2.生物大分子分離純化技術(shù)2

第二章

生物大分子分離純化技術(shù)12.2.2微過濾

微過濾(microfiltration)是透析技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，它以多孔薄膜為過濾介質(zhì)，讓樣品溶液通過多孔膜(超濾膜)過濾。它可以用于濾除小顆粒，使混濁液澄清，也可以收集純的沉淀供進(jìn)一步分析。21.深層濾器(DepthFilter)：由紙、棉花或玻璃纖維制成。過濾時(shí)將顆粒保留在濾器的深層之內(nèi)，濾器有較大的截面積和相當(dāng)?shù)纳疃?，因而具有較大的容量。這種過濾法具有較快的流速。缺點(diǎn)：濾層的孔徑不一，變化范圍較寬；基質(zhì)具有廣泛的吸附作用，因而造成樣品的損失；基質(zhì)破損碎片往往會(huì)造成樣品的污染。微過濾的類型32.濾膜濾器(ScreenFilter)

濾膜濾器的關(guān)鍵是超濾膜(MicrofiltrationMembrane)，它的孔徑均一，不能通過濾膜的顆粒截留在膜的表面。為了保證一定的流速，必須減壓或加壓。這類濾膜具有疏水性，所以在制造時(shí)常用表面活性劑處理，處理之后還要將表面活性劑清洗干凈，以防止使用時(shí)對(duì)樣品的污染?，F(xiàn)在已有親水性膜產(chǎn)品。微過濾的類型在線式可換膜過濾器正壓桶式濾器針式樣品過濾器濾膜4微過濾技術(shù)的應(yīng)用

(1)溶液的澄清。生物樣品溶液或細(xì)胞溶液常常由于低溶解度或變性而混濁，在用分光光度或熒光法測定時(shí)需要進(jìn)行過濾，以加大溶液的透光性能。通過這種過濾方法也可用于濾除有些溶液中可能存在的細(xì)菌或微生物污染物。

(2)生化分析中常需要收集微量的沉淀物．對(duì)于放射性沉淀物的收集超濾膜過濾法非常理想。

(3)細(xì)菌細(xì)胞的收集。雖然一般用離心法收集細(xì)胞，但若用超過濾法收集，則效率可提高近十倍。5除了上述幾方面的用途之外，微過濾技術(shù)用于蛋白質(zhì)的濃縮也非常有效，只不過在過濾過程中需要進(jìn)行攪拌，以阻止膜的堵塞而影響流速。這類濾膜對(duì)蛋白質(zhì)及核酸類生物大分子也具有一定的吸附作用。62.2.3鹽析法

隨著鹽濃度不斷增加，蛋白質(zhì)的溶解度不斷降低而沉淀析出，這稱之為鹽析(SaltingOut)。鹽析作用是鹽類使蛋白質(zhì)脫去水化膜，同時(shí)壓縮蛋白質(zhì)分子周圍的雙電層，致使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。由于在合適的鹽濃度下不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，所以分離幾種蛋白質(zhì)的混合溶液時(shí)，鹽的飽和度由低向高逐漸增大。7鹽析實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意的問題

1．鹽類的選擇鹽析時(shí)常用中性鹽類，要求：不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，溶解度大，同時(shí)．溶解度受溫度的影響小。最常用的是硫酸銨。

2．鹽的飽和度

3．溫度濃鹽對(duì)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用，一般鹽析操作可以在室溫下進(jìn)行，但有些對(duì)熱敏感的蛋白質(zhì)宜在低溫下進(jìn)行。

4.pH鹽析時(shí)常選擇在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行。

5．蛋白質(zhì)濃度在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易發(fā)生沉淀，但濃度過高時(shí)容易使其它雜蛋白共沉淀。因此．必須根據(jù)具體情況選擇蛋白質(zhì)溶液的濃度。8脫鹽用鹽祈法分離純化蛋白質(zhì)后，常需要脫鹽才能獲得純品，脫鹽常用透析法或凝膠過濾法。92.2.4冷凍干燥

冷凍干燥(LyophilizationFreeze-drying)又稱升華干燥，是在低溫、負(fù)壓下進(jìn)行干燥的方法。主要用于除去冷凍樣品中的水分或其它溶劑，這是濃縮和干燥熱敏性樣品(如抗體)的有效方法之一。將溶液樣品通過冷凍干燥變成固體樣品不僅可以使樣品穩(wěn)定而有利于長期保存，也有利于樣品的運(yùn)輸。10冷凍干燥機(jī)11

