未來的受體靶向治療提供了參考。細(xì)胞核是細(xì)胞的重要組成部分，它不僅攜帶著細(xì)胞的遺傳信息，許多核蛋白直接參與細(xì)胞的重要活動(dòng)過程，如：DNA復(fù)制、重組，RNA轉(zhuǎn)錄，DNA損傷及修復(fù)，細(xì)胞周期控制等。Chen等人網(wǎng)用電穿孔的方法將偶聯(lián)細(xì)胞核定位信號(hào)多肽(SNL)的量子點(diǎn)導(dǎo)入Hela細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)可以穿過細(xì)胞核孔，與靶目標(biāo)特異性結(jié)合，而偶聯(lián)任意序列多肽的量子點(diǎn)則在細(xì)胞內(nèi)部呈自由分布狀態(tài)。在研究中他們發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)的表面電荷對(duì)量子點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的傳輸及定位起著重要的作用。量子點(diǎn)用于活體成像及疾病診斷Akerman等人的將不同的多肽(GFE、F3和LyP-1,其中，GFE能夠與肺部血管上內(nèi)皮細(xì)胞膜的二肽酶特異性結(jié)合；F3優(yōu)先在各種不同的腫瘤中與血管和腫瘤細(xì)胞結(jié)合；LyP-1可以識(shí)別某些腫瘤上的腫瘤細(xì)胞及淋巴血管）分別連接到巰基乙酸修飾的CdSe/ZnS核-殼型量子點(diǎn)表面，他們首先將偶聯(lián)GFE的發(fā)綠色熒光的量子點(diǎn)注射到正常小鼠的尾部靜脈中，5分鐘后，在激光共焦熒光顯微鏡下切片檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)合GFE的綠色熒光量子點(diǎn)在肺臟組織中積聚；但在其它器官（腦，腎）則沒有發(fā)現(xiàn)類似的積聚現(xiàn)象。隨后，他們將F3和LyP-1修飾的紅色熒光量子點(diǎn)注射到患腫瘤的小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，偶聯(lián)F3的量子點(diǎn)在腫瘤血管發(fā)生聚集，偶聯(lián)LyP-1的量子點(diǎn)則在淋巴血管聚集。然而，這些量子點(diǎn)除特異性的結(jié)合外，還能在小鼠的肝臟及脾發(fā)生非特異性聚集。為了解決這些網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中的團(tuán)聚問題，他們將量子點(diǎn)表面吸附了部分的聚乙二醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非特異性的吸附現(xiàn)象減少了95%。這一結(jié)果預(yù)示著量子點(diǎn)可能用于疾病診斷和藥物傳遞等方面的研究（見圖10－6）。圖10—6功能化量子點(diǎn)用于活體成像分析示意圖。上圖表示功能化量子點(diǎn)在老鼠的特定組織上聚集的情況。下圖為多肽（左）以及多肽和PEG混合（右）修飾量子點(diǎn)的示意圖。PEG可以減少量子點(diǎn)在活體內(nèi)的非特異性吸附［5引。Gao等人［2力以量子點(diǎn)為基礎(chǔ)，發(fā)展了一種多功能的納米探針，用于活體腫瘤的靶向定位及成像診斷。這種多功能量子點(diǎn)表面由兩性共聚物、腫瘤抗原識(shí)別試劑、PEG分子三部分組成。其中兩性共聚物是為了保護(hù)量子點(diǎn)熒光不被猝滅，腫瘤抗原識(shí)別試劑可以與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，PEG分子可以提高探針的生物相容性。他們從細(xì)胞以及活體水平上研究了這種多功能的納米探針在生物體內(nèi)的分布、非特異性吸附、細(xì)胞毒性以及藥代動(dòng)力學(xué)。將這些多功能的納米探針注入患有前列腺癌的小鼠尾部后，探針便聚集在前列腺的癌細(xì)胞上。當(dāng)用適當(dāng)?shù)墓饩€照射這些小鼠時(shí)，它們體內(nèi)的量子點(diǎn)便開始發(fā)光，這種方法可指示1000個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的腫瘤的位置和大小。這是量子點(diǎn)第一次在活體動(dòng)物中找到目標(biāo)細(xì)胞，并且顯示出它們的位置。觀察這種多功能納米探針可以通過主動(dòng)（量子點(diǎn)表面抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原鍵合）及被動(dòng)（量子點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞上的滲透及保留）兩種方式在腫瘤位置聚集。這一成果使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及入侵的多種生物標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)成為可能。如果這一探針表面不偶聯(lián)腫瘤抗原識(shí)別試劑，而偶聯(lián)一些用于癌癥診斷和治療的藥物試劑，如合成有機(jī)分子、寡聚核苷酸或多肽，就可以進(jìn)行早期的診斷及靶向治療。呼吸道合胞體病毒（RSV）是導(dǎo)致嬰幼兒呼吸道感染的主要原因，F(xiàn)蛋白和G蛋白的存在是RSV病毒感染細(xì)胞的標(biāo)志。Bentzen等人的成功將量子點(diǎn)用于RSV的測(cè)定。他們首先將生物素化的F蛋白抗體與細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間，洗滌去除未結(jié)合到細(xì)胞上的抗體，然后加入親和素偶聯(lián)量子點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞表面有F蛋白存在時(shí)，量子點(diǎn)就會(huì)結(jié)合到細(xì)胞表面。用同樣的方法檢測(cè)了細(xì)胞表面的G蛋白。通過測(cè)定細(xì)胞表面的F蛋白及G蛋白的濃度變化，發(fā)現(xiàn)了RSV病毒感染的規(guī)律，比碳納米及磁性納米粒子用于病毒檢測(cè)的靈敏度更高，這意味著量子點(diǎn)可以用于病毒感染的早期診斷。量子點(diǎn)光動(dòng)力療法(PDT)治療癌癥光動(dòng)力學(xué)腫瘤治療是世界范圍廣泛關(guān)注的重要課題。肌體注射的光敏劑將在腫瘤部位聚集，受激光照射后產(chǎn)生光化學(xué)作用，可以選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞。Bakalova等人做57］開發(fā)出了利用量子點(diǎn)簡(jiǎn)單識(shí)別癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的技術(shù)，并通過這項(xiàng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了將癌細(xì)胞單獨(dú)找出來進(jìn)行殺滅的方法。他們將量子點(diǎn)與anti-CD抗體偶聯(lián)，發(fā)現(xiàn)它們可特異性結(jié)合到白血病細(xì)胞表面，然后將量子點(diǎn)標(biāo)記的白血病細(xì)胞與正常的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，通過血凝素親和柱色譜將細(xì)胞分離，用激光共焦熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞類型，用流式細(xì)胞儀和甲基四唑確定細(xì)胞的存活能力。結(jié)果表明：anti-CD抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)可以提高磺化鋁酞菁染料(SALPC)在UV照射下對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷效果，這是由于CdSe量子點(diǎn)在光照作用下產(chǎn)生自由基，并且釋放游離Cd2+而引起的。這僅僅只是一個(gè)初步的結(jié)果，在量子點(diǎn)真正用于癌癥治療之前，必需對(duì)量子點(diǎn)在體內(nèi)的吸收、代謝、毒性做一個(gè)全面的了解，減小其在治療中的副作用。