抗體藥物活性評(píng)價(jià)的傳統(tǒng)方法和前沿技術(shù),免疫學(xué)論文

抗體藥物活性評(píng)價(jià)的傳統(tǒng)方法和前沿技術(shù),免疫學(xué)論文單克隆抗體作為治療藥物始于上世紀(jì)80年代初，因其具有高度的特異性、有效性和安全性的特點(diǎn)，在惡性腫瘤、本身免疫性疾病、感染和器官移植排擠等多種疾病中獲得了較好的治療效果，現(xiàn)已成為推動(dòng)全球生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的引擎。截至2020年11月，已有50個(gè)抗體類藥物上市。2020年全球銷售排名前十位的處方藥中有6個(gè)為抗體類藥物，分別是Humira、Remicade、Mabthera、Enbrel、Avastin和Herceptin,單品種銷售額均超過50億美元[1].抗體藥物的接連上市和重磅銷售引發(fā)國(guó)內(nèi)外抗體類生物治療藥物的研發(fā)熱潮。完善的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)是抗體類藥物批準(zhǔn)上市的必要條件，面對(duì)抗體類藥物的快速發(fā)展，迫切需要建立相應(yīng)的抗體藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)體系，而活性測(cè)定是對(duì)藥物的有效成分和含量以及藥物效價(jià)的測(cè)定，是確?？贵w類藥物有效性的重要質(zhì)控指標(biāo)。抗體與其特異的靶點(diǎn)結(jié)合后，通過細(xì)胞因子信號(hào)的阻斷、補(bǔ)體系統(tǒng)的活化、細(xì)胞殺傷等生物學(xué)作用發(fā)揮重組抗體的治療作用，其生物學(xué)活性測(cè)定主要是在體外建立相應(yīng)的細(xì)胞評(píng)價(jià)模型，模擬其作用機(jī)制，產(chǎn)生客觀的全程量效反響，并通過與活性標(biāo)準(zhǔn)品的比擬對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)[2].近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞技術(shù)和一些新技術(shù)也被應(yīng)用于抗體類藥物的生物學(xué)活性測(cè)定。本文將對(duì)應(yīng)用于抗體藥物活性評(píng)價(jià)的傳統(tǒng)方式方法和前沿技術(shù)進(jìn)行扼要介紹，為新型抗體藥物活性方式方法的建立提供新的思路。1基于細(xì)胞的生物活性測(cè)定方式方法隨著藥物高通量挑選平臺(tái)的建立和生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，以及對(duì)3R〔Reduction,Refinement,Replacement〕原則理解的不斷深化，人們?cè)絹?lái)越多地尋求動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方式方法。而基于細(xì)胞系的體外生物活性分析方式方法由于其高通量、高效率、高精到準(zhǔn)確度等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越遭到研究者和生產(chǎn)企業(yè)的青睞。單克隆抗體藥物的作用靶點(diǎn)分為細(xì)胞因子及其受體、腫瘤細(xì)胞外表抗原、CD分子、病原微生物及其產(chǎn)物、以及其他靶點(diǎn)，根據(jù)抗體藥物作用的特點(diǎn)，當(dāng)前主要有下面幾類基于細(xì)胞的測(cè)活方式方法。1.1細(xì)胞增殖抑制法針對(duì)生長(zhǎng)因子靶點(diǎn)的抗體藥物多是采用細(xì)胞增殖抑制的方式方法來(lái)反映抗體的生物學(xué)活性，包括抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子〔vascularendothelialgrowthfactor,VEGF〕單抗、抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2〔humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2〕單抗及抗人表皮生長(zhǎng)因子受體〔epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR或HER1〕單抗等。華而不實(shí)抗VEGF單抗的經(jīng)典測(cè)活方式方法是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞〔humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC〕增殖抑制法，即在刺激因子VEGF存在的情況下，抗VEGF單抗能夠以劑量依靠性的方式抑制HUVEC細(xì)胞的增殖?？