需要注意的是：一般只有水溶液才能進(jìn)行這樣的處理。有機(jī)溶劑體系在冷凍干燥過程中有可能使生物大分子發(fā)生變性。同時(shí)，蒸發(fā)出來的有機(jī)溶劑進(jìn)入真空泵，會(huì)污染或損壞真空泵。目前已經(jīng)有商品化的抗有機(jī)溶劑及耐腐蝕的冷凍干燥器。122.2.5離心離心(Centrifugation)是蛋白質(zhì)、酶、核酸及細(xì)胞亞組分分離的最常用的方法之一，也是生化實(shí)驗(yàn)室中常用的分離、純化或澄清的方法。尤其是超速冷凍離心已經(jīng)成為研究生物大分子實(shí)驗(yàn)室中的常用技術(shù)方法?；驹韺悠贩湃腚x心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi)，離心機(jī)驅(qū)動(dòng)時(shí)，樣品液就隨離心管做勻速圓周運(yùn)動(dòng)，于是就產(chǎn)生了一個(gè)向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場中沉降的速度也就不相同，由此便可以得到相互間的分離。131．離心力和相對(duì)離心力溶液中的固相顆粒做圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生一個(gè)外向離心力，其定義為F=m2r

式中F為離心力的強(qiáng)度；m為沉降顆粒的有效質(zhì)量；為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)的角速度，其單位為rad/s；r為離心半徑(cm)，即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。14目的離心力通常以相對(duì)離心力RCF(RelativeCentrifugalForce)表示．即離心力F的大小相對(duì)于地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計(jì)算公式如下：RCF=(1.11910-5)(rpm)2?r

可以看出：在同一轉(zhuǎn)速下，由于r的不同，RCF相差會(huì)很大，實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般取平均值。在離心實(shí)驗(yàn)的報(bào)告中，rpm(或RCF)、r平均、離心時(shí)間t和液相介質(zhì)等條件都應(yīng)表示出來，因?yàn)樗鼈兌寂c樣品的沉降速度有直接的聯(lián)系15為了建立分子大小與沉降系數(shù)之間的關(guān)系，引入了沉降系數(shù)(SedimentationCoefficient)這一新的概念。沉降系數(shù)定義為沉降速度與離心力的比率或單位離心場中顆粒的沉降速度，它以Svedberg單位計(jì)算，1S＝1×10－13s。近年來，在生物化學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程等書刊文獻(xiàn)中，對(duì)于某些大分子化合物，當(dāng)它們的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和分子量不很清楚時(shí)，常常用沉降系數(shù)這個(gè)概念去描述它們的大小。如核糖體RNA(rRNA)有30S亞基和50S亞基，這里的S就是沉降系數(shù)，現(xiàn)在更多地用于生物大分子的分類，特別是核酸。16差示離心法要想實(shí)現(xiàn)組分間的分離，必須在所需樣品沉降之后停止離心過程。沉積的樣品再懸浮到新的溶劑中，并以較低的速度離心使大顆粒的污染物沉降，而被純化的樣品留在溶液中，經(jīng)過反復(fù)多次地離心才能得到純的樣品，這種方法就叫差示沉降離心法(Differentialcentrifugation)，它對(duì)細(xì)胞組分間的分離非常有用。密度梯度離心在離心前離心管中溶液的密度不同(從上到下密度增大)，梯度介質(zhì)中最大密度應(yīng)小于樣品物質(zhì)的最小密度，其特點(diǎn)是物質(zhì)的分離取決于樣品物質(zhì)顆粒的質(zhì)量，即樣品物質(zhì)的沉降系數(shù)，而不是取決于樣品物質(zhì)的密度，因而適合于分離密度相近而大小和形狀不同的物質(zhì)。等密度離心也叫沉降平衡法。所謂等密度是指樣品密度與介質(zhì)的密度相等，實(shí)際上是在梯度密度介質(zhì)中進(jìn)行的。該技術(shù)的特點(diǎn)是沉降分離與樣品物質(zhì)的大小和形狀無關(guān)，而取決于樣品物質(zhì)的密度。離心技術(shù)的類型17

2.3生物大分子的電泳分離純化技術(shù)

電泳是帶電離子或膠粒在電場中由于遷移速率的不問而被分離的過程。它已經(jīng)成為生物化學(xué)家和分子生物學(xué)家分離和分析生物大分子的最主要的工具之一。電泳主要分為兩種類型，即常規(guī)凝膠電泳和高效毛細(xì)管電泳，而常規(guī)凝膠電泳法又因介質(zhì)的不同分為多種類型．其中最常用的為聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳。18電泳分離以電場中溶質(zhì)的電泳遷移率差為基礎(chǔ)．一種離子在電場中的遷移速率可用下式表示：=eE其中，為離子遷移速率；e為電泳遷移率，即當(dāng)電場強(qiáng)度為1V/cm時(shí)離子的遷移速率；E為電場強(qiáng)度。

