現(xiàn)代生物技術-02植物基因工程

第三章1植物基因工程概況：1、植物的遺傳學特性2、植物轉基因的克隆與分離3、植物轉基因研究常用的基因類型4、植物基因轉移的載體：病毒和質粒5、培養(yǎng)轉基因植物的方法6、利用轉基因技術研究基因的表達與調控7、利用轉基因植物生產(chǎn)外源蛋白8、轉基因植物的研究成果與安全性評價

兩個封面的故事1）今年4月中國科學家完成了全世界第一張秈稻基因組草圖。2）11月份，中國科學家又宣布完成水稻基因組第4號染色體的精確測序。這兩項重大成果，吸引國際頂尖學術雜志《科學》和《自然》均用上封面及“主打敘述”的形式予以強勢報導。里程杯的誕生1）中國早在1992年，啟動了中國秈稻為水稻基因組研究品種；2）1996年率先在世界上完成水稻基因組物理圖；3）1998年承擔第4號染色體精確測序任務（國際水稻基因組計化）；4）2002年4月，完成世界第一張秈稻全基因組框架序列圖；5）11月完成98年承擔任務。系列成果1.測定3500萬個堿基對，覆蓋第4號染色體98％區(qū)域，精確率高達99.99％；2.鑒定出4658個基因，并注釋在染色體準確位置上；3.首次完整測定出決定高等植物乃至高等生物染色體穩(wěn)定性的著絲粒序列，為研究其功能提供結構基礎；4.發(fā)現(xiàn)并鑒定了一些重復序列在染色體上的特異分布規(guī)律以及與基因的位置關系；5.鑒定了4號染色體上基因簇分布，預測了基因之間潛在的協(xié)同關系；6.與秈稻廣陸矮四號染色體230萬個DNA堿基對進行了相應序列的同源比較，報道了水稻2個主要亞種間基因組成、順序及DNA序列水平異同，發(fā)現(xiàn)秈稻基因組大于梗米可能從秈稻中進化而來?？萍疾繘Q定整合精兵投資兩億元我國水稻研究整體水平已達國際領先，國家科技部決定，將水稻功能基因組研究作為“十五”科研前沿項目，投資2億元，整合全國優(yōu)勢兵力，重點開展水稻功能基因組研究，全力在水稻遺傳密碼破解上獲取更多自主知識產(chǎn)權?？挂腋位蚍咽炝?）只要一年吃上幾個含有抗乙肝基因的西紅柿就能代替乙肝疫苗，水果疫苗有望兩年后上市；2）制定一套轉基因食品生產(chǎn)流程；3）首批培育“疫苗番茄”分別用于乙肝和輔助治療高血壓、血友病及骨質疏松癥；4）安全性：無選擇標記；目的基因都是商品化的；完全隔絕，無其他物種不利基因的漂移；無環(huán)境污染，要通過中試，環(huán)境釋放，生產(chǎn)試驗，生產(chǎn)證書申報。問題：1、表達水平1％要吃多少/天？2、外源的疫苗蛋白經(jīng)過消化、水解，如何保持疫苗活性？

植物的遺傳學特征1、具有自我受精的遺傳特性；2、基因的突變或重組、缺失，遺傳后果易于觀察到；3、植物受到機械損傷后，易在傷口處長出愈傷組織的軟組織；4、植物細胞以纖維素組成細胞壁，通常不能直接吸收外源DNA，用纖維素酶處理植物細胞，制備原生質體即可吸收外源DNA分子；5、植物染色體以多倍體形式存在，并導致體細胞變異頻率高。植物基因工程的主要內容1、從種類繁多的植物群體中分離有用的目的基因；2、尋找或構建有價值的克隆載體；3、將重組載體通過體外轉化等方法導入植物受體細胞，并整合到寄宿染色體基因組上；4、使獲得帶有外源基因的重組載體DNA的植物細胞或組織，再生成形態(tài)正常的健康能育的植株；5、通過植物的有性過程，將良好的外源基因持續(xù)傳遞給后代。第二節(jié)植物基因的克隆與分離一、根據(jù)基因的功能分離目的基因二、根據(jù)mRNA特異性分離目的基因三、根據(jù)DNA的插入作用分離目的基因