笻ER2單抗[3]的活性測(cè)定通常選取HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞，如BT474、SK-BR-3、SKOV3等作為靶細(xì)胞，抗體與靶細(xì)胞外表HER2抗原結(jié)合后，能夠有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)傳遞，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。抗EGFR靶點(diǎn)單抗[4]也是通過特異結(jié)合并封閉表皮生長(zhǎng)因子受體，有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如DiFi細(xì)胞、A431細(xì)胞增殖抑制法等。1.2細(xì)胞毒性法細(xì)胞凋亡有兩條途徑，一是線粒體依靠途徑，另一個(gè)為死亡受體介導(dǎo)途徑。腫瘤壞死因子-〔tumornecrosisfactor-alpha,TNF-〕和受體結(jié)合后，可啟動(dòng)死亡受體介導(dǎo)途徑，使procaspe-8自我水解、活化，構(gòu)成活性caspase-8,后者再激活caspase3、6、7等，引起下面的級(jí)聯(lián)反響，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[5].重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白的活性測(cè)定能夠利用其能夠抑制TNF-所引起的敏感細(xì)胞系U-937中caspase3/7活化，通過Caspase-Glo3/7檢測(cè)試劑盒中螢光素酶發(fā)光信號(hào)的改變來(lái)反映該制品的活性。除此之外，針對(duì)TNF-的單抗還能夠采用對(duì)TNF-殺傷敏感的細(xì)胞系，如小鼠成纖維細(xì)胞L929、小鼠纖維肉瘤細(xì)胞WEHI164等，抗體能夠抑制TNF-所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，通過檢測(cè)細(xì)胞存活的染色來(lái)評(píng)價(jià)抗體的生物學(xué)活性。在細(xì)胞存活相關(guān)染料的選擇上，包括結(jié)晶紫、MTT、MTS、CCK-8等在內(nèi)的染料具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)晶紫是一種三苯甲烷類染料，常用作生物染色劑和無(wú)機(jī)離子的顯色劑。其染色經(jīng)過固然相對(duì)簡(jiǎn)單，但是不能區(qū)分死活細(xì)胞，只能反映細(xì)胞數(shù)量。而MTT作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞復(fù)原成水不溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，因而可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，但MTT復(fù)原產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。MTS復(fù)原產(chǎn)物是水溶性的甲臜，無(wú)需洗滌和溶解步驟，使用更方便，重復(fù)性優(yōu)于MTT.而CCK-8溶液能夠直接參加到細(xì)胞樣品中，溶液相當(dāng)穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞沒有毒性，可長(zhǎng)時(shí)間孵育，是用于測(cè)定細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖試驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、重復(fù)性好的染料。1.3補(bǔ)體依靠的細(xì)胞毒法〔complementdependentcytotoxicity,CDC〕單抗藥物與靶細(xì)胞外表分子結(jié)合后，可介導(dǎo)補(bǔ)體C1q結(jié)合到抗體的Fc段，并于腫瘤細(xì)胞膜上構(gòu)成類似于穿孔素效應(yīng)的攻膜復(fù)合體〔membraneattackcomplex,MAC〕,造成細(xì)胞外離子大量?jī)?nèi)流，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的溶解。CDC生物學(xué)活性測(cè)定中一個(gè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是補(bǔ)體的選擇及對(duì)其質(zhì)量的控制，補(bǔ)體組分多，且熱不穩(wěn)定，容易失活，當(dāng)前所用的補(bǔ)體來(lái)源包括正常人血清、豚鼠、家兔等，來(lái)源復(fù)雜、劑型不同，因而在CDC實(shí)驗(yàn)中需要考慮補(bǔ)體效力、穩(wěn)定性，盡量減少活性測(cè)定反響終點(diǎn)和測(cè)定結(jié)果的變異。