量子點(diǎn)的生物效應(yīng)研究量子點(diǎn)在臨床診斷、治療以及生物學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，但其生物安全性目前還沒有定論，在把它應(yīng)用于人體和其它生物體之前，應(yīng)該首先了解它的生物效應(yīng)。Derfus等人的以肝細(xì)胞為模型，研究了CdSe量子點(diǎn)的生物效應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn)CdSe量子點(diǎn)在一定的條件下會(huì)表現(xiàn)出明顯的毒性，其毒性與合成過程、表面修飾和紫外光照有關(guān)，他們認(rèn)為其細(xì)胞毒性與CdSe晶格所釋放的Cd2+有聯(lián)系，表面修飾物質(zhì)的不同可以不同程度的阻止Cd2+的釋放，起到降低毒性的作用；而紫外光照將催化量子點(diǎn)表面氧化，釋放Cd2+。Hoshino等人［59］報(bào)道了采用不同分子修飾的量子點(diǎn)的潛在細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)表面修飾改變了它們的物理化學(xué)性質(zhì)，其毒性與量子點(diǎn)本身無(wú)關(guān)而與表面修飾分子有關(guān)。Kirchner等人股研究了CdSe量子點(diǎn)及CdSe/ZnS核-殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性，他們用巰基丙酸、硅微球和高分子微球分別修飾量子點(diǎn)并與細(xì)胞混合培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這些功能化的量子點(diǎn)除釋放Cd2+外，其表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)細(xì)胞也有很大的影響，量子點(diǎn)可以吸附在細(xì)胞表面并對(duì)細(xì)胞造成傷害。不同試劑修飾的量子點(diǎn)其細(xì)胞毒性也不相同。Green和Howman［61］研究了水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)和超螺旋DNA的相互作用，發(fā)現(xiàn)CdSe/ZnS量子點(diǎn)核-殼型量子點(diǎn)能損傷DNA，他們認(rèn)為這種損傷是由于CdSe/ZnS量子點(diǎn)產(chǎn)生自由基所致。前景與展望由于量子點(diǎn)在細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷及治療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值，很多科學(xué)家都加入到這方面的研究中來，并取得了很大的進(jìn)展。但目前仍有一些問題有待解決：(1)如何進(jìn)一步阻止量子點(diǎn)熒光在水溶液中的猝滅；(2)發(fā)展一些簡(jiǎn)單可靠的方法將量子點(diǎn)與特定的分子結(jié)合；(3)在分析過程中防止量子點(diǎn)的非特異結(jié)合及團(tuán)聚；(4)進(jìn)一步開展量子點(diǎn)生物毒性研究；（5）發(fā)展一種簡(jiǎn)單、通用的方法將功能化量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中?？梢灶A(yù)計(jì)，在不遠(yuǎn)的將來，多功能的量子點(diǎn)探針在腫瘤診斷和治療中將扮演重要的角色。利用這些探針對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行捕獲及定位，將可能實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷及治療；將量子點(diǎn)編碼微球與不同的靶分子結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選、藥物示蹤及尋找新的藥物。納米金及其在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用引言納米金是指金的微小顆粒（直徑1-100nm）,一般為分散在水中的水溶膠，又稱膠體金碼。受電子能級(jí)躍遷和表面等離子體共振的影響，納米金的顏色隨其粒徑大小的不同而呈現(xiàn)紅色到紫色的變化［63］。利用還原劑（如：白磷、抗壞血酸、硼氫化鈉、檸檬酸鈉等）可將氯金酸還原，制得納米金。其中，檸檬酸鈉還原法因制備簡(jiǎn)單而應(yīng)用較多［62］。受相互間誘導(dǎo)偶極的影響，納米金的凝聚會(huì)引起溶液的顏色變化，且這種變化依賴于納米金顆粒之間的距離和凝聚體的大小［64］。利用分析物能誘導(dǎo)納米金凝聚的特性，可將納米金用于DNA、蛋白質(zhì)、糖類等生物分子的檢測(cè)及相關(guān)疾病的診斷，為此，人們對(duì)表面功能化的納米金給予了廣泛的興趣并進(jìn)行了深入的研究。本節(jié)將從分析檢測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷的角度對(duì)DNA功能化的納米金、蛋白質(zhì)功能化的納米金以及糖功能化的納米金診斷試劑進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。DNA功能化的納米金診斷試劑DNA序列的檢測(cè)在疾病診斷和致病基因的研究等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為此，日益受到人們的重視。以酶標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記及其它探針標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，已建立了許多有關(guān)DNA序列的檢測(cè)方法。但是，這些方法往往存在著靈敏度低、重現(xiàn)性差、過程復(fù)雜、儀器昂貴、污染環(huán)境等缺點(diǎn)或不足，因而在應(yīng)用方面受到了很大的限制［65］。正因?yàn)槿绱耍琈irkin課題組［66,67］建立了用烷巰基化寡核苷酸探針標(biāo)記納米金并用于檢測(cè)DNA序列的新方法，該法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）雜交體系的“熔點(diǎn)曲線”很陡，熔解溫度的范圍很窄，通過調(diào)節(jié)溫度即可辨別互補(bǔ)、錯(cuò)配、缺失、插入等各種不同情況下的DNA靶片段，選擇性很高；（2）未優(yōu)化的體系即可檢測(cè)出10-i4mol/L的DNA靶片段，應(yīng)用金標(biāo)銀染法可將信號(hào)放大105倍，使檢測(cè)的靈敏度大大提高；（3）檢測(cè)過程快速、簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊、昂貴的儀器設(shè)備［68］。不論是基于光學(xué)還是電化學(xué)方法的DNA檢測(cè)及相關(guān)疾病的診斷，都要先制得納米金標(biāo)寡核苷酸探針。Mirkin課題組雁67］先將寡核苷酸探針烷巰基化、再與納米金偶聯(lián)的方法，被人們普遍采用。值得注意的是，在合成烷巰基化寡核苷酸探針時(shí)，在靠近烷巰基的一端往往要留出一定數(shù)目的堿基作為連接臂，其余的堿基則是與DNA靶片段互補(bǔ)的序列。合成好的烷巰基化寡核苷酸探針脫去保護(hù)基團(tuán)后，用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，再與納米金溶液按一定比例混合、孵育，并置于緩沖溶液中保持一段時(shí)間后，經(jīng)離心、洗滌等一系列后處理步驟即可在納米金顆粒表面修飾好烷巰基化寡核苷酸探針。光學(xué)檢測(cè)及其診斷納米金的最大吸收波長(zhǎng)依賴于顆粒之間的距離和凝聚體的大小。單分散納米金和標(biāo)記有寡核苷酸探針的納米金呈紅色。而當(dāng)DNA靶序列與納米金標(biāo)寡核苷酸探針雜交后，通過DNA