1）DNA標簽法：人為的給目的基因加上一段已知的序列標簽。等于DNA分子探針；

2）T－DNA標簽法：

它是高等植物中一種非常有效的插入誘變劑和基因的標簽。第三節(jié)植物基因工程研究常見的基因1、選擇標記基因2、報告基因3、抗蟲抗病基因4、非生物脅迫抗性基因5、產(chǎn)物質量修飾基因6、其他性狀基因第四節(jié)植物基因轉移的載體一、病毒載體1）單鏈RNA病毒2）雙鏈DNA植物病毒3）單鏈的DNA病毒二、質粒載體1）病源土壤桿菌2）植物冠嬰病的誘發(fā)與細胞突增3）Ti質粒的一次遺傳特性4）T-DNA的結構與功能5）應用Ti質粒載體轉移外源基因與生產(chǎn)轉移基因植物病毒載體的優(yōu)點1）植物病毒對宿體的感染是系列的，它能將基因組擴散到被感染植株的所有細胞；2）可以解決象玉米這樣單子葉植物的外源基因的導入問題；3）重組病毒利用植物來生產(chǎn)大量外源蛋白。病毒載體1）單鏈RNA病毒：90％具有感染力的正鏈RNA（mRNA)；2）雙鏈DNA病毒：花椰菜花病毒組是唯一的一群以雙鏈DNA作為遺傳物質的病毒，寄主范圍狹窄；3）單鏈DNA病毒：在同一個蛋白質外殼內存在兩條各長2.5Kb的單鏈DNA,單鏈A編碼病毒外殼蛋白與復制有關的蛋白質，單鏈B則編碼控制病毒從一個細胞轉移到另一個細胞的運動蛋白。二、質粒載體1）病源土壤桿菌2）植物冠嬰病的誘發(fā)與細胞突增3）Ti質粒的一次遺傳特性4）T-DNA的結構與功能5）應用Ti質粒載體轉移外源基因與生產(chǎn)轉移基因植物2、冠嬰瘤細胞的特性1）具有異常的失控生長能力，組織培養(yǎng)的冠嬰細胞在無補加的植物激素下，也能生長良好；2）它的細胞壁長有若干特異性抗體位點，細胞壁上果膠部分的甲基化程度比正常細胞高得多；3）冠嬰組織嫁接到健康植株上能形成新的冠嬰腫瘤。Ti質粒的遺傳特征三種誘發(fā)冠嬰瘤的遺傳成分：1）T-DNA：是一種移位單元，是基因組中被轉移并整合到染色體上的特定DNA片斷。2）Vir基因：編碼反式作用蛋白質，是植物細胞轉化的必要因子。3）間接參與植物轉化的基因，其表達產(chǎn)物功能是使細菌結合到感染細胞的創(chuàng)傷部位。Ti質粒的遺傳功能

1、為根瘤土壤桿菌提供附著與植物細胞壁的能力；2、參與寄主細胞制造植物激素（生長素和分裂素）的能力；3、決定所誘導的腫瘤的形態(tài)特征和冠嬰堿成分；4、賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠嬰堿化合物的能力；5、賦予寄主菌株對土壤桿菌所產(chǎn)生的細菌素的反應性；6、決定宿主菌株的植物寄主范圍；7、具有對噬菌體的排外性，抑制噬菌體的生長與發(fā)育。T－DNA的結構與功能結構：存在于植物細胞核中，占Ti質粒DNA的10％，控制三套基因：tms、tmr、tmt。功能：1）隨機整合在植物基因組不同位點上；2）整合胭脂堿T－DNA分子，簡單、以單一片段形式存在；3）整合章魚堿T－DNA分子，復雜、分開兩片段形式存在。Ti質粒載體的應用1）將目的基因DNA與Ti質粒構建重組的質粒分子；2）將重組載體分子轉化大腸桿菌；3）通過細菌結合作用使外源DNA的iV重組質粒從大腸桿菌轉移到根瘤土壤桿菌，外源DNA從iV轉到Ti質粒上；4）將根瘤土壤桿菌接種至植物傷口部位，或用原生質體共培養(yǎng)方法轉化植物細胞；5）經(jīng)過愈傷組織或原生質體培養(yǎng)，再生出轉基因植第五節(jié)培育轉基因植物的實驗方法1、Ti載體的改造與構建2、根瘤土壤桿菌轉化3、植物細胞的轉化1）根瘤土壤桿菌介導的植物細胞轉化2）生物彈擊法3）化學刺激法4）電穿孔法5）顯微注射法6）脂質體法4、轉基因植株的再生

