基因工程的基本操作順序

1、基因工程至少需要哪三種工具？2、這三種工具分別起什么作用？溫故知新：1.2基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定問(wèn)題1一：目的基因的獲取

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。

1.目的基因主要是指___________________編碼蛋白質(zhì)的基因什么是目的基因？2、也可以是具有調(diào)控作用的因子獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)1.基因文庫(kù)概念2.基因文庫(kù)類型基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢?

根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA、基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因3.基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼敢欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)4.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。cDNA合成過(guò)過(guò)程是：：第一步，，反轉(zhuǎn)錄錄酶以RNA為為模板合合成一條條與RNA互補(bǔ)的DNA單單鏈，形形成RNA-DNA雜雜交分子子。第二步，，核酸酶酶H使RNA-DNA雜交分分子中的的RNA鏈降解，使使之變成成單鏈的的DNA。第三步，，以單鏈鏈DNA為模板板，在DNA聚聚合酶的的作用下下合成另另一條互互補(bǔ)的DNA鏈鏈，形成成雙鏈DNA分分子。問(wèn)題2為什么用用生物發(fā)發(fā)育某個(gè)個(gè)時(shí)期的的mRNA反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄得的的DNA只有這這種生物物的部分分基因？？某個(gè)時(shí)期期的發(fā)育育是基因選擇擇性表達(dá)達(dá)的結(jié)果兩種基因因文庫(kù)的的主要區(qū)區(qū)別如下下表（課課本P10）文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小小大基因中啟動(dòng)子無(wú)有基因中內(nèi)含子無(wú)有基因多少部分基因全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以總結(jié)1、概念念：PCR全稱稱為________________，，是一項(xiàng)項(xiàng)在生物____復(fù)制制_____________的核核酸合成成技術(shù)3、條件件：2、原理理：__________多聚酶鏈鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制(二)利利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的的基因模板（目的基基因）原料(脫氧核核苷酸)引物（一小段段單鏈DNA））DNA聚聚合酶（（耐高溫溫）溫度控制制4、操作作前提：：一段已知知目的基基因的核核苷酸序序列，以以便合成成引物。。6、結(jié)果果。5、擴(kuò)增增形式：：指數(shù)形式式（2n）在短時(shí)間間內(nèi)大量量擴(kuò)增目目的基因因7、過(guò)程程：a、變性性（90℃℃-95℃）：：雙鏈DNA模模板在熱熱作用下，_____斷裂裂，形成成___________b、復(fù)性性（55℃℃-60℃）：：系統(tǒng)溫溫度降低低，引物物與DNA模模板結(jié)合合，形成成局部________。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在Taq酶的的作用下下，從引物開始始進(jìn)行堿堿基互補(bǔ)補(bǔ)配對(duì)，，合成與與模板互補(bǔ)補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈(二)利利用PCR技術(shù)術(shù)擴(kuò)增目目的基因因動(dòng)畫演演示細(xì)胞內(nèi)復(fù)復(fù)制.VS.PCR擴(kuò)擴(kuò)增DNA母母鏈4種脫氧氧核苷酸酸TaqDNA聚合酶酶引物（2個(gè)snDNA）溫度控制制1）模板板：2）原料料：3）酶：：DNA母母鏈4種脫氧氧核苷酸酸解旋酶DNA聚聚合酶引物酶DNA連連接酶DNA增增殖4）特點(diǎn)點(diǎn):半保留復(fù)復(fù)制邊解旋邊邊復(fù)制(不用DNA連連接酶)半保留復(fù)復(fù)制全解旋再再?gòu)?fù)制（三）通通過(guò)DNA合成成儀直接接合成目目的基因因DNA合成儀推測(cè)推測(cè)合成前提：基因比較較小、核核苷酸序序列已知知蛋白質(zhì)的的氨基酸酸順序mRNA核苷酸酸序列基因DNA的核核苷酸序序列目的基因問(wèn)題43、如果果不知道道目的基基因的核核苷酸序序列，可可采用_________________獲取目的基因因的三種方法法應(yīng)用1、如果知道道目的基因兩兩端的核苷酸酸序列，而且且基因比較大大，可采用____________2、如果知道道目的基因的的序列，而且且基因比較小小，可采用________________PCR技術(shù)擴(kuò)擴(kuò)增化學(xué)方法人工工合成從基因文庫(kù)獲獲取的方法二：基因表達(dá)達(dá)載體的構(gòu)建建——基因工工程的核心1目的：使目的基因在在受體細(xì)胞中中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代代，同時(shí)使目的的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因等啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的的DNA片斷斷，RNA聚合酶酶識(shí)別和結(jié)合的的部位終止子：位于基因的尾端的一段特殊的的DNA片斷斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是是否含有目的的基因，從而而將有目的基基因的細(xì)胞篩選出來(lái)3.