第三章芽孢桿菌生物學(xué)特性

第三章芽孢桿菌生物學(xué)特性第一節(jié)芽孢桿菌形態(tài)特點(diǎn)一、概述芽孢桿菌屬于細(xì)菌。從細(xì)菌的形態(tài)特點(diǎn)上看，有三種常見形狀，即球狀、桿狀和螺旋狀。別離稱為球菌、桿菌和螺旋菌；桿菌最多，球菌次之，螺旋狀細(xì)菌最少。球菌（coccus,復(fù)數(shù)為cocci），球狀的細(xì)菌；據(jù)細(xì)胞的割裂面和子細(xì)胞分離與否有不同的排列狀態(tài)，包括了單球菌（尿素微球菌）、雙球菌（肺炎雙球菌）、鏈球菌（釀膿鏈球菌、溶血鏈球菌）、四聯(lián)球菌（玫瑰色微球菌、四聯(lián)微球菌）、八疊球菌（藤黃八疊球菌）、葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）。螺旋狀細(xì)菌（有人稱為螺菌，spirillum,復(fù)數(shù)為spirilla）；螺旋狀的細(xì)菌包括了弧菌（vibrio），螺旋不到一周，菌體呈弧形或逗號狀，霍亂弧菌；螺菌，螺旋1-6周，外形堅(jiān)挺的螺旋狀細(xì)菌，紅螺菌；螺旋體(spirochaete)，螺旋6周以上，由原生質(zhì)柱、軸絲、外鞘組成，柔軟易曲的螺旋狀菌體；鉤端螺旋體，梅毒密螺旋體。桿菌（bacillus,復(fù)數(shù)為bacilli）；桿狀的細(xì)菌，形態(tài)多樣，包括了短桿狀，短桿菌或球桿菌（甲烷短桿菌屬）；長桿或棒桿狀，長寬不同較大（枯草桿菌、北京棒桿菌、白喉棒桿菌）；梭狀，兩頭稍尖，（梭菌屬：鼠疫巴斯德氏菌）；分支桿狀，有分支（結(jié)核分支桿菌）；平截桿狀：兩頭平截（炭疽芽孢桿菌）。特殊形狀的細(xì)菌，菌體分叉，雙歧桿菌；菌體結(jié)尾有柄，柄桿菌；菌體有附器，臂微菌。細(xì)菌大小一樣用顯微測微尺測量，單位為微米（μm）1μm＝10-3mm＝10-6m。病毒多用納米（nm）為單位，1μm＝103nm。細(xì)菌的大小不一，球菌直徑μm，桿菌1-5×μm，螺旋菌大小不同較大。大腸桿菌平均長2μm，直徑μm，150個大腸桿菌細(xì)胞頭尾相接等于3mm長的一粒芝麻；120個大腸桿菌捆在一路才有一根頭發(fā)粗細(xì)（人發(fā)平均直徑60μm），109個大腸桿菌才有1mg重。盡管芽孢桿菌形態(tài)簡單，細(xì)胞大小不同也不專門大，但是，芽孢桿菌的形態(tài)特點(diǎn)和細(xì)胞大小是分類學(xué)的重要特點(diǎn)，是芽孢桿菌分類單元的實(shí)物載體，研究芽孢桿菌生物學(xué)必需描述的內(nèi)容。二、芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)芽孢桿菌屬于耗氧菌，能耐酸、耐鹽、耐高溫。芽孢桿菌具有較強(qiáng)的蛋白酶、淀粉酶活性，還有平穩(wěn)和穩(wěn)固乳酸菌的作用。此類菌在動物腸道微生物菌群中僅少量存在。目前應(yīng)用菌種是枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。芽孢桿菌存在兩種形態(tài)：芽胞和營養(yǎng)體。營養(yǎng)體的細(xì)胞大體形態(tài)有桿狀和橢圓狀。桿狀中有長桿狀、短桿狀，橢圓狀中有長橢圓和短橢圓，如以下圖。長桿狀（Bacillusclausii）短桿狀（Bacillusfirmus）橢圓狀（Bacillusendophyticus）BacillusamyloliquefaciensBacillusbenzoevoransBacilluscereusBacillusclausiiBacillusendophyticusBacillusfirmusBacillusflexusBacillusgibsoniiBacilluslentusBacillusmojavensisBacilluspumilusBrevibacillusbrevis三、芽孢桿菌芽孢形態(tài)1、芽孢的概念，有些細(xì)菌（多為桿菌）在必然條件下，細(xì)胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強(qiáng)的球形或橢圓形的休眠體。1個細(xì)菌細(xì)胞只形成1個芽孢，有的在細(xì)胞一端，有的在細(xì)胞中部。由于芽孢是在細(xì)胞內(nèi)形成的，因此也常稱之為內(nèi)生孢子，亦稱芽孢。每一細(xì)胞僅形成一個芽孢，因此其沒有繁衍功能。2、芽孢的形態(tài)，在不同細(xì)菌中，芽孢所處的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在頂端。芽孢一樣呈圓形、橢圓形、圓柱形。在有些細(xì)菌中，芽孢的直徑小于菌體直徑，這些細(xì)菌稱為芽孢桿菌，為宜氧細(xì)菌；在另一些細(xì)菌中，芽孢的直徑大于菌體直徑，使整個菌體呈梭形或鼓塑形，這些細(xì)菌稱為梭狀芽孢桿菌，為厭氧菌，梭狀芽孢桿菌的芽孢位于菌體中間。破傷風(fēng)桿菌的芽孢位于菌體的一端，使菌體呈鼓槌狀。好氧芽孢桿菌屬(Bacillus)和厭氧的梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)的所有細(xì)菌都具有芽孢。在球菌和螺菌中，只有少數(shù)種類有芽孢，球菌中只有芽孢八疊菌（Sporosarcina）屬產(chǎn)芽孢。弧菌中只有芽孢弧菌屬(Sporovibrio)產(chǎn)芽孢.細(xì)菌芽孢模式圖3、芽孢形成，芽孢的形成是一個極為復(fù)雜的進(jìn)程，包括形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成份等多方面的轉(zhuǎn)變。光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀看研究的結(jié)果，說明芽孢的形成在結(jié)構(gòu)上要緊經(jīng)歷以下幾個時(shí)期：①核物質(zhì)融合成軸絲狀（桿狀）。②在細(xì)胞中央或一端，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成隔膜包圍核物質(zhì)，產(chǎn)生一個小細(xì)胞。③小細(xì)胞被原先的細(xì)胞膜包圍，生成前孢子。前孢子實(shí)質(zhì)上是一個被兩層同心膜包圍著的原生質(zhì)體。在光學(xué)顯微鏡下觀看未染色的活細(xì)菌，能夠看到前孢子是一個清亮的、與菌體其他部份明顯不同的區(qū)域。④前孢子再被多層膜包圍，如皮層、孢子衣等，最后成為成熟的芽孢，由于細(xì)胞壁的潰溶而釋放出來。