ELISA雙抗夾心法檢測抗原解析

會計(jì)學(xué)1ELISA雙抗夾心法檢測抗原解析ELISA-測抗原（Ag）或抗體（Ab）三要素抗原或抗體的固相化：已知的Ag/Ab結(jié)合到固相載體表面，并保持其免疫活性；抗原或抗體的酶標(biāo)記：酶標(biāo)Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；底物顯色：底物被酶催化成為有色產(chǎn)物—定性和定量–放大免疫反應(yīng)的信號基本原理第1頁/共42頁高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值基本特點(diǎn)第2頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第3頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第4頁/共42頁顯色間接法檢測特異性抗體包被已知抗原與待測抗體孵育與酶標(biāo)抗體孵育加入底物包被已知抗原第5頁/共42頁優(yōu)點(diǎn):只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法操作簡單迅捷缺點(diǎn)：可重復(fù)性差通常用于抗體效價(jià)的檢測和某些疾病的早期診斷第6頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第7頁/共42頁直接競爭法檢測可溶性抗原原理：待檢抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合；待檢抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。第8頁/共42頁優(yōu)點(diǎn)：待檢抗原只需要一個(gè)抗原決定簇，適合小分子抗原，如，激素，藥物等；操作步驟簡單快捷，只需要一個(gè)保溫洗滌過程缺點(diǎn)：酶標(biāo)記抗體用量大；定量檢測的靈敏度和重復(fù)性存在不足。第9頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原

雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第10頁/共42頁改良雙抗夾心法雙抗體夾心法檢測可溶性抗原雙抗夾心法第11頁/共42頁優(yōu)點(diǎn)：待測抗原需要≥2個(gè)抗原決定簇，所以適合大分子抗原的檢測，一般在分子量5000D以上；由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，尤其是改良雙抗夾心法；只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物就可以建立此法；重復(fù)性較好；缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力第12頁/共42頁基本類型抗體測定法

間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第13頁/共42頁應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法

（BA-ELISA法）間接包被放大終末反應(yīng)第14頁/共42頁BA-ELISA原理

BA-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素(B，biotin)與親和素(A，avidin)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。生物素是動植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H；親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素有非常高的親和力；（鏈酶親和素是從鏈霉菌中提取，對載體吸附性比前者低）親和素與生物素都可與蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子結(jié)合而不影響后者的生物活性，是理想的標(biāo)記劑；結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。第15頁/共42頁實(shí)驗(yàn)材料小鼠INF-γ檢測試劑盒的組成：CaptureAb：purifiedanti-mouseIFN-γDetectionAb：biotin-conjugate-anti-mouseIFN-γAvidin-conjugate-HRPStandard：recombinantmouseIFN-γ（定量測定）Coatingbuffer5×AssaydiluentTMBsolution待測樣品----經(jīng)ConA活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清第16頁/共42頁ELISA操作要點(diǎn)樣品的保存試劑的準(zhǔn)備固相載體包被加樣孵育(溫育）洗滌顯色和比色第17頁/共42頁樣本的制備與保存：血清樣品和細(xì)胞培養(yǎng)上清：5天內(nèi)測定，可以放置于4℃，超過一周，-80℃保存；ConA活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清：分別于活化后不同時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)的細(xì)胞，2000rpm，4℃離心分離上清，冰上放置，分裝第18頁/共42頁試劑的準(zhǔn)備ELISA中用的蒸餾水或者去離子水，包括用于配置coatingbuffer，稀釋Assaybuffer，洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的；從冰箱中取出的試劑應(yīng)該平衡至室溫后使用；試劑最好現(xiàn)配先用第19頁/共42頁固相載體最常用的是聚苯乙烯：有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能；國際上標(biāo)準(zhǔn)的是微量滴定板8×12的96孔板式；已經(jīng)包被抗原或者抗體的固相載體在低溫（2-8℃）干燥的條件下一般可以保存6個(gè)月。第20頁/共42頁包被定義：將抗原或者抗體固定在固相載體的過程稱為包被；物理吸附：兩者的疏水基團(tuán)通過疏水鍵的作用抗體或者蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液（即本次實(shí)驗(yàn)用的coatingbuffer）4-8℃包被過夜(有利于蛋白活性的保持），與37℃孵育2小時(shí)被認(rèn)為具有相等的包被效果包被的最適當(dāng)濃度隨著載體和包被物的性質(zhì)和酶結(jié)合物的濃度調(diào)定第21頁/共42頁封閉定義：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程；目的：抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度比較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量的不相關(guān)蛋白質(zhì)填充這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附；常用封閉液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脫脂奶粉；本實(shí)驗(yàn)用封閉液：1×Assaybuffer。第22頁/共42頁加樣ELISA中一般有3次加樣步驟，即，加樣本（和/或標(biāo)準(zhǔn)品），加酶結(jié)合物，加底物；加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以濺出,不可以產(chǎn)生氣泡；多道加液器的使用第23頁/共42頁孵育(溫育）在ELISA中抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫的過程稱為孵育；常用溫度：43℃，37℃，室溫，4℃等孵育時(shí)為了避免蒸發(fā)，可以用塑料封口膠或者保鮮膜封板第24頁/共42頁洗滌