片段的相互聯(lián)結(jié)，納米金會(huì)形成延伸的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，于是體系的吸收峰發(fā)生紅移，顏色變?yōu)樽霞t色。隨著凝聚體的繼續(xù)增大，這種紅移將使體系的顏色最終變?yōu)樗{(lán)色［68］?；谝陨瞎鈱W(xué)原理，納米金標(biāo)寡核苷酸探針-DNA雜交體系可用于DNA靶序列的檢測(cè)?；蛐酒蓪?duì)微量樣品中的核酸序列信息進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高通量的檢測(cè)與分析，是進(jìn)行分子生物學(xué)研究和核酸診斷的有力工具碉。Mirkin課題組闞采用三明治雜交分析法，使DNA靶序列的兩端分別與固定在基因芯片上的寡核苷酸捕獲探針和納米金標(biāo)寡核苷酸探針互補(bǔ)、雜交，產(chǎn)生粉紅色斑點(diǎn)，經(jīng)銀染法加強(qiáng)顯色，通過目視化觀察灰度，即可定量研究DNA靶序列的雜交及單堿基錯(cuò)配的情況(見圖10—7)。51GGATTATTGTTA—AATATTGATAAGGAT3'CCTAXTAACAATTTA7AACTATTCCIATX=A（互補(bǔ)）’G,CJ（錯(cuò)配）1/W1/W（靶DNA）圖10—7納米金標(biāo)銀染加強(qiáng)的三明治雜交分析法用于DNA檢測(cè)［69］。在Mirkin課題組研究工作的啟發(fā)下，國(guó)內(nèi)不少研究者利用納米金特定的光學(xué)性質(zhì)，將金標(biāo)銀染加強(qiáng)的DNA雜交分析法與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，用于DNA的目視化檢測(cè)和疾病的診中斷。例如，龐代文課題組g70］利用自制的肝炎.病毒基因芯片，目視化檢測(cè)病人血清樣本中^^的HBV和HCV基因型，該法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、價(jià)格低廉等、叱優(yōu)點(diǎn)，有望用于肝炎疾病的臨床診斷。李軼杰等人漫］將固定在硅烷化片基上的寡核苷酸捕《獲探針與單鏈人乳頭瘤病毒16型新疆株E6(HPV1.6E6)基因的擴(kuò)增片斷相結(jié)合，理與互補(bǔ)的勺延乙《米金標(biāo)寡核苷酸探針雜交，經(jīng)銀染加強(qiáng)顯色，目視化檢測(cè)HpV16E6基因「該法快速，靈敏；月】為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床宮頸癌的早期診斷提供了技術(shù)支持。'另外，劉和平等人力將生物素化—的DNA靶序列與生物芯片上的捕獲探針雜交，利用生物素親和素之間特異性的作用，與親和素修飾的納米金結(jié)合后，經(jīng)銀染法目視化鑒定了大腸桿菌的4種血清型，該法簡(jiǎn)單、方便，無(wú)需復(fù)雜的儀器，適合于普通實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)，更能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要，故可用于某些傳染病的早期診斷與監(jiān)控'”另有不少研究者在核酸的超靈敏檢測(cè)方面進(jìn)行了積極地探索，并取得了良好的效果。例如，He等人口3］將納米金加強(qiáng)的表面等離子體共振用于DNA陣列分析及寡核苷酸的超靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)限為10pmol/L,即使不進(jìn)行優(yōu)化，該法的靈敏度也可與傳統(tǒng)的熒光法相媲美'Storhoff等［74］將DNA雜交分析法與散射法相結(jié)合，使雜交反應(yīng)在均相中進(jìn)行，無(wú)需靶擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增即可檢測(cè)出DNA靶序列，是一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)的核酸診斷方法。當(dāng)納米金表面吸附有檸檬酸根等陰離子時(shí)，受負(fù)電荷間排斥力的影響，納米金不會(huì)發(fā)生凝聚。若向體系中加入雙鏈寡核苷酸，由于雙鏈寡核苷酸上的磷酸根帶負(fù)電荷，會(huì)與檸檬酸根相互排斥，因此它無(wú)法吸附到納米金的表面；相反，單鏈寡核苷酸能靈活伸展其堿基，堿基與納米金之間相互吸引，于是單鏈寡核苷酸在納米金的表面得以吸附。Li和Rothberg［75］正是基于以上納米金與寡核苷酸之間靜電相互作用的原理，設(shè)計(jì)了一種DNA分析的新方法，該法具有以下特點(diǎn)：(1)靜電吸附，無(wú)需共價(jià)修飾納米金、探針或目的DNA；(2)雜交與檢測(cè)階段分離；(3)目視化觀察目的產(chǎn)物的顏色變化，簡(jiǎn)單、快速(5min)、檢測(cè)限低(10-i3mol)。電化學(xué)檢測(cè)及其診斷除光學(xué)方法外，也可用電化學(xué)方法進(jìn)行DNA的檢測(cè)。例如，將DNA靶序列固定在特定的電極上，與寡核苷酸修飾的納米金標(biāo)探針雜交，通過溶出伏安法測(cè)定溶解的金屬離子的濃度，即可檢測(cè)出5.0pmol/L的DNA靶序列［76,77］，Authier等人口8］運(yùn)用該法已成功測(cè)得人細(xì)胞巨化病毒(HCMV)的單鏈DNA靶序列。Lee等口9］用電沉積銀的方法來擴(kuò)增DNA雜交分析的信號(hào)，該法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好、選擇性和靈敏度都很高，在臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。而Lin等人砸將納米金固定到石英晶體微天平(QCM)上，經(jīng)寡核苷酸連接后，與溶液中的DNA靶序列雜交，并通過QCM頻率的變化來監(jiān)測(cè)上述DNA的固定與雜交過程，研究表明，該法重現(xiàn)性好、靈敏度高，為DNA傳感器的制作及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。DNA序列上的核苷酸突變可能會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生，研究這些核苷酸的突變對(duì)疾病的臨床診斷和治療將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。在臨床診斷中，單核苷酸多態(tài)性(SNP)可作為識(shí)別疾病基因的遺傳生物標(biāo)志［81］。由于傳統(tǒng)技術(shù)無(wú)法確定所有可能的SNP，并在靈敏度、檢測(cè)速度、價(jià)格等方面需要進(jìn)一步地完善，為此，Kerman等人建立了對(duì)SNP組合進(jìn)行區(qū)分和編碼的新方法，并對(duì)與腫瘤壞死因子a(TNF-a)有關(guān)的DNA探針?biāo)锌赡艿耐蛔冃问竭M(jìn)行了編碼。研究表明，單堿基修飾的納米金不僅能顯示SNP的存在，還能確定突變堿基的類型段］。蛋白質(zhì)功能化的納米金診斷試劑自從1971年，F(xiàn)aulk等開創(chuàng)免疫納米金標(biāo)記技術(shù)以來，該技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域得到了應(yīng)用。這是因?yàn)椋?1)納米金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力較強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)的標(biāo)記過程更加簡(jiǎn)單，且標(biāo)記后的蛋白質(zhì)不易失活，同時(shí)納米金也處于更穩(wěn)定的狀態(tài)，有利于長(zhǎng)期保存；(2)通過制備不同粒徑的納米金，可進(jìn)行蛋白質(zhì)的多重標(biāo)記；(4)檢測(cè)速度快，且納米金和檢測(cè)樣本的用量都很少［62］。目前，與納米金成功實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的蛋白質(zhì)主要有抗體、酶等。隨著蛋白質(zhì)類型及分析檢測(cè)方法的不同，偶聯(lián)方法會(huì)有所不同，但總體來說有兩種。