芽泡形成進(jìn)程中在化學(xué)成份方面也發(fā)生專門大轉(zhuǎn)變。生芽孢的細(xì)胞大量吸收鈣離子并大量合成營養(yǎng)細(xì)胞中沒有的吡啶二羧酸。在成熟的芽孢中，芽孢原生質(zhì)體含有極高的吡啶二羧酸鈣，在新合成的、具有特殊化學(xué)構(gòu)造的外（皮層和孢子衣，有時(shí)還有芽孢外壁）中也有這種物質(zhì)。芽孢的壁含有一種特殊的肽聚糖，所有芽孢大體上都一樣，但與營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁肽聚糖卻不一樣。同時(shí)，芽孢中還含有一些特殊的蛋白質(zhì)。4、芽孢的特性，由于芽孢在結(jié)構(gòu)和化學(xué)成份上均有別于營養(yǎng)細(xì)胞，因此芽孢也就具有了許多不同于營養(yǎng)細(xì)胞的特性。芽孢最要緊的特點(diǎn)確實(shí)是抗性強(qiáng)，對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強(qiáng)的抗性。同時(shí)，芽孢還有很強(qiáng)的折光性。在顯微鏡下觀看染色的芽孢細(xì)菌涂片時(shí)，能夠很容易地將芽孢與營養(yǎng)細(xì)胞區(qū)別開，因?yàn)闋I養(yǎng)細(xì)胞染上了顏色，而芽孢因抗染料且折光性強(qiáng)，表現(xiàn)出透明而無色的外觀。研究說明芽孢對不良環(huán)境因子的抗性要緊由于其含水量低（40％）。且含有耐熱的小分子酶類，富含大量特殊的吡啶二羧酸鈣和帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，和具有多層次厚而致密的芽孢壁等緣故。自由存在的芽孢沒有明顯的代謝作用，只維持潛在的萌生力，稱為隱藏的生命。一旦環(huán)境條件適合，芽孢即能夠萌生成營養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)菌芽孢的特點(diǎn)概要，整個生物界中抗逆性最強(qiáng)的生命體，是不是能消滅芽孢是衡量各類消毒滅菌手腕的最重要的指標(biāo)。芽孢是細(xì)菌的休眠體，在適宜的條件下能夠從頭轉(zhuǎn)變成為營養(yǎng)態(tài)細(xì)胞；產(chǎn)芽孢細(xì)菌的保藏多用其芽孢。產(chǎn)芽孢的細(xì)菌多為桿菌，也有一些球菌。芽孢的有無、形態(tài)、大小和著生位置是細(xì)菌分類和鑒定中的重要指標(biāo)。芽孢與營養(yǎng)細(xì)胞相較化學(xué)組成存在較大不同，容易在光學(xué)顯微鏡下觀看（相差顯微鏡直接觀看；芽孢染色）。芽孢的含水率低，38%～40%。芽孢壁厚而致密，分三層：外層是芽孢外殼，為蛋白質(zhì)性質(zhì)。中層為皮層，由肽聚糖組成，含大量2，6-吡啶二羧酸。內(nèi)層為孢子壁，由肽聚糖組成，包圍芽孢細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)。芽孢萌生后孢子壁變成營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁。芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（dipicolinicacid簡稱DPA）含量高，為芽孢干重的5%～15%。吡啶二羧酸，以鈣鹽的形式存在，鈣含量高。在營養(yǎng)細(xì)胞和不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌體內(nèi)未發(fā)覺2，6-吡啶二羧酸。芽孢形成進(jìn)程中，2，6-吡啶二羧酸隨即合成，芽孢就具有耐熱性，芽孢萌生形成營養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐熱性就喪失。含有耐熱性酶。芽孢由于有以上四個特點(diǎn)，是芽孢對不良環(huán)境如：高溫、低溫、干燥、光線和化學(xué)藥物有很強(qiáng)的抗擊力。細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞在70～80攝氏度時(shí)10分鐘就死亡，而芽孢在120～140攝氏度還能生存幾小時(shí)，營養(yǎng)細(xì)胞在5%苯酚溶液中專門快就死亡，芽孢卻能存活15天，芽孢的大多數(shù)酶處于不活動狀態(tài)，代謝活力極低，因此，芽孢是抗擊外界不良環(huán)境的休眠體。芽孢不易著色，但可用孔雀綠染色。5、芽孢的耐熱機(jī)制，滲透調(diào)劑皮層膨脹學(xué)說：芽孢衣對多價(jià)陽離子和水分的透性很差皮層的離子強(qiáng)度很高，產(chǎn)生極高的滲透壓奪取芽孢核心的水分，結(jié)果造成皮層的充分膨脹。核心部份的細(xì)胞質(zhì)卻變得高度失水，因此，具極強(qiáng)的耐熱性。6、芽胞的萌生，剛形成的芽孢老是處于休眠狀態(tài)。熱處置（如65℃放置幾十分鐘）能夠使芽孢加速活化。低溫貯藏也有活化作用，只是較慢。芽孢萌生時(shí)第一發(fā)生吸脹作用，隨之折光性和抗性喪失，繼而呼吸作用開始，顯出代謝活性，芽孢物質(zhì)（干重）的30％變成可溶物釋出，營養(yǎng)細(xì)胞壁迅速合成，最后，新形成的營養(yǎng)細(xì)胞從孢子衣里萌生出來。萌生通常有三種方式：赤道脫出，結(jié)尾脫出，斜出。7、芽孢的本質(zhì)，芽孢細(xì)菌的繁衍都是等分橫裂的，一個母細(xì)胞產(chǎn)生兩個子細(xì)胞。在其割裂的進(jìn)程中并無芽孢的產(chǎn)生；而巨，當(dāng)產(chǎn)生芽孢時(shí)，一個細(xì)菌只產(chǎn)生一個芽孢，并無數(shù)量的增加。一樣以為，芽孢是在生長后期、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)形成的，因此是適應(yīng)不良環(huán)境的產(chǎn)物。但事實(shí)上，可能不完滿是如此。有人在培育枯草芽孢桿菌時(shí)，曾作過追蹤觀看。結(jié)果發(fā)覺，在接種培育4小時(shí)后即有芽孢生成。以后每隔4小時(shí)觀看一次，芽孢數(shù)均呈比例增加。至24小時(shí)，約半數(shù)產(chǎn)生芽孢；48小時(shí)，全數(shù)變成芽孢。這種情形說明，在此情形下營養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)向芽孢形成有必然的概率。芽孢開始形成沒必要等到生長后期，更沒必要等到生長完全停止。