BrdU染色原理和步驟

會計學(xué)1BrdU染色原理和步驟活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對研究細(xì)胞動力學(xué)有重要意義。因組織細(xì)胞內(nèi)無內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣

摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu，以氫鏈與腺嘌呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu抗體反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單克隆抗體與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG抗體孵育、呈色，顯示進(jìn)入S期細(xì)胞的情況。

第1頁/共11頁改進(jìn)和發(fā)展由于鹽酸和蛋白酶處理等可引起抗原或組織形態(tài)發(fā)生變化。為此，Conchoroff(1985)等制備了一種單克隆抗體（Bu—1），其培養(yǎng)液上清能與雙鏈DNA的Brdu反應(yīng)，因為培養(yǎng)液上清中含有DNA酶，可分解雙鏈DNA，顯露Brdu，達(dá)到染色目的。采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—鹽酸處理，亦得到了良好的染色結(jié)果。用雙重或多重染色、觀察何種細(xì)胞分裂增殖時，首先應(yīng)染色其它抗原物質(zhì)，最后顯示Brdu。通常在第一種抗體呈色后，再經(jīng)1%戊二醛固定5～10min，重復(fù)染色程序，均可獲得較滿意的染色結(jié)果，分裂細(xì)胞核呈棕褐色；顯示其它抗原用ALP標(biāo)記抗體，則細(xì)胞漿為紅色（FR）或藍(lán)色（FB）第2頁/共11頁操作步驟（1）（1）細(xì)胞以1.5×105/ml細(xì)胞數(shù)接種于直徑35mm培養(yǎng)皿中（內(nèi)放置一蓋玻片），培養(yǎng)1d，用含0.4％FBS培養(yǎng)液同步化3d，使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期。（2）加入BrdU（儲液：1.0mg/ml,終濃度為0.03μg/ml），37℃，孵育40min。（3）棄培養(yǎng)液，玻片用PBS洗滌3次。（4）甲醇/醋酸固定10min。第3頁/共11頁（5）經(jīng)固定的玻片空氣干燥，0.3％H2O2-甲醇

30

min滅活內(nèi)源性氧化酶。（6）5％正常兔血清封閉。（7）甲酰胺100℃，5

min變性核酸。（8）冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1：50），陰性對照加PBS或血清。（9）按ABC法進(jìn)行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)10個高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，計算標(biāo)記指數(shù)（LI）。第4頁/共11頁BrdUstainingprotocolMaterialsandreagentsHydrogenchloride(HCl),1Mand2MBoratebuffer0.1MBorax(sodiumtetraborate)38.1g/liter,pHto9.0Phosphate-bufferedsaline(PBS),pH7.4,with0.1%TritonX-100第5頁/共11頁Method1.Sectionsofparaffin-embeddedtissuesshouldbede-waxedbeforeproceeding.2.IncubateinHCl(1M)for10minonicetobreakopentheDNAstructureofthelabeledcells.3.ThisisfollowedbyHCl(2M)for10minatroomtemperature,then20minat37°C.4.Immediatelyaftertheacidincubations,neutralizebyincubatingthesamplesinboratebuffer(0.1M)for10minatroomtemperature.5.WashinPBS(pH7.4),0.1%TritonX-1003times,5minperwash.6.Continuewithstandardstainingprocedureasdescribedintheimmunohistochemistryandcytochemistryprotocols.第6頁/共11頁注意事項1.BrdU配制方法：10mg溶于10ml雙蒸水，4℃下避光保存2.BrdU會肌體造成不可逆損傷，使用時注意安全，避免吸入BrdU粉塵。第7頁/共11頁BrdU染色的進(jìn)化---EdUEdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團(tuán)在天然化合物中很少見，能夠在DNA復(fù)制時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在合成的DNA分子中，基于Apollo?熒光染料與EdU的特異性反應(yīng)即可直接并準(zhǔn)確地檢測出DNA復(fù)制活性，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