細菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展

細菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展趙金鎖2016.4.31.熱源分類—按檢查法區(qū)分1：內(nèi)毒素?zé)嵩础锾m氏陰性細菌細胞壁的組分2：非內(nèi)毒素?zé)嵩础齼?nèi)毒素外的熱源2熱源的檢查方法2.1體內(nèi)熱源的檢查方法—兔溫法（PT）.是一種體內(nèi)、全熱源的檢查方法.1942年USP12版第一次收載該法.各國藥典至今仍然使用該發(fā)2.2體外熱源檢查法（IPT）.是一種體外的利用人血細胞反應(yīng)的全熱源原檢查法。.在2000年前，尚未有藥典收載該法，但歐洲藥典在2005年后率先收載該法。.IPT有取代PT的趨勢2.3細菌內(nèi)毒素檢查法（BET）.熱源=內(nèi)毒素？學(xué)術(shù)上的爭論.醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點—控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱源污染3歷史回顧—鱟試劑的發(fā)明與BET的應(yīng)用.1956年，美國科學(xué)家F.Bang發(fā)表論文《鱟的一種細菌性疾病》，闡述了細菌內(nèi)毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象，從而拉開了BET研究與應(yīng)用的帷幕。

4.BET技術(shù)與應(yīng)用的發(fā)展趨勢與特點4.1BET取代PT成為必然的趨勢.1980年USP收載BET法，但未規(guī)定任何品種應(yīng)用，1999年USP版規(guī)定670種藥品作BET項，僅約20種藥品保留PT項。.1993年CP1990版增補本收載BET法，同樣未涉及任何品種使用，CP2000年版有近70個品種規(guī)定作BET項。CP2005年版有超過150種藥品規(guī)定作BET項。.其它國家藥典對藥品的BET項，同樣經(jīng)歷了從無到有，從少到多的過程。BET取代PT是已成為必然的趨勢。4.2走向統(tǒng)一的BET發(fā)已成為發(fā)展的趨勢.在初期各國頒發(fā)的BET不盡相同，影響藥品的流通。.USP、EP及JP率先統(tǒng)一BET法，于2001年1月1日起實施。.CP2005年版BET法的修訂，基本參照USP、EP及JP的統(tǒng)一BET法。4.BET技術(shù)與應(yīng)用的發(fā)展趨勢與特點4.3BET技術(shù)及應(yīng)用的發(fā)展特點4.3.1BET方法學(xué)呈多樣化.凝膠法—最經(jīng)典的方法.光度法（濁度法和顯色基質(zhì)法）4.3.2BET方法的選擇.供試品檢測時可以選擇任何一種方法進行試驗.當(dāng)兩種測試結(jié)果有爭議的時候，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。.試驗用BET水及器皿的要求：凝膠法，BET水內(nèi)毒素應(yīng)小于0.015EU/Mml，光度法，BET水內(nèi)毒素應(yīng)小于0.005EU/ml。所用器皿應(yīng)用干熱滅菌法（250℃，不少于0.5h）去除熱源，若使用塑料器械，應(yīng)選用無內(nèi)毒素及對試驗無干擾的器械。

4.BET技術(shù)與應(yīng)用的發(fā)展趨勢與特點4.4BET方法趨向自動化.凝膠法BET—在自動化方面沒有新的發(fā)展—孵育設(shè)備方面，干式恒溫器逐漸取代恒溫水浴槽.定量法BET—試管式定量檢測儀（32-108孔），如Ati-320動態(tài)試管儀—酶標(biāo)板式定量檢測儀（96-384孔）—單波長/多波長/可變波長測定儀（300-1000nm）—專用數(shù)據(jù)處理軟件5凝膠法實驗技術(shù)5.1實驗準(zhǔn)備5.1.1凝膠法的實驗程序a：試驗準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具等b：確定藥品的細菌內(nèi)毒限值（L)c：選擇鱟試劑的靈敏度（λ）d：計算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最低有效濃度（MVC）e：鱟試劑靈敏度復(fù)核f：干擾實驗的驗證g：供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查5.1.2實驗材料和器具a：儀器設(shè)備：37℃恒溫水浴或適宜的恒溫器b：器具：要除熱源處理c：試劑：鱟試劑具有國家生產(chǎn)許可證。5凝膠法實驗技術(shù)5.2鱟試劑的靈敏度復(fù)核試驗5.2.1過程：根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品用BET水溶解，在漩渦混合器上混合15min，然后稀釋制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ的4個濃度的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，注意，每稀釋一次要在漩渦混合器上混合30s，取鱟試劑18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液平行做4管，另2管加入BET水作為陰性對照，封閉管口，垂直放入37℃±1℃恒溫器中，保溫60min±2min。5.2.2陽陰性判斷：試驗結(jié)束后，將試管輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180度，若管內(nèi)形成凝膠且不變形不從管內(nèi)滑脫者為陽性。未形成凝膠或者形成凝膠不結(jié)實、變形并從管內(nèi)滑脫者為陰性。注意，操作過程要輕拿輕放，避免因震動造成的假陰性結(jié)果。5.2.3結(jié)果判斷：當(dāng)最大濃度管（2λ）為陽性，最小濃度管（0.25λ）為陰性，陰性對照管為陰性，該試驗有效。計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc），當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ時方可進行細菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。5凝膠法實驗技術(shù)5.3供試品的干擾試驗5.3.1目的：判斷某種檢品在某種濃度下下是否適合作細菌內(nèi)毒素檢查。5.3.2原理：比較鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)在水溶液中進行和在檢品溶液中進行的差異，也就是比較反應(yīng)在不同介質(zhì)中進行反應(yīng)的差異，無差異即無干擾，有差異即有干擾。若沒有干擾，該濃度下可以進行日常檢查，若有干擾，則必須排除干擾后才能進行日常檢查。5.3.3何種情況下需要做干擾試驗？.新品種建立方法.鱟試劑的來源改變.鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變.供試品的來源改變.供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變.試驗環(huán)境中發(fā)生了其它任何有可能影響試驗結(jié)果的變化。5凝膠法實驗技術(shù)5.3供試品的干擾試驗5.3.4干擾試驗的程序與方法