因此，芽孢形成既不是細(xì)菌生活周期的必經(jīng)時(shí)期，也不是細(xì)菌繁衍的一種形式，又不是一種消極的對環(huán)境的反映，而是一個新器官的踴躍生成。決定芽孢形成的全然緣故在于細(xì)菌內(nèi)部，細(xì)菌染色體上有操縱芽孢形成的基因。細(xì)菌在營養(yǎng)生長中，這些基因通常不表達(dá)，它們可能被一個阻遏體系所操縱，一旦這一阻遏排除，就可致使芽孢形成。有時(shí)人們把芽孢與莢膜、鞭毛等并列，統(tǒng)稱為細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)，這一稱號也值得商議。因?yàn)樵谡ＩL中的營養(yǎng)細(xì)胞本身并無芽孢，而當(dāng)芽孢形成后，養(yǎng)細(xì)胞就不復(fù)存在。盡管在有些菌類，芽孢形成后還有部份菌體殘余，但這時(shí)的菌體已喪失了營養(yǎng)細(xì)胞的作用，不能再象無芽孢時(shí)的菌體那樣進(jìn)行生命活動。而莢膜和鞭毛就不同了，它們不阻礙細(xì)菌的生命活動，伴隨著營養(yǎng)細(xì)胞的生存而存在。因此，把芽孢看成是一種獨(dú)立的休眠體，是一種踴躍產(chǎn)生的新的生命形式或新器官，或許是適當(dāng)?shù)摹?、芽孢的成份，芽孢是微生物的休眠狀態(tài)，大部份代謝活動停止。營養(yǎng)體是芽孢桿菌的繁衍狀態(tài)。營養(yǎng)體約30分鐘割裂增殖一次，營養(yǎng)、溫度、pH等條件的改變會使芽胞和營養(yǎng)體轉(zhuǎn)化。芽胞在適宜條件下一樣4-6小時(shí)萌生成為營養(yǎng)體。營養(yǎng)體能產(chǎn)酶，目前作為飼料用酶中的很多中酶，如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶等都可由芽胞桿菌產(chǎn)生。絕大多數(shù)的芽孢桿菌是一個菌體僅形成一個芽孢，芽孢位于菌體內(nèi)，由核心、皮層、芽孢殼和外壁組成。核心是芽孢的原生質(zhì)體，內(nèi)含DNA、RNA、可能與DNA相聯(lián)系的特異芽孢蛋白質(zhì)和合成蛋白質(zhì)和產(chǎn)生能量的系統(tǒng)。還有大量的吡啶二羧酸鈣布滿整個芽孢。皮層處于核心和芽孢殼之間，含有豐碩的肽聚糖。芽孢殼要緊由蛋白質(zhì)組成；另外，還有少量的碳水化合物和類脂類，可能還有大量的磷。最外層是外壁，其要緊成份是蛋白質(zhì)、必然量的葡萄糖和類脂。由于芽孢具有厚而含水量低的多層結(jié)構(gòu)，因此折光性強(qiáng)、對染料不易著色，芽孢對熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強(qiáng)的抗擊力，這可能與芽孢獨(dú)具的高含量吡啶二羧酸有關(guān)。9、芽孢的作用，分類鑒定不同細(xì)菌的芽孢具有不同的特點(diǎn)，從形狀、大小、表面特點(diǎn)，直到與菌體的關(guān)系等都有不同的表現(xiàn)，因此能夠作為分類鑒定的依據(jù)或參考?？蒲胁牧嫌捎谘挎擢?dú)特的產(chǎn)生方式，成為研究形態(tài)發(fā)生和遺傳操縱的好材料。保留菌種芽孢對不良環(huán)境有很強(qiáng)的抗擊力，能夠維持生命力達(dá)數(shù)十年之久，在自然界使細(xì)菌度過惡劣的環(huán)境，在實(shí)驗(yàn)室是保留菌種的好材料。分離菌種芽孢的耐熱性有助于芽孢細(xì)菌的分離。將含菌懸浮液進(jìn)行熱處置，殺死所有營養(yǎng)細(xì)胞，能夠挑選出形成芽孢的細(xì)菌種類。生物殺蟲有些芽孢細(xì)菌在產(chǎn)生芽孢的同時(shí)，能夠產(chǎn)生一種雙錐形的結(jié)晶內(nèi)含物，稱為伴孢晶體，這是一種蛋白質(zhì)毒素，能夠殺死某些昆蟲（專門是鱗翅目）的幼蟲。蛋白質(zhì)晶體的毒性是有高度專性的，對其他動物與植物完全沒有毒性。因此，它們便成為一種理想的生物殺蟲劑，這種殺蟲劑的生產(chǎn)，并非需將蛋白質(zhì)分離出來，只需培育大量細(xì)菌，在其形成芽孢并產(chǎn)生晶體時(shí)收成、干燥，做成粉劑即可。10、芽孢的利用，芽孢可度過不良環(huán)境，對干旱和高、低溫都有極強(qiáng)的抗擊力。條件轉(zhuǎn)好時(shí)，1個芽孢可形成1個細(xì)菌細(xì)胞。有些細(xì)菌的芽孢，在干燥條件下，可維持10連年或更長的時(shí)刻仍能萌生，有的能忍耐-253℃的低溫，有的在滾水中煮30小時(shí)后仍有生活力，但也有的芽孢在80～9011、芽孢的危害，芽孢對人類也有有害的一面。最多見的情形之一，確實(shí)是用加熱法保留食物時(shí)，芽孢往往會造成保留的失敗。這是因?yàn)檠挎邩O耐熱，一樣加熱法不能把它殺死，它萌生成營養(yǎng)細(xì)胞后大量繁衍，會致使食物腐敗變質(zhì)。因此需要用高溫滅菌法（121℃，30min）把芽孢殺死，才能使食物長期保留。醫(yī)療器械也需經(jīng)高溫滅菌后才能保證平安。近幾年進(jìn)展起來的輻射滅菌法，其要緊殺滅對象也是芽孢。12、伴孢晶體，伴孢晶體（parasporalcrystal）少數(shù)芽孢桿菌，例如蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)在其形成芽孢的同時(shí)，會在芽孢旁形成一顆菱形或雙錐形的堿溶性蛋白晶體—δ內(nèi)毒素，稱為伴孢晶體。特點(diǎn)：不溶于水，對蛋白酶類不靈敏；容易溶于堿性溶劑。伴孢晶體對200多種昆蟲尤其是鱗翅目的幼蟲有毒殺作用，因此可將這種產(chǎn)伴孢晶體的細(xì)菌制成有利于環(huán)境愛惜的生物農(nóng)藥——細(xì)菌殺蟲劑。

Bacillussubtilis圖2Bs-8093菌株的菌體形態(tài)Fig2ElectronmicrographofstrainBs-8093四、芽孢桿菌伴胞晶體形態(tài)在芽孢桿菌中，有一類能產(chǎn)生伴胞晶體的，如蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱Bt），是一類包括許多亞種并對多種昆蟲具有高毒力的產(chǎn)晶體芽孢桿菌[1]。自20世紀(jì)初被發(fā)覺以來，世界各國又接踵從昆蟲體內(nèi)或土壤中分離出該種細(xì)菌，全世界搜集保藏的Bt已達(dá)4萬株，在害蟲的防治中發(fā)揮了龐大的作用，是最近幾年來進(jìn)展最快、應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑[2]。