基因表達(dá)達(dá)載體的構(gòu)建建過(guò)程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口四個(gè)黏性末端端DNA連接酶酶重組DNA分分子（重組質(zhì)質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端端跟蹤訓(xùn)練(2012年江蘇無(wú)錫高高二檢測(cè))如圖為基因表表達(dá)載體的模模式圖，下列列有關(guān)基因工工程中載體的的說(shuō)法錯(cuò)誤的的是()A．基因工程程的核心步驟驟是基因表達(dá)達(dá)載體構(gòu)建B．任何基因因表達(dá)載體的的構(gòu)建都是一一樣的，沒(méi)有差差別C．圖中啟動(dòng)動(dòng)子位于基因因的首端，是是RNA聚合酶酶識(shí)別和結(jié)合合的部位D．抗生素抗抗性基因的作作用是作為標(biāo)標(biāo)記基因，用于于鑒別受體細(xì)細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的的基因B三、將目的基基因?qū)胧荏w體細(xì)胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。2常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞一般是體細(xì)胞受精卵一般原核細(xì)胞4、目的基因?qū)?dǎo)入受體細(xì)胞胞的方法為什么動(dòng)物細(xì)細(xì)胞要用受精精卵做受體細(xì)細(xì)胞？全能性受限制制（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法法①農(nóng)桿菌特點(diǎn)點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物物，對(duì)大大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有有感染能力。。②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受受體細(xì)胞，并并整合到受體體細(xì)胞染色體體的DNA上上。三、目的基因因?qū)胧荏w細(xì)細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表表達(dá)③過(guò)程：（2）基因槍法：目的基因?qū)肴雴巫尤~植物物細(xì)胞①操作方法：：利用壓縮氣氣體產(chǎn)生的動(dòng)動(dòng)力，將包包裹在金屬粒粒表面的表達(dá)達(dá)載體DNA打入受體細(xì)細(xì)胞中，使目目的基因與其其整合并表達(dá)達(dá)的方法。②鎢粉粒子和金金粉粒子，粒粒子的直徑一一般在0.6～4um。。③適用：?jiǎn)巫尤~植物基因槍法（3）花粉管通道法法：將目的基因?qū)?dǎo)入植物細(xì)胞胞①操作方法：：在植物花受受粉后，花粉粉形成花粉管管還末愈合前前期，剪去柱柱頭，然后，，滴入DNA（含的基因因）使目的基基因借助花粉粉管通道進(jìn)入入受體細(xì)胞②特點(diǎn):十分簡(jiǎn)簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。③例：轉(zhuǎn)基因抗抗蟲棉（我國(guó)國(guó)）（4）、將目目的基因?qū)肴雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法目的基因表達(dá)達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新新性狀動(dòng)動(dòng)物（5）、將目目的基因?qū)肴胛⑸锛?xì)胞胞①微生物作受體體細(xì)胞原因：：繁殖快、多為為單細(xì)胞、遺遺傳物質(zhì)相對(duì)對(duì)少②常用菌：大大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受受態(tài)細(xì)胞（改變細(xì)胞壁壁的通透性））④過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合從細(xì)胞器的功功能上分析，，若通過(guò)基因因工程生產(chǎn)人人的糖蛋白，，可以用大腸腸桿菌嗎？【提示】不可以，糖蛋蛋白上的糖鏈鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)和高爾基體體上加工完成成的，而內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)和高爾基基體存在于真真核細(xì)胞中，，大腸桿菌是是原核生物，，細(xì)胞中不含含有這兩種細(xì)細(xì)胞器。問(wèn)題3導(dǎo)入過(guò)程完成成后，全部受受體細(xì)胞都能能攝入入重組DNA分子嗎？真正能攝入重重組DNA分分子的受體細(xì)細(xì)胞很少，且且有的會(huì)攝入入載體-載體體，目的基因因-目的基因因類型目的基因進(jìn)入入受體細(xì)胞后后，是否都能能穩(wěn)定維持和和表達(dá)？不一定，需要要檢測(cè)問(wèn)題4問(wèn)題5練習(xí)采用基因工程程的方法培育育抗蟲棉，下下列導(dǎo)入目的的基因的做法法正確的是()①將毒素蛋白白注射到棉受受精卵中②將將編碼毒素蛋蛋白的DNA序列，注射射到棉受精卵卵中③將編碼碼毒素蛋白的的DNA序列列，與質(zhì)粒重重組，導(dǎo)人細(xì)細(xì)菌，用該細(xì)細(xì)菌感染棉的的體細(xì)胞，再再進(jìn)行組織培培養(yǎng)④將編碼碼毒素蛋白的的DNA序列列，與細(xì)菌質(zhì)質(zhì)粒重組，注注射到棉的子子房并進(jìn)入受受精卵A、①②B、②③C、③④D、①④C——檢查是否否成功分子水平個(gè)體水平：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因因生物染色體體的DNA上是否插入了了目的基因②檢測(cè)目的基基因是否轉(zhuǎn)錄錄出了mRNA③檢測(cè)目的基基因是否翻譯譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗抗病鑒定、活活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜雜交分子雜交抗原抗體雜交交四、目的基因因的檢測(cè)與鑒鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生物物染色體的的DNA上上是否插入入了目的基因基因探針：：放射性同位位素等標(biāo)記記的含有目目的基因DNA片段段方法——DNA分子子雜交技術(shù)術(shù)變性變性變性方法——分子雜交技技術(shù)（2）檢測(cè)測(cè)目的