按下表制備溶液A,B,C,和D，供試品溶液的溶度為不得超過MVD的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下進行。編號細菌內(nèi)毒素/被加入內(nèi)毒素溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度管數(shù)A無/供試品溶液———2B2λ/供試品溶液供試品溶液12482λλ0.5λ0.25λ4444C2λ/BET水BET水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無/BET水———25凝膠法實驗技術(shù)5.3供試品的干擾試驗5.3.4程序和方法（接上）

上表中A為供試品溶液，B為干擾試驗系列，C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列，D為陰性對照

只有當(dāng)A和D為所有平行管為陰性，C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)，試驗方為有效。計算C和B反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。Es=antilg（∑Xs/4）Et=antilg（∑Xt/4）

上式中Xs和Xt分別是系列溶液C和系列溶液B反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）

當(dāng)Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es之間時，認為供試品在該濃度下無干擾。5凝膠法實驗技術(shù)5.4凝膠法試驗技術(shù)檢查法5.4.1凝膠限度試驗

按下表制備溶液A,B,C,D，使用稀釋倍數(shù)為MVD并以排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B，按鱟試劑靈敏度復(fù)核項下操作。

注A為供試品溶液，B為含供試品的陽性對照，C為陽性對照，D為陰性對照。編號內(nèi)毒素的濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/BET水2D無/BET水25凝膠法實驗技術(shù)5.4.1凝膠法限度試驗結(jié)果判斷：保溫60min后觀察結(jié)果：若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，陽性對照C的平行管均為陽性，含供試品陽性對照B的平行管均為陽性，試驗有效。A平信管數(shù)均為陰性，結(jié)果判斷為符合規(guī)定，若A均為陽性，判斷供試品為不符合規(guī)定，若A一管為陽性一管為陰性，需進行復(fù)測，復(fù)測時A需要平行4管，若4管均為陰性，判定符合規(guī)定，否則，判定不符合規(guī)定。5.4.2凝膠半定量試驗：參照藥典。6光度法測定6.1廣度測定法的分類a：濁度法：終點濁度法動態(tài)濁度法b：顯色基質(zhì)法：終點顯色法和動態(tài)顯色法6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗證

方法：用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制成系列溶液，制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度稀釋倍數(shù)不得大于10倍，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限），每稀釋一步的混勻時間和凝膠法一樣，每一濃度至少做3支平行管，同時做2支陰性對照。當(dāng)陰性對照的反應(yīng)時間大于系列濃度中最低濃度的反應(yīng)時間，將全部數(shù)據(jù)進行線性回歸，當(dāng)線性回歸系數(shù)R大于0.98時，該試驗有效。6.3干擾試驗

選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點或靠近中點的內(nèi)毒素濃度（λm）作為干擾試驗中添加的內(nèi)毒素濃度，按下表制備溶液A、B、C和D。光度法干擾試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液至少2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點濃度供試品溶液至少2C至少3個濃度（最低一點設(shè)定為λ）BET水每一濃度至少2D無BET水至少2A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液B為標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點或靠近中點的一個已知濃度內(nèi)毒素的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C為可靠性試驗項下描述的用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。D為陰性對照計算方法：按回歸方程計算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，計算回收率（R）：R=（Cs-Ct）/λm×100%

當(dāng)內(nèi)毒素的回收率早50%～200%之間，認為該實驗室條件下供試品溶液不存在干擾。6.4檢查法

按光度測定法的干擾試驗操作步驟進行檢測，使用系列溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液A的每個平行管的內(nèi)毒素濃度。(1：要符合可靠性試驗，2：無干擾，3：溶液D反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間）結(jié)果判斷：供試品所有平行管的內(nèi)毒素濃度乘以稀釋濃度后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判斷為符合規(guī)定。大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判斷為不符合規(guī)定。7舉例說明7.1凝膠法測定頭孢唑肟鈉的細菌內(nèi)毒素（≤0.1EU/mg）