我國地域遼闊、生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，微生物資源極為豐碩，BtLSZ9408（B.thuringiensiskurstakii）是福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所分離的、對多種鱗翅目具有高毒力的Bt菌株，有較大的應(yīng)用潛力[3,4]。Bt大多數(shù)菌株都能產(chǎn)生多種類型的晶體蛋白，不同亞種乃至同一亞種不同菌株殺蟲晶體蛋白的多肽成份都不同，殺蟲蛋白晶體由多種蛋白多肽組成，這些蛋白多肽在不同類型殺蟲蛋白中以不同方式結(jié)合而構(gòu)建蛋白晶體[5]。CryI、CryIVA和CryIVB蛋白的C端區(qū)域結(jié)構(gòu)相似，富含半胱氨酸蛋白多肽之間通過二硫鍵能自我積聚，形成穩(wěn)固晶體結(jié)構(gòu)，這種伴胞晶體需要一個更嚴(yán)格的理化條件才能形成一個可溶和具有活性的殺蟲蛋白結(jié)晶。CryIIIA蛋白由于其C端區(qū)域并非富含半胱氨酸，組成蛋白晶體的蛋白多肽之間并非是由二硫鍵相連而是鹽橋作用組成伴胞晶體。71kDa的CryIIA蛋白、72kDa的CryIVD蛋白和27kDa的CytA蛋白晶體形成和穩(wěn)固需要其它多種輔助蛋白(P19，P20，orf1，orf2)存在，表現(xiàn)出蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白晶體形成的多樣性。由于殺蟲晶體蛋白這些組成上的不同，其溶解性也是多種多樣[6]。利用透射電鏡觀看了Bt標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1（B.thuringiensiskurstakii）的伴孢晶體形成進(jìn)程。正在分裂的細(xì)胞，芽孢正在形成分裂時(shí)形成的隔膜正在分裂的細(xì)胞，芽孢正在形成分裂時(shí)形成的隔膜二聯(lián)體三聯(lián)體二聯(lián)體三聯(lián)體正在分裂的細(xì)胞，形成隔膜，而后形成前芽孢。對稱分裂和不對稱分裂二聯(lián)體和三聯(lián)體培育24h的Bt菌株HD-1的透射電鏡觀看見圖1。電鏡觀看說明：HD-1菌體為短桿狀，細(xì)胞割裂時(shí)形成隔膜，隔膜的形成啟動了芽孢和晶體的形成，隔膜中間向母細(xì)胞一端凸出形成脊，后隔膜雙側(cè)向端部移動，兩邊速度不一樣，形成亞極型前芽孢，最后連接，前芽孢形成。芽孢形成于遠(yuǎn)離隔膜的一端，晶體形成在在隔膜的一端。芽孢和晶體在成熟后從細(xì)胞中離開，晶體為菱形，芽孢橢圓形，外帶有芽孢衣。細(xì)胞體內(nèi)正在形成的晶體和芽孢細(xì)胞體內(nèi)正在形成的晶體和芽孢在細(xì)胞體內(nèi)形成的完整的晶體在細(xì)胞體內(nèi)形成游離的芽孢在細(xì)胞體內(nèi)形成的完整的晶體在細(xì)胞體內(nèi)形成游離的芽孢細(xì)胞體內(nèi)正在形成的晶體和芽孢細(xì)胞體內(nèi)形成的成熟的晶體和芽孢正在脫落的芽孢正在脫落的芽孢正在脫落芽孢的細(xì)胞正在脫落的芽孢脫落的芽孢分裂后形成的子細(xì)胞正在分裂的細(xì)胞脫落的晶體脫落的芽孢分裂后形成的子細(xì)胞正在分裂的細(xì)胞脫落的晶體芽孢衣芽孢衣已脫落的芽孢和晶體芽孢一，芽孢外有一層纖維狀的芽胞衣蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白可分為三種類型：130-145、65-78和27kDa。不同的亞種或菌株，其伴孢晶體可由單一的蛋白質(zhì)毒素組成，也可能由兩個或多個不同大小級別的蛋白質(zhì)毒素組成。對鱗翅目害蟲有毒性的蛋白主若是前兩種類型的蛋白[11]。本研究的電鏡觀看說明Bt菌株HD-1在割裂進(jìn)程中形成芽孢和晶體，晶體為大菱形。前期的預(yù)備實(shí)驗(yàn)還發(fā)覺BtLSZ9408晶體形態(tài)多種，除有菱形晶體外，還帶有不同大小的小方形的晶體。芽孢二菱形的晶體菱形的晶體一端帶缺口的菱形晶體圖1培養(yǎng)24h的Bt菌株HD-1的透射電鏡觀察二、芽孢桿菌菌落形態(tài)芽孢桿菌菌落特點(diǎn)是種的一個重要指標(biāo)，描述芽孢桿菌菌落特點(diǎn)的描述一下幾個方面進(jìn)行，特定培育條件下的菌落大小、單菌落形狀、表面顏色、表面特性、表面滑膩度、邊緣整齊度等等。如枯草芽孢桿菌在錳營養(yǎng)瓊脂平板上37℃培育36h形成的菌落為圓形，直徑3.0mm～10.0mm4399Bacillusatrophaeus白色，背面淡黃色，圓形或不規(guī)則，不透明，表面有一層膜，無光澤4403Bacillusatrophaeus暗白色，背面橙色，表面有一層膜狀物，有褶皺，干燥，無光澤4404Bacillusatrophaeus白色，背面淡黃色，表面有一層膜狀物，有褶皺，干燥，無光澤，邊緣不整齊4580Bacillusatrophaeus白色，圓形，表層有膜狀物，有光澤，具有流動性，邊緣透明4542Bacilluscereus白色，近圓形，扁平，濕潤，有光澤，邊緣不整齊，4679Bacilluscereus白色或培養(yǎng)基顏色，根狀，扁平，緊貼培養(yǎng)基不易挑取4415Bacilluslicheniformis圓形，突起，有光澤，中間有小凸起，4394Bacillusmegaterium菌落大，乳白色，圓形，隆突，光滑，有光澤，周變透明，具流動性，4395Bacillusmegaterium菌落大，乳白色，圓形，突起，菌落緊縮在一起，有褶皺，有光澤，4401Bacillusmegaterium橙色，圓形，突起，濕潤，有光澤，周邊透明，4503Bacillusmegaterium菌落大，乳白色，突起，有光澤，周邊透明，具有流動性4749Bacillusmycoides菌落黃白色，無規(guī)則，隨著劃線生長，似旋風(fēng)狀，布滿培養(yǎng)皿，濕潤4537Bacilluspolymyxa菌落米粒大小，黃白色，突起，緊貼培養(yǎng)基，無光澤，邊緣整齊4567Bacilluspolymyxa菌落小，連成一片，培養(yǎng)基顏色，無光澤，邊緣整齊4575Bacilluspolymyxa菌落小，白色，突起，無光澤，邊緣整齊4400Bacilluspumilus菌落圓形，黃色，濕潤，邊緣不整齊，突起，4563Bacilluspumilus菌落小，黃色，圓形，隆突，有光澤4393Bacillussimplex培養(yǎng)基顏色，圓形，突起，有光澤，半透明，中間有凹窩4751Bacillussphaericus菌落小，淺黃綠色，圓形，有時(shí)成片狀，光滑，有光澤4410Bacillussubtilis菌落黃白色，圓形，突起，光滑，有光澤，似透明，邊緣透明圈4428Bacillussubtilis白色，枯草狀，扁平，表面粗糙有一層膜狀物，有褶皺，無光澤，不透明，中間凹陷4475Bacillussubtilis白色，圓形或不規(guī)則，枯草狀，扁平，表面有一層膜，有褶皺，無光澤，不透明，中間有一“小亮球”4508Bacillussubtilis濁白色，扁平，邊緣不整齊，中間有”小窩“4418Bacillusthuringiensis白色，扁平，濕潤，有光澤，邊緣不整齊4734Bacillusthuringiensis白色，根狀，扁平，易挑取解淀粉芽胞桿菌圖1Bs-8093菌株的菌落形態(tài)Fig1ColonymorphologyofstrainBs-8093Bacillusazotoformans-1Bacillusbadius-1BacilluscirculansBacillusBacillusfirmusBacillusinsolitus-1BacilluslentusBacillusmojavensisBacillussmithiiBrevibacilluscentrosporusBrevibacilluslaterosporusJeotgalibacillusPaenibacillusthiaminolyticus地衣芽胞桿菌-Bacilluslicheniformis解淀粉芽胞桿菌-Bacillus第二節(jié)芽孢桿菌生長特性一、概述芽孢桿菌群體的生長繁衍可分為四期：遲緩期（lagphase），也稱適應(yīng)期，芽孢桿菌接種至培育基后，對新環(huán)境有一個短暫適應(yīng)進(jìn)程（不適應(yīng)者可因轉(zhuǎn)種而死亡）。此期曲線平坦穩(wěn)固，因?yàn)檠挎邨U菌繁衍極少。遲緩期長短因素種、接種菌量、菌齡和營養(yǎng)物質(zhì)等不同而異，一樣為1～4小時(shí)。此期中芽孢桿菌體積增大，代謝活躍，為芽孢桿菌的割裂增殖合成、儲蓄充沛的酶、能量及中間代謝產(chǎn)物。對數(shù)期(logarithmicphase)，又稱指數(shù)期(exponentialphage)。此期生長曲線上活菌數(shù)直線上升。芽孢桿菌以穩(wěn)固的幾何級數(shù)極快增加，可持續(xù)幾小時(shí)至幾天不等（視培育條件及芽孢桿菌代時(shí)而異）。此期芽孢桿菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對外界環(huán)境因素的作用靈敏，因此研究芽孢桿菌性狀以此期芽孢桿菌最好?？股刈饔?，對該時(shí)期的芽孢桿菌成效最正確。穩(wěn)按期（stationaryphase），該期的生長菌群總數(shù)處于平坦時(shí)期，但芽孢桿菌群體活力轉(zhuǎn)變較大。由于培育基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性產(chǎn)物（有機(jī)酸、H2O2等）積存ph下降等不利因素的阻礙，芽孢桿菌繁衍速度漸趨下降，相對芽孢桿菌死亡數(shù)開始慢慢增加，此期芽孢桿菌增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平穩(wěn)。芽孢桿菌形態(tài)、染色、生物活性可顯現(xiàn)改變，并產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物如外毒素、內(nèi)毒素、抗生素、和芽胞等。衰亡期（declinephase），隨著穩(wěn)按期進(jìn)展，芽孢桿菌繁衍愈來愈慢，死亡菌數(shù)明顯增多?；罹鷶?shù)與培育時(shí)刻呈反比關(guān)系，此期芽孢桿菌變長腫脹或畸形衰變，乃至菌體自溶，難以辯認(rèn)其形，生理代謝活動趨于停滯，故陳腐培育物上難以辨別芽孢桿菌。種族增長曲線細(xì)菌培育是一種間歇的培育方式，在培育中細(xì)胞數(shù)的轉(zhuǎn)變一樣經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長期、減速期、靜止期、衰亡期等時(shí)期，在指數(shù)生長期中，有：dN/dt=k·N……(1)。在初值N(0)=N0下，上式求解得：Nt=N0·ekt........(2)，兩邊取對數(shù)InNt=InN0+k·t.......(3)。目前的文獻(xiàn)中，主若是采納指數(shù)模型對細(xì)胞的生長發(fā)燒功率曲線進(jìn)行處置，容易看出，當(dāng)t→∞時(shí)，有Nt→∞，這確實(shí)是說模型(1)只能對短時(shí)刻的情形適用，關(guān)于有些實(shí)驗(yàn)，由于菌種培育方式、培育條件等不同，細(xì)菌的生長有不同的特點(diǎn)，因此，不完全符合指數(shù)生長特點(diǎn)，需要對指數(shù)模型進(jìn)行修正，以便更好地反映細(xì)菌的生長特點(diǎn)，對指數(shù)模型進(jìn)行修正，修正后的模型關(guān)于實(shí)驗(yàn)中的“s”型生長曲線很適宜。在細(xì)菌培育中，隨著細(xì)菌的大量繁衍，培育基中營養(yǎng)物的消耗，加上有害代謝物的積存，細(xì)菌的生長速度會慢慢下降，細(xì)菌的增加總要受到各類條件的約束，不可能無窮增加，而有一個最大的限度Nm,為了使模型更符合實(shí)際，把指數(shù)模型(1)修改成：dN／dt=k·Nt(Nm-Nt)／Nm……(4)。(4)式在t→0時(shí)，Nt→N0，下的解為：Nt=Nm[1-(Nt/N0-1)exp(-kt)]………(5)。N0、Nt別離為0和t時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)量，Nm為生長期中最大細(xì)胞數(shù)量，k為增加速度常數(shù)。關(guān)于任何N0>0，均有t→∞時(shí)，Nt→Nm，也確實(shí)是說平穩(wěn)點(diǎn)N=Nm是全局漸近穩(wěn)固的，(5)式變換形式礙：Nm/Nt-1=(Nm/N0-1)exp(-kt)…….(6)。關(guān)于指數(shù)模型(1)，細(xì)菌的比生長速度ut=(1/Nt)(dNt/dt)=k,而修正模型(4)中，細(xì)菌的比生長速度ut=(1/Nt)(dNt/dt)=k(Nm-Nt)/Nm=(1-Nt/Nm),修正模型(4)直接反映了細(xì)菌個體繁衍對整體繁衍的阻礙；(1-Nt/Nm)項(xiàng)，反映了有限環(huán)境中剩余的尚未被細(xì)菌所占有的，可供利用的營養(yǎng)物或生存空間的一種量度，是細(xì)菌再增殖的潛力所在，修正模型(4)反映細(xì)菌在有限條件下其增加受到線性限制作用．