一種是直接偶聯(lián)，即利用蛋白質(zhì)分子半胱氨酸殘基上的巰基，通過共價(jià)作用實(shí)現(xiàn)免疫球蛋白(IgG)、血清白蛋白等與納米金的連接陽(yáng)］；或調(diào)節(jié)體系的pH值，使蛋白質(zhì)分子帶正電，通過靜電吸附至帶負(fù)電的納米金表面，該法在電化學(xué)傳感器的制備中應(yīng)用較廣［84-89］。另一種是間接偶聯(lián)，即通過化學(xué)方法使蛋白質(zhì)分子衍生出巰基基團(tuán)［83］，再與納米金偶聯(lián)；或?qū)⒓{米金表面進(jìn)行改性，再用偶聯(lián)劑(如：戊二醛［90］、1-乙基-3［3-(二甲氨基)丙基］碳二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)［9U等)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與納米金的連接。而Zhou等研究者陽(yáng)另辟蹊徑，運(yùn)用蛋白質(zhì)原位氧化還原技術(shù)，制得了納米金-蠶絲蛋白的結(jié)合物。在納米金與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)過程中，有以下問題值得注意：(1)為避免蛋白質(zhì)分子失活，需選擇適當(dāng)?shù)木彌_體系，通常使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；(2)對(duì)溫度、濃度、pH值等偶聯(lián)條件需進(jìn)行優(yōu)化；(3)為避免或減輕蛋白質(zhì)的非特異性吸附，需用牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)或辣根過氧化物酶(HRP)等物質(zhì)封閉蛋白質(zhì)可能的活性位點(diǎn)。光學(xué)檢測(cè)及其診斷將納米金與預(yù)先精制的抗體混合，可制得納米金-抗體復(fù)合體，利用抗原-抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)，可對(duì)抗原進(jìn)行快速檢測(cè)。由于間接法比直接法的靈敏度更高，目前，人們較多采用先將抗體與抗原反應(yīng)、再與納米金標(biāo)二抗結(jié)合的方法檢測(cè)抗原。斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)正是基于“抗原-抗體-二抗-納米金”夾心法，將納米金凝聚時(shí)所伴隨的顏色變化在固相載體上顯示出來，人通過肉眼觀察，即可判斷反應(yīng)是否呈陽(yáng)性［62］。早孕診斷就是該技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用的最好例證［93］。例如，藍(lán)十字生物藥業(yè)(北京)有限公司生產(chǎn)的膠體金早早孕檢測(cè)試紙由人絨毛膜促性腺激素(HCG)抗體、抗鼠IgG、固相硝酸纖維膜和膠體金標(biāo)記的抗HCG單克隆抗體(固相或液相)及其它試劑組成，該試紙可測(cè)得女性尿液中的HCG，操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果明確［94］。與早孕診斷類似，試紙檢測(cè)也可用于微生物和病毒(如：流感病毒)的檢測(cè)。將樣本加至試紙底部，流感病毒會(huì)與抗體修飾的納米金結(jié)合形成復(fù)合體并在紙上顯現(xiàn)。當(dāng)流感病毒-納米金復(fù)合體遇到紙上的流感抗體，它們將鍵合，若鍵合數(shù)目達(dá)到百萬(wàn)個(gè)，反應(yīng)線將變?yōu)榧t色。試紙檢測(cè)雖然簡(jiǎn)便，但不夠靈敏，若病毒數(shù)目太少，可能出現(xiàn)誤診。為此，DonStraus博士將數(shù)碼成像技術(shù)應(yīng)用于流感疾病的診斷中。當(dāng)載滿病毒的熒光顆粒到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，系統(tǒng)會(huì)對(duì)顆粒進(jìn)行逐個(gè)計(jì)數(shù)，使病毒的檢出水平提高幾千倍［95］。光學(xué)技術(shù)的發(fā)展為非介入性分子成像技術(shù)注入了新的活力，內(nèi)鏡顯微術(shù)(如：X射線斷層攝影術(shù)、反射共焦顯微術(shù)和光反射成像等)為獲得清晰的細(xì)胞組織的三維圖像提供了可能，但內(nèi)鏡顯微術(shù)對(duì)與癌癥相關(guān)的生物標(biāo)記物的成像能力有限。為此，Sokolov等研究者選擇與特定生物標(biāo)記物有高度親和性的探針連接納米金，發(fā)展了一類用于反射成像的對(duì)比劑。結(jié)果表明，這類新型對(duì)比劑可用于早期癌癥的分子成像，并為價(jià)格低廉的成像系統(tǒng)用于疾病的拍攝、診斷和治療奠定了基礎(chǔ)［96］。光聲X射線斷層攝影術(shù)(OAT)是一種新型的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，它以光吸收為基礎(chǔ)，運(yùn)用光學(xué)發(fā)光和超聲檢測(cè)對(duì)深度組織進(jìn)行成像。畸變血管是OAT的內(nèi)源型對(duì)比劑，在癌癥晚期，可用以區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞；但在早期，對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞不足以區(qū)分，為此，需借助外源型對(duì)比劑。Copland等人正是利用納米金能產(chǎn)生很強(qiáng)的光聲學(xué)信號(hào)的特點(diǎn)，將納米金與單克隆抗體Herceptin(R)結(jié)合，經(jīng)過一系列的離體試驗(yàn)表明，該外源型對(duì)比劑可選擇性地瞄準(zhǔn)人的SK-BR-3乳癌細(xì)胞。因此，將上述對(duì)比劑與OAT技術(shù)相結(jié)合，用以檢測(cè)那些與抗原有關(guān)的深度腫瘤具有可行性［97］。納米金在細(xì)胞質(zhì)中一般以凝聚體的形式存在，能提供生理標(biāo)記信息，但對(duì)于癌細(xì)胞不具有特異性。而用抗-EGFR抗體連接的納米金能特定地鍵合到癌細(xì)胞表面，其親和性比正常細(xì)胞高出6倍，并伴隨有表面等離子體共振吸收峰的紅移。為此，將金標(biāo)抗-EGFR抗體和非惡性表皮細(xì)胞混合培養(yǎng)后，與納米金連接，并用表面等離子體共振散射及表面等離子體共振吸收波譜進(jìn)行表征，可用于口腔表皮癌細(xì)胞的活體和離體診斷［98］。通常，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間具有密切的聯(lián)系。為此，斯坦福大學(xué)的Zare課題組"100］開發(fā)了一種用于確定蛋白質(zhì)構(gòu)型變化的“傳感器”。他們將細(xì)胞色素c(Cytc)吸附到納米金的表面，此時(shí)溶液的pH值為10.1,呈粉紅色(見圖10—8A)。若向該體系不斷加入鹽酸，溶液的顏色將隨pH值的變化而變化(見圖10—8B)。這是因?yàn)椋?dāng)pH值從10.1下降至4.0時(shí)，鹽酸使Cytc的狀態(tài)由折疊變成展開，誘導(dǎo)納米金發(fā)生凝聚，使溶液由粉紅色變?yōu)樽仙?，?/p>

