分子生物學(xué)講座9

第二節(jié)基因工程載體

一、作為載體的條件：分離的基因自身不能繁殖，需要載體攜帶它們到合適的細(xì)胞中復(fù)制和表現(xiàn)功能。對理想的基因工程載體一般至少有以下幾點(diǎn)要求。①能在宿主細(xì)胞中復(fù)制，而且最好要有較高的復(fù)制能力。②容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高越好。③容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要求載體上要有合適的酶切位點(diǎn)。④容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。⑤有容易被識別篩選的標(biāo)志。

二、載體的種類按照性質(zhì)分：質(zhì)粒載體病毒載體按照功能分：克隆載體表達(dá)載體穿梭載體常用的載體有質(zhì)粒，噬菌體和病毒等。一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點(diǎn)如下：①是染色體外的雙鏈共價閉合環(huán)形DNA（covalentlyclosedcircuarDNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。

②能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制（stringentcontrol）型：復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個細(xì)胞只有一個到十幾個拷貝；松弛控制（relaxedcontrol）型：復(fù)制和宿主不偶聯(lián)，每個細(xì)胞中有幾十到幾百個拷貝。③質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的。這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。二、噬菌體載體1、結(jié)構(gòu)噬菌體（phage）是感染細(xì)菌的一類病毒，有的噬菌體基因組較大，例入λ噬菌和T噬菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬菌體等。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。λ噬菌體由頭和尾構(gòu)成，DNA裝在頭部蛋白質(zhì)外殼的里面。其基因組長48502bp，為線性雙鏈DNA。λ噬菌體感染時，通過尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。DNA進(jìn)入大腸桿菌后以其兩端12bp的互補(bǔ)單鏈粘末端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以兩種不同的方式繁殖。①溶菌性方式（lyticpathway）：在營養(yǎng)充足，條件適合細(xì)菌繁殖時，利用宿主菌中的酶類和原料，λDNA上基因可按調(diào)控的順序表達(dá)合成構(gòu)成噬菌體頭、尾和尾絲所需的各種蛋白質(zhì)，λDNA經(jīng)多次復(fù)制合成許多子代λDNA，于是裝配成許多子代的λ噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的λ噬菌體。②溶原性方式（lysogenicpathway）：進(jìn)入細(xì)菌的λDNA可整合(integrate）入細(xì)菌的染色質(zhì)DNA中，隨細(xì)菌染色體DNA復(fù)制，傳給細(xì)菌后代，這個穩(wěn)定潛伏在細(xì)菌染色質(zhì)DNA中的λDNA稱為原噬菌體(prophage)，含有原噬菌體的細(xì)菌稱為溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿主DNA中切出，進(jìn)入溶菌性方式的繁殖。

2、基因組λ噬菌體整個基因組可分為三個部分：①左臂：長約20kb，編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。③右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂是必需的，中段是非必需的。在中段插入外源基因不影響它的增殖，這是作為載體的基礎(chǔ)。3、應(yīng)用作為載體，但天然不行，需要改造一般地，基因工程操作可以分為四個步驟

目的基因的獲得目的基因和載體連接目的基因的轉(zhuǎn)化目的基因的表達(dá)第三節(jié)目的基因的獲取1、目的基因的概念符合人們要求的DNA片段，被稱為目的基因。

篩選文庫

PCR擴(kuò)增化學(xué)合成2、得到目的基因的主要方法（1）基因組DNA文庫從細(xì)胞中提取出全部DNA，用物理方法（超聲波等）或酶法（內(nèi)切酶不完全酶解）將DNA降解成大小不等的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，這樣每一個細(xì)胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）。如果這個文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫，能從這文庫中釣取該生物的全部基因或DNA序列?；蚪MDNA酶切（2）cDNA文庫提出細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫?；蚪M含有的基因在特定的組織細(xì)胞中只有一部分表達(dá)，而且處在不同環(huán)境條件、不同分化時期的細(xì)胞其基因表達(dá)的種類和強(qiáng)度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細(xì)胞特異性。cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對真核細(xì)胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。（3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很方便地用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR），從基因組DNA或cDNA中獲得目的基因，可不必要經(jīng)過復(fù)雜的DNA文庫構(gòu)建過程。

PCR反應(yīng)系統(tǒng)包括：含有目的基因的DNA模板對熱穩(wěn)定的DNA聚合酶一對寡核苷酸引物

4種三磷酸脫氧核苷保證聚合酶催化反應(yīng)的緩沖液（4）人工化學(xué)合成現(xiàn)在計算機(jī)控制的全自動核酸合成儀已被廣泛應(yīng)用，按人們設(shè)計好的序列一次合成100-200bp長的DNA片段已不成問題。但隨意合成的DNA絕大多數(shù)肯定不具有生物功能或無法知道它會有什么功能的，因而只能模仿自然界生物中已知的基因序列來合成，而化學(xué)合成這樣長的基因DNA序列，其價格遠(yuǎn)高于用PCR法獲得基因，所以目前很少全部用化學(xué)方法去合成基因。但人工設(shè)計化學(xué)合成核酸片段作為引物、接頭等已經(jīng)成為分子生物學(xué)和基因工程中必不可少而且十分重要的手段。第四節(jié)目的基因和載體的連接