當(dāng)細(xì)菌數(shù)Nt小時(shí)，它離限度Nm遠(yuǎn)，環(huán)境中剩余的有效營養(yǎng)和空間(1-Nt/Nm)多，這時(shí)細(xì)菌進(jìn)展的潛力大，細(xì)菌的比增加速度ut=(1/Nt)(dNt/dt)大，而當(dāng)細(xì)菌數(shù)Nt大，愈來愈接近最大限度Nm時(shí)，環(huán)境中剩余的有效營養(yǎng)和空間(1-Nt/Nm)愈來愈少，這時(shí)能提供細(xì)菌再進(jìn)展的有效營養(yǎng)和空間愈來愈少，因此細(xì)菌再進(jìn)展的潛力愈來愈小，細(xì)菌比生長速度um=(1/Nt)(dNt/dt)愈來愈低．最后當(dāng)細(xì)菌數(shù)Nt達(dá)到最大限度Nm時(shí)，有效營養(yǎng)和空間已盡[(1一Nt/Nm)=0]，環(huán)境中已不剩余有效營養(yǎng)和空間，這時(shí)細(xì)菌也不可能再進(jìn)展了，細(xì)菌的比生長速度um下降為0。細(xì)菌的生長動力學(xué)曲線代表著細(xì)菌生長和代謝的特點(diǎn)，反映了其生長和代謝進(jìn)程中，生理和生化特點(diǎn)隨時(shí)刻的轉(zhuǎn)變情形關(guān)于“S”型的生長發(fā)燒功率曲線，按模型(4)比按指數(shù)模型處置所得的結(jié)果相關(guān)性好得多．也確實(shí)是說，模型(4)比指數(shù)模型更接近于這種條件下細(xì)菌生長代謝的特點(diǎn)．模型(4)關(guān)于咱們進(jìn)一步地探討細(xì)菌生長的生理特點(diǎn)和動力學(xué)特點(diǎn)具有必然的意義。咱們能夠看出，指數(shù)模型即為模型(4)關(guān)于Nt=0的線性化模型，因此能夠說指數(shù)模型所，以用于描述細(xì)胞增加致使失真的要緊緣故是“線性化”所致，盡管模型(4)比指數(shù)模型更接近實(shí)際情形，但咱們能夠看出，模型(4)僅比指數(shù)模型右邊多了一個線性因子(Nm-Nt)／Nm。有的情形下，這種修正的模型仍然不足以描述實(shí)際情形，而需要加更高次的修正因子，而且關(guān)于不同特點(diǎn)的細(xì)菌．其生長發(fā)燒功率曲線不同．因此，需要成立不同的熱動力學(xué)模型進(jìn)行處置。盡管物種具有龐大的增加潛力，但在自然界中，種群卻不能無窮制地增加。因?yàn)殡S著種群數(shù)量的增加，環(huán)境的制約因素的作用也在增大，環(huán)境中制約種群增加的因素稱為環(huán)境阻力。它包括同種個體之間對食物和空間的競爭加重、疾病蔓延、捕食者因捕食對象的增多而增多等，從而致使殘廢率增加、誕生率降低，最終趨向平穩(wěn)。因此，在自然環(huán)境中，種群的增加曲線是一個“S”型曲線（也稱為邏輯斯蒂曲線）。種群達(dá)到環(huán)境所能負(fù)擔(dān)的最大值，稱為環(huán)境的滿載量或負(fù)載能力，用“K”表示（如圖1）。那么，種群什么緣故不能無窮增加而維持在相對穩(wěn)固的水平？依照對很多生物種群在有限食物和有限空間條件下數(shù)量動態(tài)的研究，種群在開始時(shí)增加比較緩慢，以后慢慢加速，當(dāng)種群數(shù)量達(dá)到環(huán)境所許諾的最大數(shù)量的一半時(shí)，增加速度最快，可是種群所需要的資源種族增加曲線（食物、空間等）是有限的，隨著資源的枯竭，環(huán)境阻力將隨著種群的增加而成正比例增加，種群增加速度慢慢緩慢下來，直到停止增加，另外，種群內(nèi)部的彼此關(guān)系和其他一些環(huán)境因素，如氣候、食物、空間、營巢地、天敵、疾病、種間競爭等環(huán)境阻力都會抑制種群數(shù)量無窮增加。當(dāng)種群增加到“K”值，會因?yàn)槭澄锊蛔?、空間有限、天敵增加等因素而使種群數(shù)量慢慢降低，降到基準(zhǔn)線以下，又會因空間、食物的豐裕而數(shù)量上升，因此，種群的數(shù)量會在必然范圍內(nèi)（基準(zhǔn)線上下）波動，維持在一個相對恒定的水平上（如圖2）。K值的應(yīng)用種族增加曲線種數(shù)數(shù)量在達(dá)到K/2時(shí)（如圖3中的A點(diǎn)），種群數(shù)量幾乎呈直線上升，這一時(shí)期稱指數(shù)生長期，A點(diǎn)是阻礙種群數(shù)量的關(guān)鍵點(diǎn)。該值可直接用于說明文中有關(guān)“種群數(shù)量轉(zhuǎn)變的意義”中的幾個實(shí)例問題。種族增加曲線-實(shí)例實(shí)例：研究種群數(shù)量轉(zhuǎn)變的規(guī)律，有利于對野生生物資源的合理利用和愛惜。釋義：一樣野生動植物種群的數(shù)量操縱在環(huán)境容納量的一半，即K/2值時(shí)，現(xiàn)在種群增加速度最快，可提供的資源數(shù)量也最多，而又不阻礙資源的再生，當(dāng)種群數(shù)量大于K/2值，種群增加的速度將開始下降。因此在開發(fā)動植物資源時(shí)，種群數(shù)大于K/2值時(shí)就能夠夠獵取必然數(shù)量的該生物資源，而且取得的量最大，當(dāng)進(jìn)程獵取致使種群數(shù)量小于K/2值時(shí)，種群增加的速度將會減慢，獲取的資源數(shù)量將減少，而且還會阻礙資源的再生。種族增加曲線-知識拓展種群轉(zhuǎn)變規(guī)律，關(guān)于操縱世界人口增加，解決環(huán)境危機(jī)一樣具有重要的指導(dǎo)意義。人類目前面臨的生存危機(jī)，其本源就在于人口種群的急速增加與有限的環(huán)境資源之間的矛盾。世界人口長期以來呈指數(shù)增加趨勢，主若是由于人類能夠不斷的開發(fā)新能源，并通過工業(yè)革命、農(nóng)業(yè)革命等手腕，適本地提高了自然界對人類的最大負(fù)荷量（K值）。但環(huán)境資源畢竟有限，假設(shè)人口數(shù)量增加到K值，將會引發(fā)生物圈的崩潰，后果不堪假想。因此科學(xué)的操縱人口增加率，是解決環(huán)境問題的全然方法。二、芽孢桿菌的生長特性單細(xì)胞微生物（如細(xì)菌、酵母菌）接種到均勻的液體培育基后，當(dāng)細(xì)菌以裂殖、酵母菌以芽殖方式增殖后，其子細(xì)胞都具有生活能力。依照不同培育時(shí)刻時(shí)菌量的轉(zhuǎn)變，能夠作出一條反映微生物在整個培育期間菌數(shù)轉(zhuǎn)變規(guī)律的曲線，這種曲線稱為生長曲線稱為生長曲線(growthcurve)。一條典型的生長曲線至少能夠分為延遲期、指數(shù)期、穩(wěn)按期和衰亡期等四個生長時(shí)期。