以CD〔clusterofdifferentiation〕分子為靶點(diǎn)的單抗藥物，如抗CD20單抗[6]、抗CD52單抗等，其生物學(xué)活性評(píng)價(jià)方式方法主要為CDC活性測(cè)定，即將重組抗體進(jìn)行系列稀釋后與高表示出相應(yīng)CD抗原的靶細(xì)胞結(jié)合，在補(bǔ)體存在的情況下，抗體與細(xì)胞外表抗原構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物，激活補(bǔ)體經(jīng)典活化途徑，完成攻膜復(fù)合物的裝配并在細(xì)胞外表打孔，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解。利用上述檢測(cè)細(xì)胞存活的染料能夠?qū)贵w的CDC作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。1.4抗體依靠性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性法〔antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC〕單抗藥物通過Fc段介導(dǎo)的免疫效應(yīng)除了CDC作用外，另外一個(gè)重要的效應(yīng)即是抗體依靠性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用〔ADCC〕.傳統(tǒng)的ADCC檢測(cè)方式方法多為基于新鮮制備的外周血單個(gè)核細(xì)胞〔peripheralbloodmononuclearcell,PBMC〕或者自然殺傷細(xì)胞〔naturalkiller,NK〕作為效應(yīng)細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)，以上方式方法存在細(xì)胞分離和培養(yǎng)困難、變異大、操作繁瑣、高背景值等缺陷[7].研究表示清楚，在NK細(xì)胞中Fc受體〔FcR〕活化，尤其是FcRIIIa受體〔CD16〕活化能夠引起NFAT〔nuclearfactorofactivatedT-cells〕信號(hào)通路的激活。近年來(lái)基于報(bào)告基因法已建立了穩(wěn)定而可靠的抗CD20單抗的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞ADCC評(píng)價(jià)方式方法。該方式方法以WIL2-S細(xì)胞系〔人B淋巴細(xì)胞〕作為靶細(xì)胞，使用工程改造的Jurkat細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，該細(xì)胞穩(wěn)定表示出了FcRIIIa受體和由NFAT應(yīng)答元件驅(qū)動(dòng)表示出的熒光素酶報(bào)告基因。當(dāng)高表示出CD20抗原的靶細(xì)胞與表示出FcRIIIa受體的Jurkat細(xì)胞通過抗CD20單抗橋聯(lián)時(shí)，可引起NFAT熒光素酶報(bào)告基因的活化，通過檢測(cè)熒光素酶化學(xué)發(fā)光信號(hào)來(lái)反映抗體的ADCC效應(yīng)[8].該方式方法操作簡(jiǎn)便易行，專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，可作為抗CD20單抗ADCC生物學(xué)活性的常規(guī)檢查方式方法，用于評(píng)價(jià)包括人鼠嵌合單抗、人源化單抗、全人源單抗和糖基化改造單抗在內(nèi)的各類抗CD20單抗的ADCC活性；更重要的是該方式方法可用于評(píng)價(jià)糖基化修飾與抗CD20單抗功能的關(guān)系，這也為該類制品工藝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)及構(gòu)造與功能關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。1.5細(xì)胞ELISA法除了檢測(cè)抗體對(duì)細(xì)胞的增殖和毒性作用外，還能夠通過ELISA法[9]測(cè)定靶細(xì)胞與抗體及刺激因子共培養(yǎng)后分泌的細(xì)胞因子來(lái)評(píng)價(jià)抗體的生物學(xué)活性。例如抗IL-17單抗能夠根據(jù)其抑制IL-17誘導(dǎo)靶細(xì)胞釋放IL-6或GRO等細(xì)胞因子的能力來(lái)評(píng)價(jià)其生物學(xué)活性。將IL-17和IL-17單抗以及靶細(xì)胞接種到96孔板上，培養(yǎng)過夜。再通過ELISA法定量測(cè)定細(xì)胞上清液中分泌的細(xì)胞因子的含量，細(xì)胞因子的含量與抗體活性成反比。2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生物活性測(cè)定方式方法由于很多生物技術(shù)藥物沒有強(qiáng)反響性的細(xì)胞系，或者沒有易檢測(cè)的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株成了很好的選擇。構(gòu)建藥物反響性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株是根據(jù)藥物的作用機(jī)制來(lái)制定方案的。