19上述比值相當(dāng)于離子的荷質(zhì)比，不同的離子具有獨(dú)一無二的質(zhì)量及電荷性質(zhì)，因而在同一電場中和同一支持介質(zhì)上電泳遷移率不同，從而能得到彼此間的分離。e電場力(Fe)摩擦力(Ff)對(duì)于給定的電場強(qiáng)度、離子及介質(zhì)，電泳遷移率是該離子的特征常數(shù)，它與離子受到的電場力和摩擦力之間具有以下關(guān)系：202.3.1影響電泳分離的因素影響電泳分離的因素包括被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)和電泳條件兩個(gè)方面21物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)電泳分離是根據(jù)物質(zhì)的荷電性質(zhì)，因此、被分離物質(zhì)應(yīng)帶有電荷、或者在一定的條件下經(jīng)過處理后帶有一定的凈電荷。被分離物質(zhì)間荷質(zhì)比差異越大，電泳分離的分辨率越好。被分離分子的荷質(zhì)比差別越大，分離就越容易。除此之外，荷電分子顆粒的形狀與電泳遷移率間也有關(guān)系，這主要是影響物質(zhì)分子移動(dòng)時(shí)的摩擦力，物質(zhì)分子顆粒呈球形最為理想。22外部因意外部因素主要有支持介質(zhì)、溶液性質(zhì)及電場性質(zhì)三個(gè)方面；1．支持介質(zhì)目前，用于電泳的支持介質(zhì)多種多樣．除了天然纖維素、淀粉和瓊脂糖以外，還有人工合成的聚丙烯酰胺等。在電泳過程中，支持介質(zhì)對(duì)樣品物質(zhì)有可能產(chǎn)生一定的吸附作用，從而影響樣品分離的分辨率及電泳遷移率。所以．要盡可能選擇吸附作用小的材料作為支持介質(zhì)。23支持介質(zhì)的另一個(gè)影響因素是電滲作用(ElectricOsmosis)。所謂電滲，就是在電泳過程中，由于支持物吸附水合正離子(H3O+)或OH-，使溶液相對(duì)帶正電或負(fù)電，在電場作用下溶液向相反的方向移動(dòng)．這一現(xiàn)象就叫電滲。當(dāng)電滲方向與被分離離子的移動(dòng)方向相同時(shí)，電滲加速樣品離子的移動(dòng)，反之，則減小樣品離子的移動(dòng)速率。另一方面，固相介質(zhì)解離的基團(tuán)與荷電的樣品分子會(huì)發(fā)生靜電相互作用，這兩種因素使得樣品分子的正常分離受到一定的干擾。為此，要盡可能減小電滲作用的產(chǎn)生。合理選擇支持介質(zhì)是解決這一問題的關(guān)鍵措施之一。24

2．溶液介質(zhì)溶液介質(zhì)的性質(zhì)與電泳分離密切相關(guān)，電泳所使用的介質(zhì)都是緩沖溶液，溶液的pH和離子強(qiáng)度是兩個(gè)最關(guān)鍵的影響因素。溶液的pH決定著樣品分子的遷移方向。合適的pH可以使被分離樣品之間的電荷性質(zhì)差異更大。pH也是樣品物質(zhì)分子電泳遷移率的決定因素之一。25溶液中離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影響主要有兩個(gè)方面：一方面，離子強(qiáng)度大時(shí)，可使蛋曰質(zhì)的帶電量減小，其結(jié)果使電泳遷移率減小。另一方面，溶液中離子強(qiáng)度越大，通過溶液介質(zhì)的分電流越大，而通過樣品物質(zhì)分子的分電流變小，從而降低了電泳遷移率。同時(shí)還增加了熱量的產(chǎn)生，提高了環(huán)境溫度。當(dāng)離子強(qiáng)度過低時(shí)．降低了電泳總電流，減小了熱量的產(chǎn)生，降低了電泳的環(huán)境溫度．但擴(kuò)散作用相對(duì)增加。同時(shí)，緩沖溶液的緩沖容量減小，pH變得難于控制，從而降低了電泳的分辨率和重現(xiàn)性。電泳介質(zhì)的離子強(qiáng)度一般在0.5~0.1mol/L之間為宜。26