這四個時(shí)期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培育條件的不同而有所改變。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解各菌的生長規(guī)律，關(guān)于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)采納比濁法測定，由于細(xì)菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計(jì)測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應(yīng)的培育時(shí)刻作圖，即可繪出該菌在必然條件下的生長曲線，此法快捷、簡便。本實(shí)驗(yàn)的目的是為了解JK-2的生長曲線特點(diǎn)來確信JK-2接種及發(fā)酵所需的時(shí)刻。實(shí)驗(yàn)方式：材料，短短芽孢桿菌JK-2，NA培育基，250ml三角瓶,移液槍，搖床。分光光度計(jì)，超凈工作臺。液體培育基：淀粉%、牛肉膏%、蛋白胨%、蔗糖%、酵母%氯化鈣05%。方式，種子液制備，取短短芽孢桿菌JK-2以無菌操作挑取1環(huán)菌苔，接入培育液中，在30℃下170r/min培育48h作種子培育液。接種培育，取盛有50mL液體培育基的250mL三角瓶4個，別離編號為CK（空白培育液）、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。用1mL無菌吸管別離準(zhǔn)確吸取種子液加入已編號的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個三角瓶中，于30℃下170r/min振蕩培育。然后別離在培育2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h別離測定其在600nm處的OD值，其中的CK(空白培育液)為對照。數(shù)據(jù)處置，以時(shí)刻為橫坐標(biāo)，OD600

值為縱坐標(biāo)，繪制短短芽孢桿菌JK-2的生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：短短芽孢桿菌JK-2的延遲期在1-6h、指數(shù)期在6-16h、穩(wěn)按期16-26h和衰亡期26h以后。這說明咱們接種到發(fā)酵液的最好時(shí)刻應(yīng)在其生長的指數(shù)期即在24h左右，發(fā)酵的時(shí)刻在26h左右為最正確，因?yàn)榈鹊搅怂ネ銎?，?xì)菌死亡，菌體破裂，給胞外物質(zhì)分析帶來困難?？墒堑搅朔€(wěn)按期，在24h時(shí)，其培育液的OD值不知為何又稍有升高。時(shí)間OD值ⅠOD值ⅡOD值Ⅲ平均值246810121416182022242628303234361.2.2菌株生物學(xué)特性生長曲線測定：將Bs-8093菌株接種到PBMY培育基中，于30℃、下培育，接種的前36h，每4h測定一次600nm下的OD值，36h后每12h測定一次，每處置重復(fù)3次。溫度對生長的阻礙：將Bs-8093菌株接種到PBMY培育液中，置于1五、20、2五、30、3五、40、45和50℃的恒溫箱培育，48h后在600nm下測其OD值，每處置重復(fù)3次。碳、氮源利用：在基礎(chǔ)培育基中別離加入蔗糖、乳糖、棉子糖、腺嘌呤、甘氨酸、亞油酸、蘋果酸作為碳源，以不加碳源的為對照，在基礎(chǔ)培育基中加入胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、氯化銨、硝酸銨、尿素作為氮源，以不加氮源為對照，每處置重復(fù)3次。培育基分裝于試管內(nèi)，接種Bs-8093菌株于30℃的搖床（110r·min圖4培養(yǎng)時(shí)間對Bs-8093菌株生長的影響Fig4InfluenceofculturaltimeonthegrowthofstrainBs-8093二、阻礙芽孢桿菌生長因素2.1.6溫度對Bs-8093菌株生長的阻礙溫度對Bs-8093菌株生長阻礙較大，該菌株在15-45℃范圍內(nèi)都能生長，在50℃不能生長，最適宜生長溫度范圍為30圖5培養(yǎng)溫度對Bs-8093菌株生長的影響FigInfluenceofculturaltemperatureonthegrowthofstrainBs-8093三、芽孢桿菌培育特性一、概述研究以防治番茄枯萎病的芽孢桿菌生防菌短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)為研究對象，番茄枯萎病是由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf．sp．radicislyeopersici)引發(fā)的嚴(yán)峻危害番茄生產(chǎn)的一種土傳病害，番茄整個生育期都可受到該病害的侵染。目前對該病的防治尚缺乏有效的手腕，還未有長期穩(wěn)固的抗病品種及經(jīng)濟(jì)有效的化學(xué)防治藥劑。生物防治成了該病理想的防治途徑之一，在國內(nèi)外已有利用非致病尖孢鐮刀菌[1]、拮抗細(xì)菌[2]及二者相聯(lián)合[3]防治番茄枯萎病的報(bào)導(dǎo)。本研究室在前期的研究進(jìn)程中，已從枯萎病發(fā)生田塊健株根際分離取得的一株具有拮抗作用的生防細(xì)菌，經(jīng)鑒定為短短芽孢桿菌。該菌對番茄枯萎病菌的盆栽防效和田間防效別離為％、％。能抑制枯萎病菌菌絲的生長，可造成菌絲消解、產(chǎn)生泡狀物、破壞生長點(diǎn)、引發(fā)細(xì)胞內(nèi)含物外溢[4]。并從發(fā)酵液中分離出分子量約為kDa的活性肽和胞外多糖兩種抑菌物質(zhì)[5]。抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生不僅與菌株本身的特性有關(guān)，也與其所處的環(huán)境條件有關(guān)，因此菌株的發(fā)酵技術(shù)成為關(guān)鍵，而培育基的營養(yǎng)配方不僅阻礙菌體的生長，同時(shí)阻礙抑菌物質(zhì)的生成。菌體生長的最正確條件不必然是抑菌物質(zhì)生成的最好條件。已有的研究說明，短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)的一些菌株對植物與動物具有廣譜抗菌活性，是一種潛在生物操縱劑。