ELISA基礎(chǔ)知識及常見問題的處理

會計學(xué)1ELISA基礎(chǔ)知識及常見問題的處理ELISA檢測方法

夾心法:雙抗原（抗體）夾心法是檢測抗原最常用的方法，其檢測方法：雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標抗原Ag*→Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)→顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色第1頁/共18頁間接法間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。其檢測方法：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標二抗Ab*→Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)→顯色第2頁/共18頁競爭法其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標抗體Ab*→Ag-Ab+底物(TMB)→不顯色(+)固相(包被)抗原Ag+樣品(無抗體Ab)+酶標抗體Ab*→Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色(-)第3頁/共18頁診斷試劑所用的質(zhì)量指標及相互關(guān)系：

靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%測定方法及表示方法：靈敏度標準品、質(zhì)控血清、陽性標本稀釋終點、血清盤（pannel）及臨床標本陽性率。靈敏度標準品可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，質(zhì)控血清可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，也可以自己配制。因為質(zhì)控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亞型、位點等原因，評定試劑盒的靈敏度都帶有一定的片面性。陽性標本稀釋終點的方法常用于不同試劑盒的比較，但也有上述的片面性。陽性pannel有些可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，如HBsAg陽性pannel，也可以自己配制。臨床標本陽性率，是一種粗略的估計，但對臨床很實用。第4頁/共18頁特異性：真陰性標本的檢出能力。相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%測定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨床標本陰性率。質(zhì)控血清、血清盤可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，也可以自己配制。自己配制時注意陰性標本的在血清盤中的比例以及代表性。臨床標本陰性百分率是臨床使用中對試劑盒特異性的粗略的判斷。如果數(shù)批產(chǎn)品都通過了特異性參比測定，是否產(chǎn)品的特異性就一樣了呢？不一定。因為特異性參比品的數(shù)量不可能很大（樣本與整體的差異），引起非特異性的因素很多，目前尚不完全清楚。質(zhì)控血清盤也存在同樣的問題。第5頁/共18頁有關(guān)名詞簡介

質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對實驗結(jié)果進行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽性對照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標本不一致，應(yīng)該注意對結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動，不可用于標定儀器或評價方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。第6頁/共18頁室內(nèi)質(zhì)控：實驗室內(nèi)部使用控制實驗結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。室間質(zhì)評：用于考核各個實驗室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國家級和地方級的室間質(zhì)評?？梢岳斫鉃椤案鱾€實驗室的質(zhì)量評比”。第7頁/共18頁臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法確定的。許多試劑都會給出臨界值或臨界值的計算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個陰性顯色的情況。ELISA抗–HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個陽性顯色的情況。第8頁/共18頁陰性對照及陽性對照：陰、陽性對照若有正確的結(jié)果，對試劑盒操作的結(jié)果可以有粗略的判斷?？瞻讓φ眨簩LISA試劑來說，空白對照實際上是不加標本不加酶做對照。空白對照主要測系統(tǒng)的吸光率。空白對照在單波長測量時顯得尤其重要。第9頁/共18頁ELISA試劑常見問題及解答ELISA試劑的原理基礎(chǔ)為抗原抗體免疫反應(yīng)，在生產(chǎn)、儲存、運輸、使用等各環(huán)節(jié)中，對其質(zhì)量特性產(chǎn)生影響的因素眾多。此外，其顯色系統(tǒng)中的過氧化物酶在生物樣品中普遍存在，故在客戶使用過程中經(jīng)常會產(chǎn)生某種非期望的結(jié)果。對問題進行客觀的分析、有針對性的解決問題，不僅是用戶的希望，也是促進我們自身產(chǎn)品質(zhì)量提高的關(guān)鍵。以下為ELISA試劑盒常見問題處理對策：第10頁/共18頁顯色淺靈敏度低序號原因解決方法1試劑盒運輸時間過長，受高溫天氣影響，酶的活性降低。試劑運輸過程加放足夠冰袋并盡可能縮短運輸時間。2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。試劑盒內(nèi)所有組分都應(yīng)當在4℃冷藏，未使用完的板條要密封保存。3試劑盒使用時已超出有效期。過期試劑盒不可以使用。4溫育時間不夠。嚴格按照說明書操作。5恒溫箱溫度達不到37℃。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。盡量避免頻繁開關(guān)恒溫箱門。經(jīng)常注意水箱中合適的水位。在保證水不沒過酶標板的前提下，使水位盡量高，以保證反應(yīng)溫度。第11頁/共18頁6加樣量不足；移液時抽吸排放過快，有氣泡、或吸頭內(nèi)殘留液體過多。經(jīng)常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過快，排放要完全。7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說明書要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入量。8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來后，要先平衡至室溫方可以使用。10試劑開啟時間過長，污染。試劑開啟后應(yīng)該在盡可能短的時間內(nèi)用完，在保證正確貯存的前提最長不要超過。12不同批號試劑中混用不同批號試劑不能混用第12頁/共18頁假陽性多，本底高甚至花板

序號原因解決方法1試劑過期過期試劑不能使用2加樣時污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。3加酶時污染對先加樣后加酶的操作，加酶時要注意吸頭不要接觸標本，造成污染。當可能造成污染時，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理。4恒溫箱溫度過高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。5整個操作時間過長、造成反應(yīng)時間不同（第一孔與最后一孔反應(yīng)時間相差很懸殊）。氣溫高時更明顯。在盡可能短的時間內(nèi)完成操作。盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時）。第13頁/共18頁6洗液稀釋倍數(shù)過高按照要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時浸泡時間不夠按要求操作，并適當延長浸泡時間。9手工洗板方式不正確洗板時，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時間。10洗板機調(diào)試不正確或者有故障（可通過手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。12顯色液B液被污染13顯色完后沒有終止反應(yīng)。顯色完立即終止反應(yīng)。第14頁/共18頁重復(fù)性不好

1加樣量多少不一，操作時間長短不一。重復(fù)同一樣品時，加樣量與加樣時間相同；同時注意移液器的校準。加樣后應(yīng)該將酶標板放置在微量振蕩器上，充分混合；標本保證一致、無污染；盡可能由同一名操作人員操作。盡可能模擬相同的反應(yīng)條件。2加入標本后沒有混勻。3重復(fù)實驗的操作人員不同，操作習(xí)慣不同。4反