首先應(yīng)該全面深切進(jìn)入地研究藥物的作用機(jī)制，包括受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)傳遞以及終效應(yīng)，選擇適宜的靶標(biāo)作為藥物活性測(cè)定的指標(biāo)。當(dāng)前國(guó)內(nèi)在建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞法測(cè)定生物治療藥物生物學(xué)活性領(lǐng)域已走在世界的前列。中國(guó)食品藥品檢定研究院通太多年的技術(shù)儲(chǔ)備，通過體外模擬創(chuàng)新藥作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以導(dǎo)入藥物作用受體、報(bào)告基因或效應(yīng)分子為策略，率先構(gòu)建了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、非生物安全、動(dòng)物替代的系列轉(zhuǎn)基因活性評(píng)價(jià)模型，華而不實(shí)干擾素測(cè)活的熒光素酶報(bào)告基因法，克制了國(guó)際通用的病毒抑制法中由操作活病毒導(dǎo)致的缺點(diǎn)，并使檢測(cè)周期縮短至原來(lái)的1/3[10];腦利鈉肽測(cè)活的第二信使cGMP競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法，與傳統(tǒng)的家兔主動(dòng)脈條法相比，變異系數(shù)由66%降至13%[11];促紅細(xì)胞生成素的熒光素酶報(bào)告基因法無(wú)需復(fù)雜的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并可獲得與傳統(tǒng)體內(nèi)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法高度一致的評(píng)價(jià)結(jié)果[12].系列研究成果實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞理念用于解決一類新藥測(cè)活和傳統(tǒng)測(cè)活方式方法改良的突破，為保證用藥的安全性和時(shí)效性，提高檢驗(yàn)質(zhì)量提供了保障。當(dāng)前國(guó)際上已有多個(gè)靶點(diǎn)的單克隆抗體藥物應(yīng)用報(bào)告基因法進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定[13].例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑〔VEGFTrap〕的活性測(cè)定方式方法是在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NFB熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和2個(gè)嵌合受體基因。這2個(gè)嵌合受體是將VEGF受體1〔VEGFR1〕胞外區(qū)分別與IL-18受體〔IL-18R〕和IL-18受體〔IL-18R〕胞內(nèi)區(qū)融合而成。VEGF與VEGFR1結(jié)合后發(fā)生二聚化，使得IL-18R和IL-18R胞內(nèi)構(gòu)造域互相作用，并傳遞信號(hào)，引起NFB熒光素酶報(bào)告基因活化；而VEGFTrap能夠抑制VEGF所引起NFB通路的激活[14-15].針對(duì)PD-1靶點(diǎn)的抗體是國(guó)內(nèi)外新抗體研發(fā)的熱門，PD-1表示出于活化的T細(xì)胞，當(dāng)與配體PD-L1和PD-L2結(jié)合后，可抑制T細(xì)胞的增殖以及相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16].當(dāng)前抗PD-1單抗大多采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法來(lái)評(píng)價(jià)其結(jié)合活性，各研發(fā)單位也在積極探尋求索穩(wěn)定而可靠的抗PD-1單抗細(xì)胞生物學(xué)活性評(píng)價(jià)新方式方法。例如利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NFAT報(bào)告基因/PD-1的Jurkat細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，高表示出PD-L1的CHO或HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系作為靶細(xì)胞。通過微孔板包被的抗CD3抗體充分激活Jurkat后，將系列梯度稀釋的PD-1或PD-L1單抗與兩株細(xì)胞系經(jīng)過一定時(shí)間的孵育后，通過熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)抗PD-1或PD-L1單抗的生物學(xué)活性。除此之外另一個(gè)免疫調(diào)節(jié)類的熱門抗體是針對(duì)T細(xì)胞外表的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4〔CytotoxicT-LymphocyteAntigen4,CTLA4〕的抗體，它能夠阻止CTLA-4與其配體〔B7.1/CD80,B7.2/CD86〕結(jié)合，進(jìn)而恢復(fù)CD28-B7共刺激信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)[14].針對(duì)CTLA-4單抗的生物學(xué)活性測(cè)定能夠基于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-2啟動(dòng)子報(bào)告基因的Jurkat細(xì)胞，在DaudiB細(xì)胞和抗CD3抗體的共同刺激下，抗CTLA-4單抗能夠激活Jurkat細(xì)胞中IL-2信號(hào)通路，啟動(dòng)熒光素酶表示出，通過熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行該抗體生物學(xué)活性評(píng)價(jià)。3基于新技術(shù)的生物學(xué)活性測(cè)定方式方法3.1外表等離子共振〔SurfacePlasmonResonance,SPR〕效價(jià)測(cè)定法外表等離子共振現(xiàn)象是發(fā)生在兩種折射率不同的介質(zhì)界面上的一種光學(xué)現(xiàn)象，最早于1902年由Wood發(fā)現(xiàn)，并由Otto和Kretschmann等在1968年對(duì)其原理進(jìn)行了詳盡的闡述。簡(jiǎn)單而言，當(dāng)光源的一束入射光從高折射率介質(zhì)〔如玻璃〕射向低折射率介質(zhì)〔如溶液〕的界面時(shí)，假如入射角大于一定的臨界角，入射光將會(huì)被100%地反射至光源的同一側(cè)，這叫做全內(nèi)反射現(xiàn)象。當(dāng)兩種介質(zhì)之間有一層極薄的金屬膜〔最為常見的50nm金膜〕,這時(shí)入射光的能量將會(huì)引起金膜中等離子體的共振并以一種電磁場(chǎng)〔稱作消逝波〕的方式彌散至低折射率介質(zhì)一側(cè)〔如溶液〕,進(jìn)而導(dǎo)致反射光的能量在某個(gè)特定的角度降至最低〔圖1〕,這一角度被稱作SPRdip角。外表等離子共振作為一種生物傳感器技術(shù)廣泛地應(yīng)用于分子互相作用分析領(lǐng)域，當(dāng)分子間發(fā)生結(jié)合或者解離時(shí)，會(huì)定量改變金膜外表附近分子的濃度，進(jìn)而導(dǎo)致金膜附近折射率的變化，進(jìn)而導(dǎo)致SPRdip角的改變，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SPRdip角度的變化，就能夠?qū)崟r(shí)分析分子間的結(jié)合與解離經(jīng)過。該技術(shù)無(wú)需預(yù)先標(biāo)記熒光、二抗的分子，避免了標(biāo)記基團(tuán)對(duì)分子構(gòu)象的影響，進(jìn)而反映出分子間真實(shí)的結(jié)合性質(zhì)；該技術(shù)樣品消耗量低，一般僅有微克級(jí)；除了獲取一般的親和力信息外，還能夠給出對(duì)闡述分子間結(jié)合機(jī)理更為難得珍貴的動(dòng)力學(xué)信息。SPR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小分子制藥和生物制藥領(lǐng)域[17-18],在抗體分析領(lǐng)域，其應(yīng)用主要包括：〔1〕抗體候選物的挑選與評(píng)價(jià)，如從雜交瘤上清液中挑選出解離速率最慢的抗體分子；〔2〕抗體與抗原結(jié)合活性的分析，如人源化葉酸受體單抗與重組人葉酸受體的動(dòng)力學(xué)與親和力[19];〔3〕抗體與受體結(jié)。合活性的分析，如抗體與FcRIIIa,FcRIIIb等受體結(jié)合的親和力、動(dòng)力學(xué)信息；〔4〕抗體活性濃度分析，包括基于標(biāo)準(zhǔn)品的活性成分濃度分析和無(wú)需依靠標(biāo)準(zhǔn)品的活性成分濃度分析方式方法；〔5〕安全性評(píng)價(jià)中的免疫原性分析；〔6〕生物類似藥一致性分析。3.2均相時(shí)間分辨熒光〔HomogeneousTime-ResolvedFluorescence,HTRF〕均相時(shí)間分辨熒光是用來(lái)檢測(cè)純液相體系中待測(cè)物的一種常用方式方法，也是用來(lái)研究藥物靶標(biāo)的理想平臺(tái)[20].該技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移〔FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET〕和時(shí)間分辨熒光〔Time-ResolvedFluorescence,TRF〕兩種技術(shù)。這種結(jié)合將FRET的均相實(shí)驗(yàn)方式和TRF的低背景特點(diǎn)融合在一起，使得HTRF技術(shù)擁有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、通量大、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠、假陽(yáng)性率較低的優(yōu)勢(shì)。