在植物的防病方面，能以活體形式借居到灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)及終極腐霉(Pythiumultimum)中，而且能夠通過度泌抗菌代謝物短桿菌肽S(gramicidinS)和產(chǎn)生表面活性張力抑制真菌或細(xì)菌的生長[6]，該菌對白菜灰霉病和白粉病[7]；煙草青枯病具有較好的防效[8]；在動物的防病方面，也能以活體的形式或產(chǎn)生抗菌物質(zhì)對金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、鼠傷寒沙門氏(Samlonellatyhimurium)、黑胸?cái)⊙?Bacillussp．)、雞白痢沙門氏菌(S.pullorum)等多種動物病原細(xì)菌具有較強(qiáng)拮抗作用，而且抗菌物質(zhì)水溶性強(qiáng)，耐高溫，對酸、堿穩(wěn)固[9]。另外，它仍是一種微生物采油菌，能降解原油烴，提高原油采收率[10]。鑒于短短芽孢桿菌JK-2菌株對番茄枯萎病的良好防效及短短芽孢桿菌的不同菌株的成功防病例子，咱們在兼顧菌株的生長量和抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生量兩項(xiàng)指標(biāo)基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)和單因數(shù)實(shí)驗(yàn)方式對短短芽孢桿菌JK-2培育基組分進(jìn)行了優(yōu)化，旨在確信該菌株抑菌活性最正確時(shí)的搖瓶培育的方案，并為生產(chǎn)發(fā)酵提供參考。二、研究方式供試菌株，生防菌為短短芽孢桿菌JK-2菌株（Brevibacillusbrevis），活性指示菌為番茄枯萎菌ZJUF20031菌株由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所章初龍教師惠贈。培育基設(shè)計(jì)，碳氮營養(yǎng)成份配比：采納正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇酵母粉、蛋白胨、蔗糖、牛肉浸膏、可溶性淀粉5個培育基組分因素，每一個因素設(shè)定3個水平，同時(shí)考慮蛋白胨和牛肉浸膏、蔗糖和可溶性淀粉的彼此作用。采納L18（37）正交表[11]，隨機(jī)安排因素和配比水平（表1，表3）。搖瓶培育：按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表別離配置培育基，左右。表1L18（37）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表水平因素（%）ABCDE123注：A.蛋白胨；B.牛肉浸膏；C.蔗糖；D.可溶性淀粉；E.酵母粉礦物營養(yǎng)成份配比：在上述挑選取得的基礎(chǔ)培育基（含不同配比的蛋白胨、牛肉浸膏、蔗糖、可溶性淀粉、酵母粉等5種營養(yǎng)成份）中加入含CaCl2、MgSO4、K2HPO4、NaCl等不同質(zhì)量組合的無機(jī)鹽（表2），高壓滅菌后備用。表2無機(jī)鹽的不同配比組合水平因素（%）K2HPO4NaClCaCl2MgSO410000200030004000500060070080090010011短短芽孢桿菌JK-2菌株對碳氮源的營養(yǎng)需求，將活化培育好的短短芽孢桿菌JK-2菌株調(diào)成1×107cfu/ml濃度的孢子懸浮液，別離吸到盛有25ml不同碳源營養(yǎng)成份配比的液體發(fā)酵培育基（按1.2.1中方式配制）中，于30℃，170r/min振蕩培育48h。活性指示菌番茄枯萎菌用PDB培育基培育3d后，配成濃度為1×107cfu/ml的孢子懸浮液，吸1ml到熔化并冷卻到45℃左右的6mlPDA培育基（瓊脂含量為%）中，混勻，傾覆在已凝固的PDA平板上。待上層培育基冷卻凝固后，在平板上打孔（直徑為6mm），每孔加待測液40μl，處置后的平板置于短短芽孢桿菌JK-2菌株對礦物質(zhì)的營養(yǎng)需求，別離吸上述JK-2菌株的孢子懸浮液到盛有25ml含基礎(chǔ)培育基和不同礦物質(zhì)營養(yǎng)成份配比的液體發(fā)酵培育基（按1.2.2中方式配制）中，于30℃，170r/min振蕩培育48h?；钚灾甘揪芽菸逆咦討腋∫褐苽浜鸵志Φ膶?shí)驗(yàn)方式參照方式。研究不同礦物質(zhì)營養(yǎng)成份培育的短短芽孢桿菌JK-2菌株對番茄枯萎菌的抑菌能力，結(jié)合基礎(chǔ)培育基挑選出該菌株發(fā)揮最好抑菌成效的培育基。數(shù)據(jù)處置，采納DPS軟件[12]3、短短芽孢桿菌JK-2菌株對碳氮源的營養(yǎng)需求從表3和表4的方差分析能夠看出，牛肉浸膏、酵母粉、蔗糖對短短芽孢桿菌JK-2菌株發(fā)酵液的抑菌活性有顯著阻礙。蛋白胨和牛肉浸膏、蔗糖和可溶性淀粉的交互作用對其抑菌活性的阻礙不明顯。而蛋白胨、可溶性淀粉對發(fā)酵液抑菌活性的阻礙比較弱。蔗糖是培育基中的要緊碳源，蔗糖含量增大，發(fā)酵液抑菌活性也隨之提高。可溶性淀粉作為另外一種碳源，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為%時(shí)，抑菌圈平均值為11.933mm，優(yōu)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%和1%時(shí)。說明淀粉對發(fā)酵液抑菌活性有必然阻礙，但含量比例需嚴(yán)格操縱。蛋白胨和牛肉浸膏的交互作用、蔗糖和可溶性淀粉的交互作用均不顯著。別離說明二者是在獨(dú)立起作用，不能彼此替代。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果和上述分析中能夠看出，高抑菌活性培育基的最正確配方為10號，其組分編號為A1B1C3D1E1，即蛋白胨%、牛肉浸膏%、蔗糖%、可溶性淀粉%、酵母粉%。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)將菌體數(shù)作為參考指標(biāo)來考慮。從表3能夠看出菌體數(shù)與發(fā)酵液的抑菌活性并非呈正相關(guān)。比如抑菌活性最強(qiáng)的10號培育基，其菌體數(shù)只達(dá)到×108cfu/ml。從菌株的生長量和抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生量兩項(xiàng)指標(biāo)來綜合考慮，1號培育基為最正確配方，其組分編號為A1B1C1D1E表3L18（37）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果ABA×BCDC×DE抑菌圈（m