3．電場強(qiáng)度樣品物質(zhì)在支持介質(zhì)上的電泳遷移速率與加在支持介質(zhì)上的電壓梯度成正比，電壓梯度的單位以v/cm表示，它與支持介質(zhì)的長度及加在支持介質(zhì)兩端的電場強(qiáng)度間的關(guān)系如下：一般來說，兩極電壓差在500v以內(nèi)屬常壓電泳，其電場強(qiáng)度約在10～20V/cm。兩極問的電壓差在500v以上為高壓電泳，電場強(qiáng)度約在20～200V/cm之間。由于高壓電泳過程中產(chǎn)生大量的熱，會(huì)使蛋白質(zhì)變性，電泳緩沖溶液蒸發(fā)過多而使溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，這些都會(huì)影響電泳的分辨率。所以，高壓電泳需要附有冷卻裝置，以保證電泳的環(huán)境溫度在一個(gè)安全恒定的范圍內(nèi)。272.3.2聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PolyacrylamideGelEletrophoresis，PAGE)是近年來在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的一種電泳分離模式。這種凝膠具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，樣品物質(zhì)在凝膠中移動(dòng)除了電泳以外，還具有凝膠排阻層析中的分子篩效應(yīng)，因而具有很高的分辨率。

28

(1)聚合物分子中可電離的基團(tuán)少，因而電滲作用??；

(2)對(duì)樣品物質(zhì)的吸附作用??；

(3)易于制備，并且可以易于回收；

(4)凝膠透明度好，幾乎為無色透明，因而電泳過程容易觀察和監(jiān)測；聚丙烯酰胺凝膠之所以能被廣泛地用作電泳的支持介質(zhì)是因?yàn)樗哂邢率鎏攸c(diǎn)：29

(5)凝膠化學(xué)純度高，對(duì)熱穩(wěn)定，不易對(duì)樣品物質(zhì)產(chǎn)生污染；

(6)凝膠孔徑的大小可以按照需要進(jìn)行控制．因而具有可控的分子篩效應(yīng)，通過控制交聯(lián)劑的濃度或聚丙烯酰胺的總濃度都可以達(dá)到控制凝膠孔徑大小的目的；

(7)該凝膠在270nm處沒有光吸收，有利于樣品蛋白質(zhì)和核酸電泳后的掃描檢測。同時(shí)，該凝膠富含酰胺基，其凝膠具有穩(wěn)定的親水性，又不帶電荷，故凝膠在電場中幾乎沒有電滲作用，是一種理想的電泳支持物。30聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用

1．SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)測定蛋白質(zhì)的分子量通常所用的電泳技術(shù)不能測定蛋白質(zhì)的分子量，因?yàn)樵谶@些電泳中物質(zhì)分子的電泳遷移率取決于物質(zhì)分子的凈電荷和分子的大小。而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)可用于測定蛋白質(zhì)的分子量。31

SDS的化學(xué)名為十二烷基硫酸鈉。蛋白質(zhì)分子用SDS處理后多肽鏈變成無規(guī)則線團(tuán)狀態(tài)。加入SDS的同時(shí)，還加入破壞二硫鍵的巰基乙醇。SDS和變性蛋白質(zhì)多肽鍵以1.4g比1.0g的恒定比例相互結(jié)合，形成蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，由于SDS帶大量的負(fù)電荷，蛋白質(zhì)本身的負(fù)電荷已被SDS所屏蔽掉。這樣，復(fù)合物的遷移率不再取決于蛋白質(zhì)的荷電性質(zhì)，而是取決于蛋白質(zhì)分子的大小。分子量大的分子在單一通道的凝膠網(wǎng)孔中移動(dòng)時(shí)受到的阻力較大，較小的分子具有較大的遷移率，分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率成線性關(guān)系，據(jù)此可以測定蛋白質(zhì)的分子量。3233