在HTRF實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)供體和受體相離很近時(shí)，在供體和受體之間會(huì)有熒光共振能量轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生信號(hào)。采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)能夠顯著減小緩沖液和培養(yǎng)基的干擾，最終的信號(hào)與產(chǎn)物構(gòu)成的量成比例。HTRF技術(shù)進(jìn)入藥物研發(fā)領(lǐng)域以來(lái)，加快了很多基于抗體的研究，HTRF技術(shù)可以以取代大部分ELISA,由于HTRF具有同等的檢測(cè)范圍和檢測(cè)極限，而且更節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且不需要洗板的步驟，所以該技術(shù)近年來(lái)已被應(yīng)用于抗體的活性檢測(cè)。例如，抗肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子〔hepatocytegrowthfactor,HGF〕單抗的結(jié)合活性測(cè)定就是一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制受體-配體結(jié)合的效價(jià)測(cè)定。通過鑭系元素螯合物均相時(shí)間分辨熒光法〔LANCEHTRF〕測(cè)定抗HGF單抗與HGF結(jié)合，并阻止HGF結(jié)合至其受體的能力。在測(cè)定中，將銪標(biāo)記的HGF受體〔hu-HGFR-Eu〕結(jié)合至生物素標(biāo)記的HGF〔biotin-huHGF〕,后者結(jié)合至鏈霉親和素-別藻藍(lán)蛋白〔SA-APC〕.該結(jié)合誘導(dǎo)銪和APC分子接近，而使熒光發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，通過具有檢測(cè)HTRF功能的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)?？笻GF單抗能夠抑制biotin-huHGF結(jié)合至hu-HGFR-Eu,并阻止能量轉(zhuǎn)移，因而降低了熒光信號(hào)輸出，即抗體的量與產(chǎn)生的熒光量呈負(fù)相關(guān)。3.3Alpha技術(shù)〔AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay〕該技術(shù)既可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)各個(gè)Biomarker,可以進(jìn)行各類分子互相作用研究[21],簡(jiǎn)單可靠。近年來(lái)，Alpha技術(shù)也應(yīng)用于抗體的活性檢測(cè)，該技術(shù)主要含有兩種微珠，一種為供體，另一為受體。當(dāng)供體微珠所帶有的抗原分子〔A〕與受體微珠所帶有的抗體分子〔B〕距離非常接近時(shí)，能夠使用680nm激發(fā)光去引發(fā)其外表所帶有的光敏感物質(zhì)，使其催化周圍的氧分子構(gòu)成活化態(tài)，產(chǎn)生效率可達(dá)每秒60000個(gè)氧分子活化態(tài)產(chǎn)生，借此將訊號(hào)放大，此活化態(tài)氧分子再與鄰近的受體微珠上的二甲基噻吩化合物產(chǎn)生化學(xué)冷光反響，產(chǎn)生冷光效應(yīng)〔波長(zhǎng)大約370nm〕,此冷光進(jìn)一步借由能量轉(zhuǎn)換激發(fā)讓受體微珠產(chǎn)生520~620nm的發(fā)散光熒光信號(hào)，由于氧分子活化態(tài)非常不穩(wěn)定，此反響相當(dāng)快速僅4s,加上若此二種微珠距離超過200nm,反響隨之下降，所以只要抗原抗體分子結(jié)合才能觸發(fā)反響，通過測(cè)定熒光量來(lái)反映抗體的活性〔圖2〕3.4熒光染料標(biāo)記法熒光染料標(biāo)記法具有靈敏度高、選擇性高、方式方法簡(jiǎn)便快速、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)藥、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保衛(wèi)等領(lǐng)域中。應(yīng)用在抗體活性檢測(cè)中，熒光染料能夠標(biāo)記分子或細(xì)胞。〔1〕熒光染料標(biāo)記細(xì)胞：熒光染料作為熒光檢測(cè)分析方式方法的載體，其性能的優(yōu)劣直接決定了檢測(cè)方式方法的可行性及靈敏性。