洗滌在ELISA中雖然不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但決定了實(shí)驗(yàn)的成敗聚苯乙烯等塑料對蛋白的吸附是普遍的，洗滌可以清除在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)洗滌可以清除殘留在板孔中沒有能夠與固相抗原或者抗體結(jié)合的物質(zhì)常加入非離子表面活性劑（含有疏水基團(tuán)+親水基團(tuán)），以抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面，如吐溫20，0.05%的濃度比較合適，濃度＞2%會洗脫包被在板上的抗原或者抗體第25頁/共42頁洗滌方式：甩干孔內(nèi)的反應(yīng)液浸泡，即將洗滌液注滿板孔(約300μl），靜置3min，浸泡時(shí)間不可以隨意縮短；甩去液體后在吸水紙上拍干重復(fù)操作2，3，洗滌次數(shù)按要求操作第26頁/共42頁顯色和比色

顯色是ELISA中的最后一步孵育反應(yīng)，此時(shí)，酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物；定量實(shí)驗(yàn)中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)該按規(guī)定力求準(zhǔn)確；定性測定的顯色時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制和及時(shí)判斷；終止反應(yīng)，防止反應(yīng)過度：

TMB受光照影響不大，經(jīng)HRP作用后，40min達(dá)到高峰；終止液有多種，疊氮鈉或SDS等酶抑制劑可以維持藍(lán)色12-24h不褪色；

OPD受光照會自行變色，要避光，經(jīng)HRP作用后，37℃孵育20-30min后顏色即不再加深；常用終止液為2MH2S04；

第27頁/共42頁HRP的色原底物系統(tǒng)

與HRP反應(yīng)后的顏色加終止液后的顏色讀數(shù)波長特點(diǎn)OPD臨苯二胺492nm致畸，但本底好TMB四甲基聯(lián)苯胺450nm操作方便，本底較高第28頁/共42頁ELISA數(shù)據(jù)的處理根據(jù)standard的濃度和對應(yīng)的OD值計(jì)算出線性方程將所測定樣品的OD值代入方程計(jì)算出相應(yīng)的樣品的濃度第29頁/共42頁P(yáng)rotocal包被：用Coatingbuffer

1:1000稀釋CaptureAb，100ul/孔，濕盒4℃過夜；洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，3×3min，控干；封閉：加1×Assaydiluent200ul/孔，37℃避光孵育2h；洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；5.加樣：100ul/孔，37℃避光孵育1h；6.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:用1×Assaydiluent1:1000稀釋detectionAb，100ul/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；9.Avidin-HRP:用1×Assaydiluent

1:250稀釋AV-HRP，100ul/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，5×3min，控干；11.顯色：1×TMBsolution，100ul/孔，37℃孵育1-30min；12.終止反應(yīng)：顯色完全后加2MH2SO450ul/孔，終止顯色反應(yīng)；于450nm處讀取光密度OD值或吸光度A值；13.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析數(shù)據(jù)第30頁/共42頁2.洗滌

次日，棄去孔內(nèi)液體，用0.05%PBST洗板3次（將PBST加入每孔，靜置3min后傾去），控干，洗去游離抗體。濕盒中，4℃過夜酶標(biāo)板1.包被(NotePBST洗滌液:0.05%Tween-20-PH7.41×PBS)

1×Coatingbuffer1:1000稀釋CaptureAb，

100μl/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜(或保鮮膜等）封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中，4℃過夜。

第31頁/共42頁

1×Assaydiluent，200μl/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中，37℃避光孵育2h。4.洗滌

棄去孔內(nèi)液體，用0.05%PBST洗板4次，（將PBST加入每孔，靜置3min后傾去）；控干；37℃避光孵育2h3.封閉（Note1×Assaydiluent：用純水將5×Assaydiluent稀釋至1×）

以上助教老師負(fù)責(zé)完成第32頁/共42頁5.加樣----抗原與抗體孵育

1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

1×Assaydiluent倍比稀釋standard，每個(gè)梯度各取100μl加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔；

2）待測樣品：取100μl待測樣品加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔；

3）空白對照：取100μl1×Assaydiluent加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔；37℃避光孵育1h50ulStandard原液?

?

1/8

1/161/32第33頁/共42頁待測抗原100μl空白對照陽性對照每組4位同學(xué)的加樣順序：待測抗原100μl待測抗原100μl樣本有4種，每人選一種做復(fù)孔每組做陽參2個(gè)孔每組做空白對照2個(gè)孔（加樣1×Assaybuffer）每孔加樣100μl待測抗原100μl第34頁/共42頁6.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:

用1×Assaydiluent1:1000稀釋detectionAb，100μl/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，4×3min，控干；9.Avidin-HRP(HRP見光分解，之后所有步驟避光操作）用1×Assaydiluent

1:250稀釋AV-HRP，100μl/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，5×3min，控干；第35頁/共42頁11.顯色：1×TMBsolution，100μl/孔，37℃孵育