終變?yōu)闇\藍(lán)色；相反，當(dāng)pH值從4.0上升至10.1時(shí)，淺藍(lán)色溶液再次變?yōu)榉奂t色，這意味著Cytc再次折疊成最初的結(jié)構(gòu)。這種檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的方法類似于測(cè)定溶液的pH值，過程十分簡(jiǎn)單。由于該法具有通用性，可用于檢測(cè)其它結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的蛋白質(zhì)，成為檢測(cè)抗體、血液和其它疾病標(biāo)志物的有效方法。圖10-8pH值變化對(duì)Cytc修飾的納米金溶液的影響。(A)納米金溶液的顏色；(B)不同pH值條件下，Cytc修飾的納米金溶液的顏色。pH值從左到右依次為4.0，5.0，5.5，6.2，6.7，7.2，8.3，9.2，10.1；(C)24小時(shí)后，不同pH值條件下，Cytc修飾的納米金溶液的顏色［99］。電化學(xué)檢測(cè)及其診斷，位免101］，位免101］將疫傳感器和磁性免疫傳感器等巰丙基三甲氧基硅烷(MPS)水加，口正皿以一二―土”.—，u.個(gè)配土一〃「抗體(HBsAb)吸附，用于檢測(cè)人體血清中的B型乙肝抗原(HBsAg)。該安培免疫傳感器的檢測(cè)結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法一致，且靈敏度高、專一性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性長(zhǎng)，具有用于臨床診斷的潛能。而Tang等研究者口四103］用循環(huán)伏安法表征金、銀混合納米粒和白喉抗體在硅凝膠網(wǎng)絡(luò)上的吸附過程，并通過反應(yīng)前后電位響應(yīng)的改變情況來檢測(cè)人體血清樣本中的白喉抗原。研究表明，該電位免疫傳感器的電位響應(yīng)快，線性范圍寬(22-800ng/mL)，檢測(cè)限低(3.7ng/mL)，檢測(cè)結(jié)果與ELISA方法一致,可用于白喉抗原的臨床診斷。Liu和LinUM用磁鐵將抗IgG抗體修飾的磁珠固定到碳糊電極的表面，通過三明治免疫分析法將納米金包被到磁珠表面。由于樣品溶液中IgG的濃度與納米金的電化學(xué)信號(hào)密切相關(guān)，利用納米金高靈敏的電化學(xué)信號(hào)即可簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)IgG，無(wú)需使用酶標(biāo)記和底物。該電化學(xué)磁性免疫傳感器可用于多種蛋白質(zhì)的同時(shí)測(cè)定，為疾病的診斷帶來了新的機(jī)遇。糖功能化的納米金診斷試劑糖尿病易引起心血管疾病、眼睛失明等多種并發(fā)癥，長(zhǎng)期影響人們的身體健康，其危害程度僅次于癌癥。如何有效地監(jiān)測(cè)血糖濃度是治療糖尿病的關(guān)鍵性問題，遺憾的是，目前尚

無(wú)一種連續(xù)、非介入性監(jiān)測(cè)血糖的方法。鑒于葡聚糖和伴刀豆球蛋白（ConA）之間、ConA和葡萄糖之間的特定作用會(huì)引起納米金吸光特性的變化，KadirA等研究者實(shí)現(xiàn)了納米金與葡聚糖的偶聯(lián)（見圖10—9A）,并通過加入ConA使葡聚糖修飾的納米金發(fā)生凝聚，導(dǎo)致650nm吸收峰的吸光度增加；隨后加入葡萄糖，凝聚的納米金發(fā)生離解，從而使650nm吸收峰的吸光度降低（見圖10—9B）。因此，通過吸收光譜既可檢測(cè)出體液（如尿液、血液、眼淚等）中的葡萄糖濃度，為相關(guān)疾病的診斷和治療提供重要依據(jù)［64］。有報(bào)道指出［105］，臺(tái)灣研究人員提出了一種簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、無(wú)生物毒性、用于診斷圖10—9（A）葡聚糖修t金的制備方疾病的方法。他們將納米金與糖類金-糖類復(fù)合體會(huì)與特定的細(xì)10.2.5前景與展望于生物體內(nèi)的識(shí)別系統(tǒng)具該左葡萄糖檢測(cè)本基于納米金自身所特有的光學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)，結(jié)合生物技術(shù)和米金已用于DNA分析、免疫標(biāo)記、疾病的早期診斷等諸多研究領(lǐng)真正用于臨床診斷的實(shí)例并不是很多，大多數(shù)還僅限于基礎(chǔ)研究和圖10—9（A）葡聚糖修t金的制備方疾病的方法。他們將納米金與糖類金-糖類復(fù)合體會(huì)與特定的細(xì)10.2.5前景與展望于生物體內(nèi)的識(shí)別系統(tǒng)具該左葡萄糖檢測(cè)本基于納米金自身所特有的光學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)，結(jié)合生物技術(shù)和米金已用于DNA分析、免疫標(biāo)記、疾病的早期診斷等諸多研究領(lǐng)真正用于臨床診斷的實(shí)例并不是很多，大多數(shù)還僅限于基礎(chǔ)研究和法,他們已成功檢測(cè)方法，納納米金著人們對(duì)生命健康需求的不斷提高，可以預(yù)見納米金在生物分子檢測(cè)及疾病診斷等方面將發(fā)揮更加重葡萄糖要的作用。磁性納米粒及其在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用引言磁性納米粒具有核-殼式結(jié)構(gòu)，通常由鐵、鈷、鎳等金屬的氧化物組成磁性核，高分子材料組成殼。由于磁性納米粒具有良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性、藥物緩釋性、能定期排出體外等特性［106］，將其與DNA、蛋白質(zhì)、糖類等生物分子偶聯(lián)，在靶向藥物、免疫測(cè)定、細(xì)胞分離等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值［107］。將Fe(II)、Fe(m)、NH3-H2O、雙鏈DNA溶液在室溫下真空混合口081可實(shí)現(xiàn)磁性納米粒與DNA的直接偶聯(lián)。將Fe(II)、Fe(m)按一定比例混合，加至質(zhì)粒溶液中，通過加入過量NH3?H2O以提高溶液的pH值，也可得到磁性納米粒-DNA的連接物［109］。磁性納米粒與DNA的間接偶聯(lián)過程較為復(fù)雜，需進(jìn)行磁性納米粒與DNA的雙向衍生。采用油/水微乳化法制得氨基修飾、硅包被的磁性納米粒(ASMNP)后，以戊二醛作交聯(lián)劑，可將ASMNP與氨基修飾的單鏈DNA連接。也可利用鏈親和素-生物素之間特異性結(jié)合的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)ASMNP與單鏈DNA的偶聯(lián)maI"］。而Zhang等人口⑵另辟蹊徑，將放線菌素D修飾到磁性納米粒的表面，利用放線菌素D易插入雙鏈DNA某特定區(qū)域的特點(diǎn)，誘導(dǎo)雙鏈DNA與磁性納米粒的偶聯(lián)。磁性納米粒與蛋白質(zhì)的直接偶聯(lián)，可采用油酸作油相、蛋白質(zhì)和Fe3O4納米粒的混合液作水相、超聲波引發(fā)的微乳液法進(jìn)行［113］。將磁性納米粒的表面進(jìn)行改性，利用化學(xué)鍵合法可實(shí)現(xiàn)磁性納米粒與蛋白質(zhì)的間接偶聯(lián)。目前，以碳二亞胺作交聯(lián)劑，已完成了磁性納米粒與牛血清白蛋白［114］、羊抗鼠IgGM］、乳鐵傳遞蛋白［115］、血漿銅藍(lán)蛋白［115］的偶聯(lián)。在磁性納米粒表面衍生出氨基，通過戊二醛交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了磁性納米粒與脂肪酶［116］、牛血清白蛋白［117］、抗羊IgG1118］的偶聯(lián)。利用高碘酸鈉氧化磁性納米粒表面修飾的葡聚糖，再與結(jié)腸癌單克隆抗體(CL-3單克隆抗體)的氨基端結(jié)合，獲得了磁性納米粒-CL-3單克隆抗體的復(fù)合物［119］。與納米金和蛋白質(zhì)的偶聯(lián)過程相對(duì)應(yīng)，為避免蛋白質(zhì)分子失活，磁性納米粒與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)同樣需要選擇特定的緩沖溶液為反應(yīng)體系。最終，可通過施加外磁場(chǎng)［114］、凝膠過柱［119］等方法完成磁性納米粒-蛋白質(zhì)連接物與體系的分離。超順磁性氧化鐵及其在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用磁共振成像(MagneticResonanceImaging,MRI)將水、磷脂和蛋白質(zhì)等人體組織中的氫原子的磁學(xué)特性用于人體非介入性掃描的三維成像，是目前最重要的醫(yī)學(xué)診斷方法之一［120］。由于臨床上用來增強(qiáng)MRI的主要對(duì)比劑一一二乙二胺五醋酸釓(Gd-DTPA)存在著明顯的不足，而超順磁性氧化鐵(SuperparamagneticIronOxide,SPIO)具有體內(nèi)組織特異性高、安全性好、放射線不透過性等優(yōu)點(diǎn)，人們將其用于臨床MRI,對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷DISPIO的基本結(jié)構(gòu)為親水性大分子(如：葡聚糖、淀粉、肝磷脂和蛋白質(zhì)等)包裹鐵氧化物的納米顆粒(如：Fe3O4、Fe2O3或其它不溶的鐵酸鹽)。