8、轉基因植物的安全性評價從20世紀70年代重組DNA技術創(chuàng)建到1983年第一株轉基因煙草獲得以來，國際上對轉基因作物就存在著截然不同的觀點。有人認為轉基因作物造福于人類，有人認為轉基因作物可能給人類帶來環(huán)境、健康與生態(tài)的危險?；蚬こ碳夹g在整個世界引起極大的關注與爭議，并且隨著轉基因作物的成功獲得、商品化、負面現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)等，甚至有完全拒絕轉基因食品進入市場的舉措.有關事件:

①紐約大學研究人員發(fā)現(xiàn)，在室內種植的轉基因B2玉米植株中的殺蟲毒素可以滲入到土壤中，在玉米根系周圍土壤提取物中仍含有Bt毒素，可以殺死幼蟲，其活性可持續(xù)25天。研究人員認為此毒素普遍地影響土壤生態(tài)學。(1999年)②孟山都公司培育的抗蟲轉基因棉花在1996年進行大規(guī)模種植，部分地區(qū)出現(xiàn)大量存活的棉鈴蟲，導致棉花不同程度地受害，需要追噴殺蟲劑。③孟山都公司開發(fā)的抗除草劑草甘膦轉基因棉花于1997年大規(guī)模種植，棉花主產(chǎn)區(qū)Detta收獲的棉花多大量落鈴或棉桃畸形。④世界上第一個商品化生產(chǎn)的轉基因煙草由于銷路問題已停止推廣。⑤1994年美國第一個批準商品化的延遲成熟期的轉基因番茄也因種種原因停止了生產(chǎn)。⑥蘇格蘭P—owett研究所用轉凝集素基因的馬鈴薯喂飼大鼠，在電視上宣傳大鼠食用后引起器官生長異常，體重和器官重量減輕，破壞免疫系統(tǒng)，引起國際轟動。(1998年)⑦印度于1998年11月焚燒了美國孟山都公司的兩塊實驗地，反對該公司的“終止技術”，即轉基因作物雄性不育，農(nóng)民不能自己留種。這實際上涉及到的是壟斷問題。⑧種植抗蟲轉基因玉米的地區(qū)(1999年)，發(fā)現(xiàn)馬利筋峽蝶大量減少，是蛺蝶因吮食花粉過度而死。⑨丹麥國立利索研究所把耐除草劑的轉基因油菜籽和雜草一起培育，產(chǎn)生耐除草劑的雜草，轉基因技術產(chǎn)生的基因可擴散到自然界中去。(1996年)⑩歐盟國家決定，在新的法規(guī)制定出來之前，暫停轉基因農(nóng)作物的種植和流通。(2000年)⑾大豆生產(chǎn)大國巴西也宣布，暫時停止生產(chǎn)轉基因大豆。(2001年)⑿日本政府有關部門將重新研究和制定針對轉基因農(nóng)作物的新的安全評估標準和項目。(2000年)⒀綠色和平組織成員阻止裝載著6萬t轉基因大豆的美國貨輪“喬治”號通過運河船閘進入歐洲。轉基因食品被大多數(shù)歐洲人認為是有害人體健康的。(2000年)轉基因植物釋放后可能導致的生態(tài)學潛在風險①轉基因入侵的風險；②轉基因通過與野生親緣種間的基因交流而發(fā)生逃逸的風險群，使遺傳性狀改變，破壞生態(tài)平衡，給農(nóng)作物帶來嚴重威脅；③抗病毒作物產(chǎn)生新病毒的風險；④轉基因植物釋放后對土壤生態(tài)系統(tǒng)及生物地球化學循環(huán)的影響風險；同時魚類與其他動物也會受到不良影響；⑤害蟲對轉B2基因植物的抗性風險，轉基因植物使害蟲體內產(chǎn)生抵御殺蟲劑的抗體，反而增加了害蟲的抗性；⑥轉基因植物產(chǎn)生的殺蟲劑對非目標生物影響的風險，有可能其他小動物或昆蟲也會受到株連而滅絕；⑦轉基因植物商品化后易造成生物污染；即轉基因種子的“絕育”處理，進行生物壟斷，帶來其他作物的不育等。專家意見1999年生物技術領域的一個熱門話題就是關于轉基因制品的安全性。它與現(xiàn)代任何一種技術一樣也具有兩面性，有長亦有短。在發(fā)展轉基因等生物技術時，應揚長避短，趨利避害。人類對轉基因技術還需要做進一步的觀察和深入的研究。專家的意見指出，迄今，轉基因技術對人類來說是利遠遠大于弊，絕不像有些人說的那樣“毀譽參半”。許多科學家對轉基因作物寄予厚望，認為將帶動一場以“分子耕作”為基礎的新型農(nóng)業(yè)革命，為解決全世界的溫飽問題帶來希望.相關報道:

