植物體細胞雜交的選擇和鑒定-高二下學期生物人教版選擇性必修三

植物體細胞雜交的選擇和鑒定2020版《課程標準》確實有一條目“概述植物體細胞雜交是將不同植物體細胞在一定條件下融合成雜合細胞，繼而培育成新植物體的技術”。2019版高中生物學選擇性必修三介紹了植物體細胞雜交的過程及成果：那么，植物體細胞雜交過程如何選擇和鑒定？植物體細胞雜交包括原生質(zhì)體融合和體細胞雜種選擇系統(tǒng)。1.原生質(zhì)體融合方法原生質(zhì)體融合方法有化學融合法和電融合法?；瘜W融合法根據(jù)所用化學試劑的不同，分為硝酸鈉融合法、高pH-高濃度鈣離子融合法和PEG融合法。其中，PEG融合法由于融合效率高、無種特異性等優(yōu)點得到廣泛應用。電融合法效率高、對原生質(zhì)體傷害小、融合細胞數(shù)易于控制。PEG融合法的機理：PEG分子具有輕微負極性，可與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵。當PEG分子鏈足夠長時，他在相鄰原生質(zhì)體表面之間，起分子橋作用引發(fā)原生質(zhì)體黏連。PEG還具有改變膜物理化學性質(zhì)及增加類脂膜流動性的作用，從而促進細胞融合。PEG融合法的方法：用原生質(zhì)體培養(yǎng)基調(diào)整雙親原生質(zhì)體的密度，按1:1比例混合；將原生質(zhì)體混合液移入培養(yǎng)皿中，用滴管緩慢滴加含PEG的混合液；加原生質(zhì)體培養(yǎng)基離心去上清液，將沉淀物用原生質(zhì)體培養(yǎng)基重復洗滌兩次后進行培養(yǎng)。2.體細胞雜種選擇系統(tǒng)原生質(zhì)體融合處理后，混合液中含有未融合原生質(zhì)體、同核體、異核體等。必須建立一些有效選擇體系，從各類型細胞中篩選出雜種細胞，使其在適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下生長、分裂、分化和再生。還需要對雜種植株進一步鑒定，因為在細胞分裂和分化過程中，雜種細胞的染色體常發(fā)生復雜變化。（1）雜種細胞選擇體細胞雜種選擇系統(tǒng)由互補選擇法和機械選擇法?；パa選擇法又根據(jù)雙親互補性狀的不同可以分為營養(yǎng)代謝互補選擇法、抗性突變體互補選擇法和葉綠素缺失突變體互補選擇法?；パa選擇法：營養(yǎng)代謝互補選擇法原理：雜種細胞具有雜種優(yōu)勢，對培養(yǎng)基適應能力較強。未融合細胞或自體融合的細胞表現(xiàn)的生活力較弱，分化慢，難以再生植株?？剐酝蛔凅w互補選擇法原理：雜種細胞的選擇是以其對某種逆境具有抗性（必須為顯性）基礎上進行的。選擇培養(yǎng)基為施加某種逆境條件的培養(yǎng)基。例如，在大豆和水稻融合細胞篩選時，利用水稻原生質(zhì)體耐高溫（37℃）的特性，將水稻與大豆原生質(zhì)體融合細胞培養(yǎng)在適合大豆原生質(zhì)體生長的培養(yǎng)基，但培養(yǎng)溫度為37℃。葉綠素缺失突變體原理：雜種細胞的選擇是基于融合細胞具有正常葉綠素并在特定培養(yǎng)基上生長的基礎上進行的。選擇培養(yǎng)基為適合白化和雜種細胞增殖的培養(yǎng)基。白化親本原生質(zhì)體和雜種原生質(zhì)體能形成愈傷組織。機械選擇法：利用融合細胞所具有的可見標記，在倒置顯微鏡下，用微管將融合細胞吸取出來進行選擇的方法。常用的可見標記是葉肉細胞的綠色。（2）雜種植株鑒定雜種細胞篩選僅為體細胞雜種真實性的間接證據(jù)，需要對所獲得的雜種植株作進一步鑒定。因為體細胞雜種在融合及雜種植株再生過程中常常發(fā)生遺傳變異，表現(xiàn)在細胞分裂和染色體的數(shù)目的不穩(wěn)定性及雜種植株的不育性。雜種植株鑒定的方法有形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定、同功酶鑒定和DNA分子標記鑒定。其中，鑒定雜種植株最有效的方法DNA分子標記鑒定。DNA分子標記鑒定是在DNA水平上對親本和雜種植株遺傳差異進行鑒定的一種技術。DNA分子標記鑒定技術能準確鑒定出生物個體間核苷酸序列間的差異，甚至是單個核苷酸的變異，成為鑒定雜種植株最有效的方法。已發(fā)展出十幾種DNA標記技術，如RFLP、RAPD、AFLP等，它們各具特色，為不同的研究目標提供了豐富的技術手段。RAPD技術1990年發(fā)明并發(fā)展起來的，RAPD是建立在PCR基礎之上的一種可對整個序列的基因組進行分析的分子技術。其以DNA為模板，以單個人工合成的核苷酸序列為引物，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、亞甲基藍染色后，在紫外透視儀上檢測。它的應用是基于這樣的一個推理：對于不同的模板DNA，用同一引物擴增既可能得到相同的帶譜（模板基因組間可能具有同源性），也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶就可作為該模板的分子標記。事實上，不同基因組DNA總是具有一定差異的，所以用RAPD就可以進行分子標記研究。理論上講，在一定的擴增條件下，擴增的條帶數(shù)取決于基因組的復雜性。對特定的引物，復雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴增條帶數(shù)也越多。例、甲植物細胞核基因具有耐鹽堿效應，乙植物細胞質(zhì)基因具有高產(chǎn)效應。某研究小組用甲、乙兩種植物細胞進行體細胞雜交相關研究。基本過程包括獲取原生質(zhì)體、誘導原生質(zhì)體融合、篩選融合細胞、雜種植株再生和鑒定，最終獲得高產(chǎn)耐鹽堿再生植株?；卮鹣铝袉栴}：（1）根據(jù)研究目標，在甲、乙兩種植物細胞進行體細胞雜交前，應檢驗兩種植物的原生質(zhì)體是否具備