在大分子溶液中堿性共沉淀Fe(II)和Fe(m),可一步制得SPIO。而新一代的SPIO則較多采用多步法制備，并可通過控制體系的穩(wěn)定性、葡聚糖的分子量等條件來調(diào)節(jié)SPIO的顆粒大小DS。根據(jù)SPIO的顆粒大小，可將它分為普通的超順磁性氧化鐵(直徑一般在40-400nm)和超微型超順磁性氧化鐵(最大直徑不超過30nm)兩大類。普通的超順磁性氧化鐵可用作肝臟、脾臟等部位的MRI,而超微型超順磁性氧化鐵可用作血管成像及磁共振淋巴成像，成像原理及臨床應(yīng)用詳見著作［122］。肝癌是危害人類健康與生命的惡性疾病之一，其患者在早期沒有明顯的癥狀，而一旦發(fā)現(xiàn)通常已到晚期，難以治愈，死亡率很高。根據(jù)肝腫瘤與正常肝組織所表現(xiàn)的MRI信號(hào)差異，以SPIO作MRI的對(duì)比劑，可用來診斷良性肝腫瘤、惡性肝腫瘤及肝硬化、肝炎等肝臟疾?。?22］。而超微型超順磁性氧化鐵更有助于肝血管瘤的檢出和定性診斷，國(guó)外很早就將這種造影劑用于臨床診斷，但由于它的制作工藝復(fù)雜，而且價(jià)格昂貴，在我國(guó)很難廣泛使用。為此，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)的陳麗英教授與中科院金屬研究所合作，研究超微型超順磁性氧化鐵脂質(zhì)體，該物質(zhì)可用于發(fā)現(xiàn)直徑小于3mm的肝腫瘤，對(duì)于肝癌的早期診斷與治療具有十分重要的意義［123］。結(jié)合SPIO的MRI技術(shù)除用于肝病的診斷外，還可用于心肌缺血、腦血流灌注等心、腦梗阻疾病的定位和診斷［122］。經(jīng)靜脈、皮下或肌肉注射，超微型超順磁性氧化鐵可用于淋巴結(jié)疾病的診斷，其關(guān)鍵在于制備出能被淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞識(shí)別、而無(wú)法被肝臟和脾臟識(shí)別的對(duì)比劑。表面用葡聚糖修飾、直徑不等的兩種對(duì)比劑Sinerem和MION-46可用于小鼠體內(nèi)增生、受損的淋巴結(jié)磁共振成像［124］。而Illum等［125］報(bào)道，用PEG修飾SPIO的表面，經(jīng)小鼠體內(nèi)靜脈注射表明，可用作靶向區(qū)域性淋巴結(jié)的診斷試劑。為提高SPIO在惡性腫瘤中累積的高效性和專一性，人們將磁核與不同的配體（如：抗體IgG、人的多克隆IgG和L6抗體等）結(jié)合，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該磁性標(biāo)記在靶部位可獲得高濃度的富集，但所需抗體量較大。為此，Zhang等人先用3-氨丙基三甲氧基硅烷處理直徑為10nm的磁性顆粒，再與葉酸連接，該連接物可被小鼠的巨噬細(xì)胞和人的乳癌細(xì)胞內(nèi)化，但可控性較差;Sonvico將表面修飾以葡聚糖的超微型超順磁性氧化鐵與葉酸連接的PEG鍵合，該鍵合物僅內(nèi)吞到含有葉酸受體的細(xì)胞里［120］。基于此，Choi等人DS利用靶向釋放SPIO至腫瘤部位，進(jìn)行活體MRI。研究結(jié)果表明，當(dāng)SPIO與葉酸連接且細(xì)胞上有葉酸受體時(shí)，SPIO可快速、有效地內(nèi)吞至靶細(xì)胞中。經(jīng)活體腫瘤MRI前后對(duì)比發(fā)現(xiàn)，信號(hào)強(qiáng)度降低了38%，是正常肌肉MRI信號(hào)強(qiáng)度改變值的3倍。通過與其它的診斷試劑相結(jié)合，該連接物可用于腫瘤診斷和靶向性治療。其它磁性納米粒及其在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用納米免疫磁珠因具有高特異性、高分離性和高獨(dú)立性等優(yōu)點(diǎn)，被用于疾病的早期診斷中。例如，王曉光等利用抗細(xì)胞角蛋白7/8單克隆抗體包被的納米免疫磁珠富集肺癌早期患者外周血中極少量的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)免疫染色后，在光學(xué)顯微鏡下直接觀察陽(yáng)性細(xì)胞，該法的準(zhǔn)確性高，為肺癌的早期診斷提供了有效的途徑DR。Chen等研究者用外皮細(xì)胞抗體修飾的磁性納米粒分離前列腺癌晚期患者的癌細(xì)胞，并對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于癌細(xì)胞的數(shù)目反映了當(dāng)前的疾病狀況，因此，該法為前列腺疾病的臨床診斷奠定了基礎(chǔ)［128］。通常，需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增技術(shù)才能對(duì)病毒進(jìn)行直接檢查，而且時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果不可靠。為此，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員將特定病毒的抗體與外層包裹有糖鏈的氧化鐵磁性納米粒結(jié)合，注射至人體內(nèi)，經(jīng)MRI檢測(cè)病毒。運(yùn)用這種新技術(shù)，他們?cè)谘簶悠分幸殉晒z測(cè)到了單純的皰疹病毒和一種腺病毒。由于該項(xiàng)技術(shù)所需構(gòu)件均為商業(yè)化產(chǎn)品，相信它將很快應(yīng)用于相關(guān)疾病的臨床診斷［129］。前景與展望目前，超順磁性氧化鐵已成功用于臨床醫(yī)學(xué)的磁共振成像，對(duì)腫瘤的診斷具有十分重要的意義。但是，如何提高超順磁性氧化鐵在惡性腫瘤中累積的高效性和專一性，獲得靶向性釋放的能力，還需要在超順磁性氧化鐵的表面功能化方面進(jìn)行探索。而普通磁性納米粒的應(yīng)用范圍還將進(jìn)一步地拓展。其它納米粒及其在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用除了上述三種主要的納米診斷試劑外，還有一些其它的納米診斷試劑，如硅納米粒子、聚苯乙烯納米粒子、銀納米粒子以及稀土金屬納米粒子等。下面就簡(jiǎn)要介紹這些納米粒在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用。硅納米粒診斷試劑用親和素，含硫、氨、羧酸酯等基團(tuán)的物質(zhì)修飾硅納米粒的表面，再與生物素化的物質(zhì)、寡核苷酸、酶、抗體等連接，可用于生物分子的分析檢測(cè)和疾病診斷［130］。譚蔚弘等以熒光免疫分析法為基礎(chǔ)，建立了硅納米粒檢測(cè)O157:H7型大腸桿菌的新方法，該法簡(jiǎn)單、快速。檢測(cè)時(shí)，只需將硅納米粒放入食品樣本溶液中，如果樣本里存在大腸桿菌，經(jīng)抗原-抗體特異性的作用，納米粒就會(huì)與大腸桿菌結(jié)合。由于納米粒裝有很多熒光染料，通過熒光檢測(cè)即可獲得樣本中大腸桿菌的含量。該法在其它細(xì)菌的檢測(cè)及細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)等方面具有較大的應(yīng)用潛能，并在生化試劑、食品、臨床及環(huán)境樣品的檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景［131,132］。目前，對(duì)硅納米粒的研究主要集中在生物標(biāo)記［133］、分子成像［134］和DNA的分離與檢測(cè)［135］等方面。雖然這方面的研究尚處于基礎(chǔ)和試驗(yàn)階段，有關(guān)反應(yīng)機(jī)理、探針修飾及熒光猝滅等諸多問題還有待解決［130］，但鑒于硅納米粒的光穩(wěn)定性和熒光檢測(cè)的超靈敏性，相信硅納米粒會(huì)和量子點(diǎn)、納米金、磁性納米粒診斷試劑一樣，成為疾病診斷的有力工具。聚苯乙烯納米粒診斷試劑田小東等人以重氮基聚苯乙烯為載體，首次研制出登革病毒特異性重氮乳凝快速診斷試劑，該試劑在登革病毒1-4型間交叉明顯，對(duì)登革病毒以外的其它蟲媒病毒無(wú)明顯交叉反應(yīng)，最低檢出抗原量達(dá)15ng/ml病毒蛋白水平US。