①1999年8月出版的《自然生物技術》雜志刊文批露，德國植物生理學家羅薩·威爾密茲和同事將酵母的蔗糖酶基因移人馬鈴薯，培育出轉基因馬鈴薯新品種，每個塊莖的體積是原有品種的3倍，這項成果顯示了生產(chǎn)大馬鈴薯的潛力。②澳大利亞一生物技術公司運用遺傳工程技術培育出既耐鹽堿又成為優(yōu)質木材的轉基因按樹，可望用于保護農(nóng)村和牧場免受鹽堿化的侵襲。(1996年)③有關專家認為第二次“綠色革命”——“基因革命”已經(jīng)到來。④1999年，世界大約有1400余萬公頃土地(多分布在美國、阿根廷、加拿大等)播種經(jīng)基因改良的商品化作物，包括大豆、玉米、油菜籽、棉花和土豆。(1999年)⑤美國的轉基因基礎研究與產(chǎn)業(yè)化在世界上排第一位。至1999年美國已批準50種轉基因植物產(chǎn)品商業(yè)化，有l(wèi)／4的耕地種植的是轉基因作物。轉基因抗除草劑大豆占美國大豆總面積的55％，抗蟲棉占棉田總面積的近50％，轉基因玉米占玉米總面積的30％。美國市場上已有近4000種食品來自遺傳工程。(1995年)⑥澳大利亞培育出品名為“Moondust”的開淡紫色花的轉基因香石竹，因具有可人的花色和較長的切花插瓶壽命而為花卉市場注入活力。(1999年)⑦英國成功地培育出具有去除木質素基因的白楊，從而在其用于造紙時易漂白而達到節(jié)省漂白劑和減少能耗的目的。⑧轉基因植物所具備的“品質”，是根據(jù)人類的需要而制定的，如高產(chǎn)、優(yōu)質、抗病蟲、耐嚴寒、抗高溫、耐鹽堿、抗倒伏、抗除草劑、提高某些成分的含量等。⑨歐洲專利局辦公室(2001年)已確定兩個有爭論的轉基因植物專利——由AgrEvo公司開發(fā)抗除草劑植物與Monsanto公司開發(fā)的“FlavrSavr”番茄的生效。⑩美國和加拿大的公眾對基因改良食物的接受程度比較高。市場上的一些加工食品如軟飲料、啤酒和早餐麥片等都已含有基因改良作物的成分。⑾德國政府同意經(jīng)濟界在有效監(jiān)督前提下，商業(yè)化種植轉基因作物。強調政府對基因技術研究和安全保障負責任，將基因技術安全性放在重要的地位。為推動轉基因作物研究，德國政府推出“植物生物系統(tǒng)基因分析”計劃，這項計劃可以促使基因技術成果迅速的轉化。(2000年)對一些現(xiàn)象的解釋:關于斑蝶死亡之事:是因為Bt玉米中有一種殺蟲晶體蛋白是具有毒殺鱗翅目害蟲的功能，而斑蝶屬鱗翅目昆蟲，自然會受到該蛋白的影響。轉基因作物對野生生物有利的解釋:是由于抗蟲或抗除草劑基因植物的大量產(chǎn)生，農(nóng)藥與殺蟲劑噴施減少就會對雜草與害蟲達到完全抑制。因為殺蟲劑和化肥大量用于冬麥和油料的種植是過去30年間農(nóng)田鳥類和昆蟲數(shù)量減少的主要原因。安全監(jiān)管，為了保障人類健康，保證后代有一個良好的生態(tài)環(huán)境，對生物技術產(chǎn)品可能存在的潛在危險性，各國根據(jù)國情而制定了“國家生物安全管理的法律、法規(guī)體系”，嚴格立法，使轉基因植物的應用有章可循，有法可依。聯(lián)合國環(huán)境與發(fā)展大會(1992年)簽署的《生物多樣性公約》中就指出：“由生物技術改變的活生物體在使用和釋放時，既要考慮到其可能對環(huán)境產(chǎn)生的不利影響，從而影響到生物多樣性的保護和持續(xù)利用；也要