將目的基因或序列插入載體，主要靠DNA連接酶。有以下主要的方式。一、粘性末端連接如果目的序列兩端有與載體上相同的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，則同一限制酶切開產(chǎn)生的粘末端，在降低溫度退火時，能重新互補(bǔ)結(jié)合，在DNA連接酶催化下，目的序列就與載體DNA鏈相連接。

不同的限制性內(nèi)切酶切，如果產(chǎn)生的DNA的粘末端相同（同尾酶），也可用此法連接。如果在連接的兩個DNA片段沒有能互補(bǔ)的粘性末端，可用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氧單核苷酸添加DNA的3’末端，例如一股DNA3’端加上polyG，另一股DNA3’端加上polyC，人工在DNA兩端做出能互補(bǔ)的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能連接，稱為同聚物加尾法。對平末端的DNA，可先連上人工設(shè)計合成的脫氧寡核苷酸雙鏈接頭，使DNA末端產(chǎn)生新的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)內(nèi)切酶割后，即可按粘性末端相連。

GGGGGCCCCC5`5`3`3`同聚物加尾法二、平末端連接

T4DNA連接酶能催化DNA平末端的連接。如果目的序列和載體上沒有相同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可供利用，用不同的限制性內(nèi)切酶切割后的粘性末端不能互補(bǔ)結(jié)合，則可用適當(dāng)?shù)拿笇NA突出的末端削平或補(bǔ)齊成平末端，再用T4DNA連接酶連接，但平末端連接要比粘性末端連接的效率低得多。

第五節(jié)目的基因?qū)爰?xì)胞

目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì)胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。一、原核細(xì)胞1、熱激和電激由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳特性改變稱為轉(zhuǎn)化。1943年Avery等就發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。DNA自然進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在基因工程中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4℃轉(zhuǎn)入42℃作短時間處理，質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌；用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔轉(zhuǎn)化法。2、感染噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染（infection）。用經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖。3、轉(zhuǎn)染重組的噬菌體DNA也可象質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2，電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱為轉(zhuǎn)染。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法其他方法二、真核細(xì)胞

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌浸染發(fā)根農(nóng)桿菌浸染1974年Zaenen等研究發(fā)現(xiàn)，根癌農(nóng)桿菌中存在一個或幾個大的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生腫瘤所必須的，并稱之為Ti質(zhì)粒（tumourinducingplasmid）。根癌農(nóng)桿菌的Ti為質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌的為Ri質(zhì)粒。1977年，用限制性內(nèi)切酶的方法證實植物腫瘤組織中存在一段外來的DNA，是整合進(jìn)植物染色體的根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的一個片段，稱為轉(zhuǎn)移DNA（transferredDNA），簡稱T-DNA。當(dāng)植物受傷時T-DNA會轉(zhuǎn)入并整合到植物的基因組中，然后借助植物的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基本方法農(nóng)桿菌示意圖T-DNA右邊界左邊界Vir區(qū)Tiplasmid目的基因細(xì)胞核，示核仁和核孔農(nóng)桿菌附著在細(xì)胞壁上T-DNA轉(zhuǎn)移的過程示意圖優(yōu)點(diǎn)單拷貝插入片段大表達(dá)高效不需要貴重儀器農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化特點(diǎn)缺點(diǎn)基因型依賴愈傷組織褐化壞死單子葉不敏感抑菌比較困難PDS1000/He2、基因槍法基因槍原理手持式基因槍基因槍轉(zhuǎn)化特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)操作簡單快速高效處理樣品多不依賴基因型缺點(diǎn)費(fèi)用高基因沉默多拷貝3、其他方法

花粉管通道法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化超聲波法、電激法、激光轉(zhuǎn)化法等第六節(jié)含目的基因克隆的篩選與鑒定

目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導(dǎo)入細(xì)胞的效率都不是百分之百的，因而最后生長繁殖出來的細(xì)胞并不同都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細(xì)胞只接受一個重組DNA分子。最后培養(yǎng)出來的細(xì)胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant）。將目的重組體篩選出來就等于獲得了目的序列的克隆，所以篩選是基因克隆的重要步驟。在構(gòu)建載體，選擇宿主細(xì)胞、設(shè)計分子克隆方案時都必須仔細(xì)考慮篩選的問題。一、根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選

最常見的載體攜帶的標(biāo)志是抗藥性標(biāo)志，如抗氨芐青霉素（amp-r）、抗四環(huán)素(ter-r)、抗卡那霉素(kan-r)等。當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細(xì)胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插在載體抗藥性基因中間，使抗藥性基因失活，這個抗藥性標(biāo)志就會消失。例如質(zhì)粒pBR322含有amp、ter兩個抗藥基因，若將目的序列插入ter基因序列中，轉(zhuǎn)化大