曾年華等人應(yīng)用純化的痢疾多價(jià)抗體致敏新型免疫載體重氮基聚苯乙烯乳膠，制成痢疾重氮乳凝試劑，在國(guó)內(nèi)首次用于診斷志賀氏菌屬痢疾桿菌［137］。錢應(yīng)娟等人應(yīng)用新型的聚醛化聚苯乙烯載體微球與最佳的旋毛蟲抗原共價(jià)交聯(lián)制備成特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的快速診斷試劑，應(yīng)用于豬旋毛蟲病的生前診斷［138］。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已經(jīng)制備出多種新型的聚苯乙烯摻雜納米材料，如：聚苯乙烯/丙烯酸丁酯/納米碳酸鈣［139］、聚苯乙烯/納米二氧化鈰［140］、二氧化硅/聚苯乙烯［141］、納米Fe3O4/聚苯乙烯［142］、納米銀/聚苯乙烯［143］，這為開發(fā)新一代診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。銀納米粒診斷試劑三角形的納米銀粒子具有優(yōu)良的光譜特性［144,145］，利用這種粒子對(duì)環(huán)境的敏感性可以制備一類新的納米診斷試劑，研究表明，這類診斷試劑具有靈敏度高、選擇性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在未來的醫(yī)學(xué)診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Haes等人［146］研究了不同形狀的納米銀的表面等離子體基元共振光譜，發(fā)現(xiàn)在十六硫醇的誘導(dǎo)下，同樣體積的三角形納米銀比半球形的納米銀具有更大的峰位移，若將這種三角形的納米銀設(shè)計(jì)為傳感器用于診斷，將比傳統(tǒng)的傳感器具有更高的靈敏度。Docherty等人［囪研究了生物分子標(biāo)記的納米銀粒子的表面增強(qiáng)拉曼光譜，并討論了該體系用于生物檢測(cè)及診斷的可行性。稀土金屬納米粒診斷試劑Yi等人［148］合成了摻雜Yb和Er的NaYF4納米晶體，所合成的納米晶體尺寸分布窄，粒徑可調(diào)控，這種納米晶體可發(fā)射上轉(zhuǎn)換熒光，量子產(chǎn)率可達(dá)1%，這種上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記試劑在未來有望進(jìn)一步用于生物診斷。Soukka等人［149］將相關(guān)抗體標(biāo)記到Eu(III)螯合的聚苯乙烯納米球上，使用兩步非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法測(cè)定了前列腺癌標(biāo)志物PSA-F，檢測(cè)限可達(dá)0.21ng/L。Feng等人［150］成功制備出功能化的氧化銪探針，發(fā)現(xiàn)這種發(fā)射紅色熒光的探針的發(fā)射波長(zhǎng)窄，熒光壽命長(zhǎng)，該探針用于免疫分析靈敏度可達(dá)到亞ppb級(jí)。近年來，我國(guó)在納米材料粉體的制備上有長(zhǎng)足的進(jìn)展，目前很多納米材料都已商品化，如納米氧化物方面有納米氧化鋅、納米氧化鈦、納米氧化硅、納米氧化鋯、納米氧化鎂、納米氧化鈷、納米氧化鎳、納米氧化鉻、納米氧化錳、納米氧化鐵等，納米金屬和合金方面有銀、鈀、銅、鐵、鈷、鎳、鈦、鋁、銀-銅合金、銀-錫合金、銅-鈦合金、鎳-鐵合金、鎳-鈷合金等，納米碳化物方面有碳化鎢、碳化硅、碳化鈦、碳化鉻、碳化鈮、碳化硼等，納米氮化物有氮化硅、氮化鋁、氮化鈦、氮化硼［151］。這些產(chǎn)品的開發(fā)為發(fā)展新一代納米診斷試劑奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，在未來的幾年，這方面的研究工作將是人們的一個(gè)研究熱點(diǎn)。我們有理由相信，在不久的將來，會(huì)有更多的納米診斷試劑用于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，將進(jìn)一步提高診斷的靈敏度及準(zhǔn)確性。微芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用生物芯片的出現(xiàn)是近年來高新技術(shù)領(lǐng)域中極具時(shí)代特征的重大進(jìn)展，是物理學(xué)、微電子學(xué)與分子生物學(xué)綜合交叉形成的高新技術(shù)［152］。若以使用功能區(qū)分，生物芯片可分為微陣列芯片(MicroarrayChip)與微流控芯片(MicrofluidicChip)兩大類。微陣列芯片是將成千上萬(wàn)的微型生物傳感器有如數(shù)組般排列在不同材質(zhì)的載體上，如玻璃、尼龍、硅芯片或塑料等材質(zhì)，借著生物傳感器上的生物探針與樣品中的特定對(duì)象進(jìn)行生化反應(yīng)，再經(jīng)換能器將反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)換成訊號(hào)輸出。若以載體上排列物質(zhì)分類，微陣列芯片又可以分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片及組織芯片等［153］，其中，基因芯片和蛋白質(zhì)芯片已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用。微流控芯片是采用微加工方法，在平方厘米級(jí)大小的芯片上刻蝕出扁平的通道和其它功能單元，通過不同的通道網(wǎng)絡(luò)、反應(yīng)器、檢測(cè)單元等的設(shè)計(jì)和布局，實(shí)現(xiàn)樣品的進(jìn)樣、反應(yīng)、分離和檢測(cè)的微型實(shí)驗(yàn)裝置，具有快速、高效和低耗等特點(diǎn)［154］。生物芯片技術(shù)的成熟和應(yīng)用，一方面將為本世紀(jì)的疾病診斷和治療、新藥開發(fā)、分子生物學(xué)、航空航天、司法鑒定、食品衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域帶來一場(chǎng)革命；另一方面則為人類提供了能夠?qū)€(gè)體生物信息進(jìn)行高速、并行采集和分析的強(qiáng)有力的技術(shù)手段，必將成為未來生物信息學(xué)研究中的重要信息采集和處理平臺(tái)。目前，生物芯片市場(chǎng)增長(zhǎng)勢(shì)頭迅猛。2000年，全球生物芯片市場(chǎng)為120億美元；到2001年，這一數(shù)額已上升到170億美元。據(jù)預(yù)測(cè)，2005年，全球生物芯片市場(chǎng)將達(dá)到200億美元，僅美國(guó)用于基因組研究的芯片銷售額將達(dá)50億美元［155］。關(guān)于生物芯片的研究，目前已經(jīng)有很多專著問世，如馬立人教授編寫、化學(xué)工業(yè)出版社出版的《生物芯片》一書［31］，李瑤編寫、化學(xué)工業(yè)出版社出版的《基因芯片技術(shù)：解碼生命》US,馬文麗編寫、廣東科技出版社出版的《DNA芯片技術(shù)的方法與應(yīng)用》［157］等，這些專著詳細(xì)介紹了生物芯片相關(guān)的基本知識(shí)、制備、檢測(cè)技術(shù)以及應(yīng)用等方面的內(nèi)容。方肇倫院士編寫的《微流控分析芯片的制作及應(yīng)用》一書［158］，介紹了微流控芯片的設(shè)計(jì)、制備、檢測(cè)及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。鑒于此，本章僅簡(jiǎn)要介紹目前應(yīng)用較多的基因芯片、蛋白質(zhì)芯片及微流控芯片在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用情況?；蛐酒卺t(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用基因芯片又稱DNA芯片，它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出來的。所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測(cè)的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行分析［31,155,156］。