的能力。為了便于觀察細胞融合的狀況，通常用不同顏色的原生質(zhì)體進行融合，若甲植物原生質(zhì)體采用幼苗的根為外植體，則乙植物可用幼苗的

為外植體。（2）植物細胞壁的主要成分為

和果膠。在獲取原生質(zhì)體時，常采用相應的酶進行去壁處理。在原生質(zhì)體融合前，需要對原生質(zhì)體進行處理，分別是甲原生質(zhì)體和乙原生質(zhì)體的

失活。對處理后的原生質(zhì)體在顯微鏡下用

計數(shù)確定原生質(zhì)體密度。兩種原生質(zhì)體1︰1混合后，通過添加適宜濃度的PEG進行融合；一定時間后，加入過量的培養(yǎng)基進行稀釋，稀釋的目的是

。（3）將融合原生質(zhì)體。懸浮液和液態(tài)的瓊脂糖混合，在凝固前倒入培養(yǎng)皿，融合原生質(zhì)體分散固定在平板上，并獨立生長、分裂，形成愈傷組織。同一塊愈傷組織所有細胞源于

。下列各項中能說明這些愈傷組織只能來自于雜種細胞的理由是哪幾項？

（A.甲乙原生質(zhì)體經(jīng)處理失活，無法正常生長、分裂

B.同種融合的原生質(zhì)體因甲或乙原生質(zhì)體失活而不能生長、分裂

C.培養(yǎng)基含有抑制物質(zhì)，只有雜種細胞才能正常生長、分裂

D.雜種細胞由于結(jié)構(gòu)和功能完整可以生長、分裂）（4）愈傷組織經(jīng)

