流式細(xì)胞術(shù)(上)

流式細(xì)胞術(shù)

之

流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)與原理韋俊2013.08技術(shù)專題概念流式細(xì)胞儀(flowcytometer,FCM)是集現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中先進(jìn)的儀器之一。流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry)就是利用利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀的發(fā)展歷史起源:1934年---Moldvan毛細(xì)管細(xì)胞計(jì)數(shù)儀雛形:1947年---Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器1953年---第一臺(tái)流式細(xì)胞分析儀CoulterCounterModelA1974年世界上第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀FACS-I1975年研制出世界上第一臺(tái)帶計(jì)算機(jī)的流式細(xì)胞儀1997年世界上第一臺(tái)單激光四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀

2003年世界上第一臺(tái)單激光五色的流式細(xì)胞儀2009年世界上第一臺(tái)三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀……自1981年，北京師范大學(xué)生物系引進(jìn)中國第一臺(tái)流式細(xì)胞儀（FACSⅢ，BDIS）至今，各種型號(hào)的流式細(xì)胞儀在國內(nèi)安裝使用已超過400臺(tái)廈大分析測(cè)試中心流式細(xì)胞儀Beckman公司EPICSXL分析型流式細(xì)胞儀BD公司FACSVantageSE分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)；實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，最快可達(dá)數(shù)萬個(gè)每秒；可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；定性或定量分析細(xì)胞；分選特定性狀或功能的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)四大模塊：液流系統(tǒng)流動(dòng)室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE光學(xué)系統(tǒng)光源濾片信號(hào)檢測(cè)與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)放大電路光電倍增管PMT分析系統(tǒng)計(jì)算機(jī)

分選系統(tǒng)液流系統(tǒng)流動(dòng)室：儀器核心部件，被測(cè)樣品在此與激光相交。液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（壓力泵）：空氣泵+壓力傳感器流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流體的聚焦高流速適用于定性測(cè)量，樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如DNA分析。光源系統(tǒng)激發(fā)光源：需要良好的單色性和單向性按光源種類：弧光燈和激光器按冷卻方式：空氣冷卻激光器和水冷卻激光器BD公司FACSVantageSE分選型流式細(xì)胞儀：488nm和紫外同時(shí)激發(fā)的CoherentEnterprise水冷激光器；633nm的空冷氦-氖激光器Beckman公司EPICSXL分析型流式細(xì)胞儀：488nm氬離子空冷激光器光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成其主要光學(xué)原件是濾光片，主要分成4類：

長(zhǎng)通濾片(long-passfilter，LP)：允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過；

短通濾片(short-passfilter，SP)：允許短于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過；帶通濾片(band-passfilter，BP)：允許一定帶寬的波長(zhǎng)通過；

二分鏡(dichroicfilter)它們分別將不同波長(zhǎng)的光信號(hào)送入到不同的探測(cè)器。PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234流式細(xì)胞儀的光信號(hào)散射光信號(hào)：散射光分為前向角散射(forwardscatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向角散射(sidescatter,SSC)，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。前向角散射光檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積側(cè)向角散射光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性前向散射光（FSC）FALSSensorLaser前向散射光（FSC）側(cè)向散射光（SSC）FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光（SSC）熒光信號(hào)熒光檢測(cè)器FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)信號(hào)檢測(cè)與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)當(dāng)攜帶熒光素的細(xì)胞與激光正交時(shí)，受激發(fā)發(fā)出熒光，經(jīng)過濾光片分離不同波長(zhǎng)的光信號(hào)分別到達(dá)不同的光電倍增管(PMT)，PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。電信號(hào)輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。電信號(hào)的放大細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。在細(xì)胞膜表面抗原等的檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時(shí)要相差幾十倍，甚至幾萬倍。如用線性放大器，將無法在一張圖上清晰地將細(xì)胞陽性群、陰性群同時(shí)顯示出來通常使用對(duì)數(shù)放大器。