GB 15193.20-2003TK基因突變試驗

ICS07.100C53中華人民共和國國家標準GB15193.20—2003TK基因突變試驗TKgenemutationtest2003-09-24發(fā)布2004-05-01實施中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布中國國家標準化管理委員會

GB15193.20—2003本標準全文強制。本標準參考美國FDA營養(yǎng)素補充劑與食品安全中心食品添加劑安全辦公室發(fā)布的“食品成分安全評價毒理學原則2000年版紅皮書(2001年9月發(fā)布)：IV.C.1.c.小鼠淋巴瘤胸腺喀啶激酶基因突變試驗(IV.C.1.c,MouselymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssay)”。本標準由中華人民共和國衛(wèi)生部提出并歸口.本標準起草單位：四川大學華西公共衛(wèi)生學院、中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所本標準主要起草人：張立實、張建清、帥培強、王怡凈。本標準首次發(fā)布。

GB15193.20—2003TK基因突變試驗范圍本標準規(guī)定了體外哺乳類細胞TK位點基因突變試驗的基本技術要求與方法本標準適用于評價食品生產、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學生物和物理因素的遺傳毒性，檢驗對象包括食品添加劑(含營養(yǎng)強化劑)、食品新資源及其成分、新資源食品、輻照食品、食品容器與包裝材料、食品工具、設備、洗滌劑、消毒劑、農藥殘留、獸藥殘留、食品工業(yè)用微生物等。2原理TK基因突變試驗的檢測終點是胸苷激酶(thymidinekinase,TK)基因的突變。在人類，TK基因定位于17號染色體長臂遠端;在小鼠則定位于11號染色體。故TK基因的突變屬于常染色體基因TK基因的產物胸苷激酶在體內催化從脫氧胸苷（TdR)生成胸苔酸（TMP)的反應。在正常情況下,此反應并非生命所必需，原因是體內的「MP主要來自于脫氧尿喀啶核苷酸(dUMP).即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應生成TMP。但如在細胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物（如三氟胸苷,即TFT一trifluorothymidine),則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸,進而摻入DNA,造成致死性突變，故細胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變,導致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA,故細胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù),計算突變頻率，以判定受試物的致突變性。3試劑與材料3.1細胞：15178Y「k+-3.7.2C小鼠淋巴瘤細胞。為清除自發(fā)突變的k--基因型細胞,在正式實驗前，應使用含3g/mL胸甘,5g/mL次黃驃嶺,0.1Pg/mL氮甲碟嶺和7.5g/ml甘氮酸的THMG培養(yǎng)基中處理24h,離心、洗滌后在不含氨甲碟嶺的THMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天.3.2試劑：PBS磷酸鹽緩沖液，三氟胸香（trifluorothymidine）,次黃原吟（hypoxanthine）.甘氨酸（gly-cine），氨甲碟嶺(methotrexate),胸腺喀啶核苷(thymidine),陽性對照物(MMS,MMC,環(huán)磷酰胺等)。試驗設計-般應進行細胞毒性預試驗，根據(jù)預試驗結果，在相對存活率(relativesurvival,RS)為陰性對照組的20%～80%范圍內設3個～4個劑量(濃度)水平。每次試驗均需設陰性(雙蒸水)對照.通常亦需設陽性對照。陽性對照通常使用MMS、EMS、MMC、CP(環(huán)磷酰胺)等。如使用非水溶劑,則亦需設溶劑對照。5操作步驃5.1培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件：含10%馬血清和適量抗菌素的RPMI1640培養(yǎng)液(96孔板培養(yǎng)時使用含20%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)液).5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下作常規(guī)懸浮培養(yǎng)。5.2處理:取生長良好的細胞.調整密度為5×10°/mL,按1%體積加入受試物.3