上個(gè)世紀(jì)90年代以來，隨著“人類基因組計(jì)劃”和“人類后基因組計(jì)劃”的開展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的遺傳疾病、環(huán)境相關(guān)疾病及感染性疾病，都可以通過DNA來進(jìn)行分析。這些疾病包括：癌癥、帕金森癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、艾滋病、肝炎、血友病、地中海貧血、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、異常血紅蛋白病、苯酮尿癥等。基因芯片可識(shí)別易患某些疾病的個(gè)體基因傾向性，從正常人的基因組中分離出DNA，與芯片雜交可得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜，然后將不同患者的DNA與芯片雜交，比較兩種圖譜的細(xì)微差異可得到病變的DNA信息，這樣患病可能性最大的人就可以進(jìn)行預(yù)防監(jiān)控、護(hù)理及早期治療［159］。腫瘤是目前對(duì)人類有嚴(yán)重危害的疾病之一，其發(fā)生和發(fā)展往往涉及多種基因的異常，如慢性粒細(xì)胞白血病可檢測(cè)到融合基因bcr-abl，急性早幼粒白血病?？蓹z測(cè)到融合基因pml-rara等，此外原癌基因c-myc、ras以及抑癌基因p53、Rb等的異常也?？稍诙喾N類型的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到，研究這些腫瘤相關(guān)的基因，對(duì)于腫瘤的早期診斷及治療具有重要的意義［31］。BRCA1基因是乳腺癌和卵巢癌基因診斷的分子標(biāo)志。Guo等人口60］將96600種含20個(gè)堿基的寡聚核苷酸探針排列在DNA芯片上，用于檢測(cè)BRCA1基因第11外顯子3.45kb的突變。在被檢測(cè)的15例病人樣品中，有14例檢測(cè)到突變，而在20例對(duì)照樣品中，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。此結(jié)果展示了DNA芯片技術(shù)在疾病基因診斷中很好的應(yīng)用前景，未來有可能代替某些常規(guī)的診斷技術(shù)。Wen等人［皿用P53基因芯片和傳統(tǒng)的DNA序列分析法，分別檢測(cè)了108例卵巢癌患者的基因突變。結(jié)果表明，總共有77例突變被兩種方法檢測(cè)出來，其中71例被芯片技術(shù)檢測(cè)出來，63例被傳統(tǒng)的DNA測(cè)序法檢測(cè)出來。不一致的結(jié)果中，有14例被基因芯片檢測(cè)出來而常規(guī)的方法未檢測(cè)出來，有6例被常規(guī)的方法檢測(cè)出來而未被基因芯片檢測(cè)出來，表明芯片技術(shù)具有94％的準(zhǔn)確性、92％的靈敏性及100％的特異性。蛋白質(zhì)芯片在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，它是將大量的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑或檢測(cè)探針以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在玻片、硅片、纖維膜等固定載體上組成密集的陣列，能夠高通量地測(cè)定蛋白質(zhì)的生物活性、蛋白質(zhì)與大分子和小分子的相互作用，或者用于高通量定性、定量檢測(cè)蛋白質(zhì)［162］。近年來，蛋白質(zhì)芯片已成為人們研究的熱點(diǎn)之一。由于蛋白質(zhì)芯片具有快速、高效、高通量的特點(diǎn)，因而，該項(xiàng)技術(shù)在醫(yī)療診斷等方面有著很大的發(fā)展前景。澳大利亞科學(xué)家Blelov［163］制備了一種含有60個(gè)CD抗體的微陣列，可用它來區(qū)分常規(guī)的白血病和非常規(guī)的白血病，并提供了一種新的疾病標(biāo)記物和抗原的發(fā)現(xiàn)方法，在病人的治療過程中，該法可測(cè)定很少量的殘留病毒。CiphergenBiosystem公司研究小組的科學(xué)家們［網(wǎng)］應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片研究了健康個(gè)體和不同發(fā)病階段癌癥病人的血清樣品，僅僅三天時(shí)間，他們就發(fā)現(xiàn)了前列腺癌的六種潛在標(biāo)記物，而常規(guī)的方法則需要幾個(gè)月到幾年的時(shí)間。Brown等人［164］選擇來自腫瘤不同階段200多個(gè)激光俘獲微分析(LCM)衍生的上皮性卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行研究，應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解析離子化(SELDI)疏水性蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上皮卵巢癌三個(gè)階段5~8個(gè)不同細(xì)胞重量的多肽現(xiàn)象指紋。Boyle等人［3使用SELDI蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)分析了鏈球菌生膿微生物分泌的鏈球菌外毒素B(SpeB)。他們將SELDI-TOF-MS與CiphergeBiosystem公司的蛋白質(zhì)讀數(shù)體系相結(jié)合，鑒定了Mr~41000的SpeB蛋白質(zhì)的酶原形式及Mr?28500的SpeB全活性酶，并觀察到SpeB表達(dá)特征。在SpeB酶原形式自動(dòng)活化的動(dòng)力學(xué)研究中，他們發(fā)現(xiàn)了全活性酶積聚之前相繼產(chǎn)生的四種SpeB中間體。微流控芯片在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用近幾年來，微流控芯片技術(shù)在疾病早期診斷方面也得到了快速的發(fā)展。中科院大連化物所Zhou等人［166］對(duì)發(fā)熱型病毒性呼吸道疾病早期檢測(cè)系統(tǒng)研究取得重大進(jìn)展，已能在自制的芯片分析儀和芯片上用自行設(shè)計(jì)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒進(jìn)行SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照測(cè)定。該項(xiàng)研究的突出特點(diǎn)在于即使是待檢測(cè)者的樣本中含有極微量的病毒RNA，也可以利用RT-PCR與微流控芯片在線檢測(cè)技術(shù)做到早期診斷。與常規(guī)的PCR-平板凝膠電泳相比，該系統(tǒng)的靈敏度提高了100倍。在實(shí)際應(yīng)用中，研究人員使用了SARS-CoV的以SARS病毒cDNA片斷為陽(yáng)性對(duì)照物，以副流感病毒作為陰性對(duì)照物，正反兩面的結(jié)果證明，用自行設(shè)計(jì)的引物和相關(guān)模板得到的試劑盒，陽(yáng)性診斷率為94%，而采用常規(guī)的PCR-平板凝膠電泳方法陽(yáng)性診斷率僅為67%oSato等人［⑹］將表面吸附抗癌胚抗原抗體的聚苯乙烯微珠導(dǎo)入微通道，與含有癌胚抗原的血清樣品、一抗、標(biāo)記膠體金的二抗依次反應(yīng)，最后用熱透鏡法(TLM)檢測(cè)固定在微珠表面的抗原-抗體配合物。與ELISA方法相比，該方法將整個(gè)反應(yīng)過程時(shí)間從45小時(shí)縮短到35分鐘，使微芯片技術(shù)用于癌癥的早期診斷成為可能。Christodoulides等人［收采用夾心免疫的方法，在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了人血清中心臟病危險(xiǎn)因子C反應(yīng)蛋白和白細(xì)胞間色素-6的同時(shí)檢測(cè)，該技術(shù)為發(fā)展心臟病快速診斷芯片奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1/863_105/applyguide/guide_bio&agri/200406010016.