可形成胚狀體或芽。胚狀體能長出

，直接發(fā)育形成再生植株。（5）用PCR技術鑒定再生植株。已知甲植物細胞核具有特異性DNA序列a，乙植物細胞質(zhì)具有特異性DNA序列b；M1、M2為序列a的特異性引物，N1、N2為序列b的特異性引物。完善實驗思路：Ⅰ.提取純化再生植株的總DNA，作為PCR擴增的

。Ⅱ.將DNA提取物加入PCR反應體系，

為特異性引物，擴增序列a；用同樣的方法擴增序列b。Ⅲ.得到的2個PCR擴增產(chǎn)物

后。若每個PCR擴增產(chǎn)物在凝膠中均出現(xiàn)了預期的

個條帶，則可初步確定再生植株來自于雜種細胞。答案：（1）再生植株

葉片（2）纖維素

細胞質(zhì)、細胞核

血細胞計數(shù)板

終止原生質(zhì)體融合（3）一個融合原生質(zhì)體

ABD

（4）再分化

根和芽（5）模板

M1、M2

電泳

1解析：該試題考查植物體細胞雜交和基因工程過程。（1）根據(jù)研究目標需要得到再生植株，因此在甲、乙兩種植物細胞進行體細胞雜交前，應檢驗兩種植物的原生質(zhì)體是否具備再生植株的能力。為了便于觀察細胞融合的狀況，通常用不同顏色的原生質(zhì)體進行融合，若甲植物原生質(zhì)體采用幼苗的根為外植體，則乙植物可用幼苗的葉片為外植體。（2）植物細胞壁的主要成分為纖維素和果膠。根據(jù)題意，即植物細胞核基因具有耐鹽堿效應，乙植物細胞質(zhì)基因具有高產(chǎn)效應，故在原生質(zhì)體融合前，需要對原生質(zhì)體進行處理，分別是甲原生質(zhì)體和乙原生質(zhì)體的細胞質(zhì)、細胞核失活。對處理后的原生質(zhì)體在顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)確定原生質(zhì)體密度。兩種原生質(zhì)體1︰1混合后，通過添加適宜濃度的PEG進行融合；一定時間后，原生質(zhì)體融合完成，加入過量的培養(yǎng)基進行稀釋，稀釋的目的降低PEG的濃度，從而終止原生質(zhì)體融合，也可以通過降低培養(yǎng)基的濃度促進原生質(zhì)體產(chǎn)生細胞壁，從而使融合細胞分裂。當然，也可以通過離心去融合液，分離得到沉淀物原生質(zhì)體，再進行培養(yǎng)。（3）通過一定的方法將融合原生質(zhì)體分散固定在平板上，并獨立生長、分裂，形成愈傷組織。同一塊愈傷組織所有細胞源于一個融合原生質(zhì)體。這些愈傷組織只能來自于雜種細胞的理由可能是甲乙原生質(zhì)體經(jīng)處理失活，無法正常生長、分裂；同種融合的原生質(zhì)體因甲或乙原生質(zhì)體失活而不能生長、分裂；雜種細胞由于結(jié)構(gòu)和功能完整可以生長、分裂。（4）根據(jù)植物的組織培養(yǎng)技術，由愈傷組織再分化形成完整植株一般有兩種途徑，即愈傷組織經(jīng)再分化可形成胚狀體（胚的發(fā)生途徑）或芽（器官發(fā)生途徑）。胚狀體能長出根和芽，直接發(fā)育形成再生植株或芽在另一培養(yǎng)基上長出根。（5）最后還需要對雜種植株進行鑒定，因為在細胞分裂分化過程中，雜種細胞遺傳物質(zhì)會發(fā)生復雜的變化。雜種植株的鑒定方法有多種，如形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定、同功酶鑒定和DNA分子標記鑒定。1990年發(fā)明的RAP技術就是建立在PCR基礎之上的一種可對整個序列的基因組進行分析的分子技術。用PCR技術鑒定再生植株的方法是，提取純化再生植株的總DNA，作為PCR擴增的模板；將DNA提取物加入PCR反應體系，M1、M2為特異性引物，擴增序列a，用同樣的方法擴增序列b；得到的2個PCR擴增產(chǎn)物電泳后。若每個PCR擴增產(chǎn)