DNA重組技術(shù)的基本工具

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA重組技術(shù)的基本工具你還記得我們嗎？氫鍵磷酸二酯鍵DNA聚合酶第1頁/共47頁第2頁/共47頁別名：操作環(huán)境：原理：操作水平：結(jié)果：

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)?；蚱唇蛹夹g(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因重組DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的品種?；蚬こ痰母拍睿旱?頁/共47頁基因工程的產(chǎn)物第4頁/共47頁普通棉花抗蟲棉第5頁/共47頁基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：普通棉花(無抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)轉(zhuǎn)基因棉花植株第6頁/共47頁

1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”--“分子縫合針”--“分子運(yùn)輸車”--限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶運(yùn)載體第7頁/共47頁1、簡(jiǎn)稱：

2、分布：

一、限制性核酸內(nèi)切酶

——“分子手術(shù)刀”主要在原核生物中限制酶尋根問底(P4)你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？第8頁/共47頁

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。限制酶在原核生物中的作用第9頁/共47頁

3、特點(diǎn):

一、限制性核酸內(nèi)切酶

——“分子手術(shù)刀”識(shí)別特定核苷酸列,特定位點(diǎn)切割（專一性）斷裂：磷酸二酯鍵第10頁/共47頁第11頁/共47頁限制酶的識(shí)別特點(diǎn)以中軸線雙側(cè)的DNA上堿基呈反向?qū)ΨQ，重復(fù)排列

如：GAA

TTCCCCGGG

CTT

AAGGGGCCC第12頁/共47頁第13頁/共47頁

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback中心軸線兩側(cè)切開第14頁/共47頁什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。第15頁/共47頁SmaⅠ平末端平末端中心軸線處切開第16頁/共47頁

④作用：

⑤結(jié)果：一、限制性核酸內(nèi)切酶

——“分子手術(shù)刀”切割DNA產(chǎn)生黏性未端和平末端第17頁/共47頁

3、特點(diǎn):

4、作用：

5、結(jié)果：1、簡(jiǎn)稱：2、分布：工具1：限制性核酸內(nèi)切酶

主要在原核生物中限制酶識(shí)別特定核苷酸列,切割特定切點(diǎn)（專一性）切割DNA產(chǎn)生黏性未端或平末端小結(jié)第18頁/共47頁要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?第19頁/共47頁Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切第20頁/共47頁思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。第21頁/共47頁1、作用:

把DNA片段拼接成新的DNA，2、作用原理：催化磷酸二酯鍵形成,不是氫鍵二、DNA連接酶

——“分子縫合針”第22頁/共47頁

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵第23頁/共47頁

T4DNA連接酶第24頁/共47頁3、類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端第25頁/共47頁DNA聚合酶DNA連接酶用途尋根問底

(P6)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵作用對(duì)象DNA復(fù)制基因重租4、

DNA連接酶與DNA聚合酶比較第26頁/共47頁3、類型①E·coli

DNA連接酶

來源：大腸桿菌作用特點(diǎn)：只連接黏性末端

②T4DNA連接酶

來源：T4噬菌體作用特點(diǎn)：連接黏性末端和平末端

2、作用原理：催化磷酸二酯鍵形成1、作用:：工具2：DNA連接酶

把DNA片段拼接成新的DNA，4、

DNA連接酶與DNA聚合酶比較小結(jié)第27頁/共47頁P(yáng)7.思考與討論：限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA連接酶將它們連接起來？…CTGCA

…G

①…AC…TG②

CG…GC…③…G

…CTTAA

④G…

ACGTC…

⑤…GC…CG⑥GT…

CA…

⑦AATTC…G…⑧②和⑦能連接形成…AC…TGGT…

CA…

④和⑧能連接形成…G

…CTTAA

AATTC…G…

CG…GC…

…GC…CG

③和⑥能連接形成①和⑤能連接形成…CTGCA

…G

G…

ACGTC…

反向?qū)ΨQ第28頁/共47頁4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P7第29頁/共47頁

1、載體必須具備的條件：①能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制或整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上復(fù)制②具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接③具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。④對(duì)受體細(xì)胞無害

三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

——“分子運(yùn)輸車”第30頁/共47頁2、常用的載體：

質(zhì)粒（最常用)

λ噬菌體的衍生物，動(dòng)植物病毒等第31頁/共47頁能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因3、質(zhì)粒本質(zhì)：小型環(huán)狀DNA分子。分布：許多細(xì)菌第32頁/共47頁工具3：運(yùn)載體1、需要的條件：

⑴有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)

⑵能在受體細(xì)胞中自我復(fù)制，或整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上復(fù)制

⑶有某些標(biāo)記基因，便于篩選

⑷對(duì)受體細(xì)胞無害2、常用運(yùn)載體：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物或某些動(dòng)植物病毒3、質(zhì)粒

小結(jié)第33頁/共47頁3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？

不可以，作為基因工程使用的載體必需滿足一定條件,且都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。思考與探究P7第34頁/共47頁1、在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶反饋練習(xí)：第35頁/共47頁2、不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD第36頁/共47頁3、下列不適合用于基因工程的運(yùn)載體是（）

A、質(zhì)粒B、噬菌體

C、細(xì)菌D、病毒選我C4、下列說法正確的是：（）

A、限制酶的切口一定是GAATTC堿基序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、重組技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶、運(yùn)載體

D、利用運(yùn)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制的過程可稱為“克隆”選我D審題第37頁/共47頁5、以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G…

…CG…G

(1)其中①和

是由一種限制酶切割形成的

末端，兩者要重組成一個(gè)DNA分子，所用DNA連接酶通常是

。（2）

和

是由另一種限制酶切割形成的

末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常是

。反饋練習(xí)：第38頁/共47頁再見第39頁/共47頁1.1944年艾弗里(O.Avery)等進(jìn)行了肺炎雙球菌體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),證明了DNA是生物的遺傳物質(zhì),并且證明了DNA可以從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體,成為基因工程的先導(dǎo)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破第40頁/共47頁2.1953年沃森和克里克建立了雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,使生物學(xué)進(jìn)入分子水平。1958年梅塞爾松和斯塔爾,以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料,運(yùn)用同位素示蹤技術(shù),用實(shí)驗(yàn)證明了DNA的復(fù)制是以半保留方式進(jìn)行的.1957年克里克提出中心法則的確立第41頁/共47頁3.1963年尼倫伯格和馬太做蛋白質(zhì)體外合成實(shí)驗(yàn),破譯編碼氨基酸的遺傳密碼.第42頁/共47頁1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明技術(shù)發(fā)明命使基因工程的實(shí)施成為可能1967年羅思和赫林斯基發(fā)現(xiàn)細(xì)菌質(zhì)粒有自我復(fù)制能力,為基因轉(zhuǎn)移找到一種運(yùn)載工具.1970年阿爾伯(W.Arber)、內(nèi)森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.Smith)