2．蛋白質(zhì)等電聚焦電泳等電聚焦(IsoelectricFocusing，IEF)是研究蛋白質(zhì)的另一有效的方法。設(shè)計(jì)一種裝置，在同一塊凝膠板上形成不同pH梯度的區(qū)帶，如某一樣品有A和B兩種蛋白質(zhì)，A的等電點(diǎn)pI＝4.8，B的pI＝7.8，現(xiàn)在將樣品放在具有不同pH梯度的凝膠板上的任一個(gè)pH區(qū)域內(nèi)。比如：樣品放在pH＝5.7的區(qū)域內(nèi)，在這種情況下，蛋白質(zhì)A帶凈的負(fù)電荷，而B則帶凈的正電荷，在電場的作用下，A和E分別向正極和負(fù)極移動(dòng)。當(dāng)分別移動(dòng)至各自的pI區(qū)域時(shí)二者所帶的凈電荷均為零，所以便停留在該區(qū)域不再向任何一個(gè)方向移動(dòng)。由此可見，等電聚焦不僅可以分離和濃縮蛋白質(zhì)，而且可同時(shí)測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，因?yàn)槊糠N蛋白質(zhì)都具有特定的等電點(diǎn)。34蛋白質(zhì)等電聚焦示意圖等電聚焦過程中最關(guān)鍵的問題是保持凝膠介質(zhì)pH梯度的穩(wěn)定性，防止由于擴(kuò)散或?qū)α髌茐膒H梯度。35在聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠中形成穩(wěn)定pH梯度的最常用的方法是通過電泳一種人工合成的兩性聚合電解質(zhì)而形成，該電解質(zhì)因含有大量的氨基，羧基或磺酸基而具有廣泛的pH范圍。如果樣品蛋白質(zhì)的pI值為已知，可選持包括該pI在內(nèi)的較小pH范圍的兩性電解質(zhì)；如果樣品蛋白質(zhì)的pI值為未知，則應(yīng)選擇廣泛pH范圍的兩性電解質(zhì)(pH3-10)，然后根據(jù)粗測值再選擇較窄pH范圍的兩性電解質(zhì)，以達(dá)到高的分辨率。36點(diǎn)樣的方法有兩種，對(duì)濃縮的脫鹽樣品，可直接鋪放在凝膠的頂端。另一種方法是在制備凝膠時(shí)，同時(shí)加入蛋白質(zhì)樣品。電泳時(shí)，聚合電解質(zhì)比蛋白質(zhì)移動(dòng)得快，凝膠中總是在蛋白質(zhì)未達(dá)到pI位置之前pH梯度已經(jīng)形成。電泳之后，不可用染色劑直接染色，因?yàn)槌Ｓ玫牡鞍踪|(zhì)染色劑也能和兩性電解質(zhì)結(jié)合。為此，可先將凝膠浸泡在5％的三氯乙酸中以除去兩性電解質(zhì)，然后再用考馬斯亮藍(lán)等染色。373.二維電泳(Twodimensionalgelelectrophoresis)由于生物樣品中蛋白質(zhì)種類繁多，當(dāng)一些蛋白質(zhì)的分子量比較接近，或者等電點(diǎn)比較接近時(shí)，單一的聚丙烯酰胺凝膠電泳或等電聚焦無法將蛋白得到有效分離，因此，可采用先等電聚焦后再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，使不同蛋白得到有效分離。這種方法叫二維電泳。38二維電泳結(jié)果392.3.3瓊脂糖凝膠電泳(AgaroseGelElectrophoresis)特點(diǎn)聚丙烯酞胺凝膠電泳法只適合于蛋白質(zhì)及一些較小的DNA片段的分離分析，樣品的分子量一般不超過3.5105KD。由于凝膠孔徑大小的限制，不適合于分子量較大物質(zhì)的分離分析。而瓊脂糖凝膠具有較大的孔徑，瓊脂糖凝膠電泳目前已成為RNA和DNA檢測、分析、分離和性質(zhì)研究的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖凝膠電泳沒有PAGE法相關(guān)的毒性問題，樣品的染色和脫色迅速。由于成膠時(shí)無自由基及催化劑參加，所以是非化學(xué)活性的。該凝膠透明，干燥后可直接用紫外分光光度計(jì)定量，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好，并可做成永久記錄而保存。40實(shí)驗(yàn)方法

DNA分子的凝膠電泳一般分為三個(gè)步驟；

(1)制備一定濃度的瓊脂糖凝膠，使其適合于被分離DNA分子的大??；

(2)將DNA樣品加到樣品并中，凝膠在一定的電場強(qiáng)度下電泳一定的時(shí)間，使之達(dá)到最佳分離；

(3)凝膠染色，或當(dāng)溴乙錠被加入到凝膠和電泳緩沖溶液時(shí)可直接用紫外燈照射以觀察熒光。41應(yīng)用

1．限制性核酸內(nèi)切酶存在下酶切DNA片段的分析完整的DNA分子，在特定的限制性內(nèi)切酶的存在下，會(huì)產(chǎn)生大小不同而具特定數(shù)量的DNA片段。完整的DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了可能產(chǎn)生的DNA片段的數(shù)量及每個(gè)酶切片段的大小。用瓊脂糖凝膠電泳分離分析