Calcein-AM〔鈣黃綠素-AM〕是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，Calcein-AM由于在Calcein〔鈣黃綠素〕的基礎(chǔ)上加強(qiáng)了疏水性，因而能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會(huì)將其水解為Calcein〔鈣黃綠素〕留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑〔如BCECF-AM和Carboxy-fluoresceindiacetate〕相比，Calcein-AM是最合適作為熒光探針去標(biāo)記活細(xì)胞的，由于它的細(xì)胞毒性很低。Calcein〔鈣黃綠素〕不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖或趨化性等?！?〕熒光染料標(biāo)記分子：BODIPY〔氟化硼二吡咯〕類熒光染料作為一類新型的熒光染料，因其良好的光物理性質(zhì)，在過去的二十年內(nèi)得到廣泛的研究。與其它的熒光染料相比，BODIPY類熒光染料具有較窄的吸收和發(fā)射峰、較高的摩爾吸光系數(shù)、較高的光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性以及較高的熒光量子產(chǎn)率等。例如，抗PCSK9單抗的的生物活性測(cè)定即是用BODIPY標(biāo)記的低密度脂蛋白〔LDL〕通過HepG2細(xì)胞來(lái)測(cè)定其生物活性。PCSK9是前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9,能與低密度脂蛋白受體〔LDLR〕直接結(jié)合，促使LDLR內(nèi)化和降解。降低肝細(xì)胞上LDLR的數(shù)量能夠降低肝臟從循環(huán)中去除LDL的能力。抗PCSK9抗體能夠與PCSK9結(jié)合，阻滯PCSK9與LDLR結(jié)合，增加LDLR數(shù)目，進(jìn)而增加HepG2細(xì)胞中BODIPY標(biāo)記的LDL熒光量。4生物學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在生物活性的定量測(cè)定中，一般有兩種反響類型，一種是直線性反響，另一種是曲線性反響。關(guān)于選擇何種擬合模型和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件更適宜的問題，主要從反響的實(shí)際曲線、擬合優(yōu)度和簡(jiǎn)便性三個(gè)方面考慮[22].目前美國(guó)藥典〔UnitedStatesPharmacopeia,USP〕、歐洲藥典〔EuropeanPharmacopeia,EP〕等比擬常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件包括UNISTAT、CombiStats、StatLIA、PLA、4-Parameter等。PLA2.0是一個(gè)不受硬件約束的，商業(yè)化的生物學(xué)分析軟件。它是Stegmannsystem的主要產(chǎn)品，當(dāng)前有200余家公司在GMP環(huán)境下使用該軟件。該軟件基于歐洲藥典5.3版、美國(guó)藥典和其他科學(xué)出版物。StatLIAQuantum統(tǒng)計(jì)軟件在使用規(guī)模，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存，可使用范圍，統(tǒng)計(jì)分析，人性化報(bào)告上具有很好的優(yōu)勢(shì)，可用于活性檢測(cè)、定量檢驗(yàn)、免疫原性質(zhì)量挑選等方面。CombiStat軟件是由EDQM〔EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicinesHealthCare〕研發(fā)，包括平行線分析、四參數(shù)和五參數(shù)、sloperatiomodel、probitmodel等，在歐洲應(yīng)用廣泛。我們國(guó)家研發(fā)單位對(duì)于生物學(xué)活性的評(píng)價(jià)應(yīng)用四參數(shù)〔4-Parameter〕模型擬合的較多，其數(shù)據(jù)呈典型的S型曲線，可反映出上下漸近線、EC50值和斜率等指標(biāo)。USP、EP等國(guó)外藥典都強(qiáng)調(diào)生物統(tǒng)計(jì)在生物學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用及其重要性，尤其是在數(shù)據(jù)類型和分析形式、數(shù)據(jù)采集、穩(wěn)定性試驗(yàn)和離散度的選擇方面對(duì)于生物學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和發(fā)展至關(guān)重要。然而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段在2018年版(中國(guó)藥典〕三部治療性生物制品活性測(cè)定中的應(yīng)用是總體基本缺失的，這個(gè)問題在將來(lái)應(yīng)充分重視。5結(jié)語(yǔ)分子生物學(xué)的快速發(fā)展和細(xì)胞信號(hào)通路的深切進(jìn)入研究促進(jìn)了基于細(xì)胞的生物活性測(cè)