假設(shè)鱟試劑的靈敏度0.25EU/ml，則計算MVC=0.25/0.1=2.5mg/ml

首先驗證并確定2.5mg/ml濃度下無干擾，進行一下試驗。按照鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。

編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/BET水2D無/BET水2

7動態(tài)濁度法舉例說明7.2動態(tài)濁度法7.2.1實驗用器具：

反應(yīng)試管：8×75mm硼硅酸玻璃試管

稀釋試管：大口徑硼硅酸玻璃試管

移液器具

其他：酒精燈、鑷子、砂輪片，標(biāo)記筆或紙，計時器。

注意：所有與試劑或供試品接觸的器具必須經(jīng)除熱源處理。7.2.2實驗用儀器

電熱烘箱，漩渦混合器，動態(tài)試管儀7.2.3供試品：

復(fù)方氨基酸注射液25g/500ml

內(nèi)毒素限值L≤0.5EU/ml7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗7動態(tài)濁度法舉例說明7.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度的選擇a：至少3個濃度b：相鄰濃度間隔不大于10倍c：所有濃度不超過所用TAL的標(biāo)示檢測范圍。d：本實驗選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為2.0,0.25,0.03EU/ml，即E2，E0.25，E0.037.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1）開啟動態(tài)試管儀預(yù)熱2）制備CSE系列溶液CSE（80EU/瓶）E40E10E2E0.25

E0.03

注意：每進行下一步稀釋前溶液須在漩渦混合器上混合至少30秒。3）打開動態(tài)試管儀工作軟件，進入“數(shù)據(jù)采集”界面，選擇“動態(tài)濁度法”，設(shè)置反應(yīng)時間為60分鐘，點擊“開始采集”2.0ml0.8ml2.4ml0.8ml3.2ml0.5ml3.5ml0.5ml3.5ml4）反應(yīng)項目設(shè)置及加樣（注意：內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液在加樣前須漩渦混合至少1分鐘）項目平行管每反應(yīng)試管加樣量

陰性對照（NC）20.1mlTAL+0.1mlW內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（EU/ml）0.0330.1mlTAL+0.1mlE0.030.2530.1mlTAL+0.1mlE0.252.030.1mlTAL+0.1mlE25)把已加樣的各反應(yīng)試管逐一在漩渦混合器上清點一下，使試管內(nèi)的混合物混勻，然后把試管逐一插入動態(tài)試管儀中，儀器即自動開始數(shù)據(jù)采集。（注意：試管要一次性插到底，插入后不得再觸碰或轉(zhuǎn)動，否則會使該試管的數(shù)據(jù)作廢）6）在軟件的“數(shù)據(jù)采集”界面中填寫相應(yīng)的試驗參數(shù)，如試驗員，實驗試劑，等，也可以在加樣反應(yīng)前填好。7）反應(yīng)結(jié)束后，點擊“數(shù)據(jù)保存”，退出“數(shù)據(jù)采集程序”。7.3.3數(shù)據(jù)分析1）進入軟件的“數(shù)據(jù)分析”程序，調(diào)出貯存的數(shù)據(jù)文件。2）點擊回歸類型“平均回歸”，將顯示出標(biāo)準(zhǔn)曲線的全部數(shù)據(jù)。3）點擊“檢測報告”，將顯示出本實驗的全部數(shù)據(jù)。4）數(shù)據(jù)分析：CR小于10%方為有效。7.4干擾試驗7.4.1供試品：復(fù)方氨基酸注射液7.4.2選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度本實驗選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度為2.0,0.25,0.03EU/ml（E2，E0.25，E0.03),檢測靈敏度λ=0.03EU/ml（E0.03），標(biāo)示曲線中點濃度λm=0.25EU/ml（E0.25），7.4.3計算MVDMVD=L/λ=0.5/0.03=16（倍）

一般來講，只需要選擇一個稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品濃度作干擾試驗，但如果不知道什么濃度合適，需要同時對供試品的幾個濃度作干擾試驗，以便找出一個合適的濃度，這就是干擾試驗的初篩試驗。本實驗選擇供試品的2倍（S2），4倍（S4），8倍（S8)稀釋濃度作為干擾初篩試驗。7.4.4實驗需要制備的溶液

編號溶液內(nèi)容及作用A稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液，本試驗為S2，S4，S8B加入λm內(nèi)毒素且與A溶液有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液，在本實驗為S2E2，S4E0.25，S8E0.03（含供試品的陽性對照）C用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素溶液，在本實驗為E2，E0.25，E0.03（陽性對照）DBET水（陰性對照）7.5各溶液的制備：1）開啟動態(tài)試管儀預(yù)熱2）制備C溶液

與7.3.22）制備CES系列溶液相同。