適用地拉羅司藥物的微生物限度檢查方法探究,藥學(xué)論文

適用地拉羅司藥物的微生物限度檢查方法探究,藥學(xué)論文摘要：目的建立地拉羅司分散片的微生物限度檢查方式方法。方式方法根據(jù)中國(guó)藥典2021年版四部通則1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中的微生物計(jì)數(shù)法,通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中的控制菌檢查法和通則1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方式方法適用性試驗(yàn)。微生物限度檢查方式方法學(xué)適用性試驗(yàn)采用常規(guī)法篩查了抑菌性,然后利用稀釋和中和原理改良供試液的制備,即將中和劑3%聚山梨酯-80、0.3%卵磷脂添加至pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液,需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)(稀釋成1∶500)及霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)(稀釋成1∶50)均采用平皿法,控制菌檢查法采用培養(yǎng)基稀釋法(500mLTSB)。結(jié)果5種試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)結(jié)果均在0.5～2.0之間。結(jié)論該方式方法適用于地拉羅司分散片微生物限度的檢查。本文關(guān)鍵詞語：地拉羅司分散片;微生物限度檢查;方式方法驗(yàn)證;Abstract：OBJECTIVEToestablishamicrobiallimittestmethodofDeferasiroxDispersibletablets.METHODSAccordingtothefourthvolumeofChinesePharmacopoeia(the2021Edition),generalrule1105:microbialcountingmethodformicrobiallimittestofnon-sterileproducts,generalrule1106:thecontrolbacteriaexaminationmethodformicrobiallimittestofnon-sterileproducts,generalrule1107:thetestmethodforsuitabilityofmicrobiologicallimitsfornonsteriledrugs.Severalmethodsweretriedinthesuitabilityofmicrobiallimittest.WhenthesamplesweredilutedinpH7.0sodiumchloridebuffer-peptonesolution(containing3%Tween-80,0.3%lecithin)andweremadea1in500dilution(thetotalaerobicmicrobialcount),1in50(thetotalyeastandmoldcount).Aplatemethodwasusedinthetotalaerobicmicrobialcountandthetotalyeastandmoldcount.ThedirectinoculationmethodwasusedforthedetectionofEscherichiacoli(500mLTSB).RESULTSTherecoveriesofthefivestrainswerefrom0.5to2.0.CONCLUSIONThemethodissuitableforthemicrobiallimitexaminationofDeferasiroxDispersibletablets.Keyword：DeferasiroxDispersibletablets;microbiallimit;verificationandevaluationofmethodology;地拉羅司化學(xué)名為4-[3,5-二(2-羥基苯基)-1,2,4-三唑-1-基]苯甲酸,是由瑞士諾華制藥公司研究開發(fā)的鐵螯合劑產(chǎn)品,于2005年11月獲得FDA的上市批準(zhǔn)。地拉羅司為1日1次的口服鐵螯合劑,用于治療2歲及以上慢性貧血患者在治療經(jīng)過中因輸血而導(dǎo)致的鐵過載[1,2]。地拉羅司幾乎不溶于水,生物利用度較低,為了改善其生物利用度及臨床療效,可制備為地拉羅司分散片。分散片除具備普通片劑穩(wěn)定性好、易于制備等優(yōu)點(diǎn)外,還具有崩解迅速、吸收快、生物利用度高、服用便捷等特性,十分合適老人、小孩及吞咽困難者服用,能夠很好地改善患者的用藥依從性[3]。地拉羅司分散片屬于口服制劑,根據(jù)中國(guó)藥典2021年版四部制劑通則0101片劑要求,片劑在生產(chǎn)和儲(chǔ)存期間微生物限度應(yīng)符合要求,因而,本實(shí)驗(yàn)建立了地拉羅司分散片的微生物限度檢查方式方法。中國(guó)藥典2021年版四部[4]藥品微生物限度檢查法與歐美標(biāo)準(zhǔn)接軌[5,6],其標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定十分是方式方法適用性試驗(yàn)的規(guī)定與2018年版[7]相比有重大改變。本研究根據(jù)中國(guó)藥典2021年版四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方式方法(通則1105、通則1106),建立合適該產(chǎn)品的微生物限度檢查方式方法,對(duì)3批產(chǎn)品進(jìn)行方式方法適用性試驗(yàn),結(jié)果表示清楚,該方式方法有效、可行。1儀器與材料1.1儀器DL-CJ-2ND超凈工作臺(tái)(哈東聯(lián));1300SERIESA2生物安全柜(Thermo);MIR-254型生化培養(yǎng)箱(SANYO);電熱脈動(dòng)真空滅菌器(山東新華);PL2002電子天平(梅特勒);MaxQ6000恒溫?fù)u床(Thermo)。1.2試藥地拉羅司分散片(國(guó)內(nèi)A廠家,批號(hào):108/109/903;規(guī)格:500mg)。1.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào):151210)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA,批號(hào):151210)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào):151210)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA,批號(hào):151210)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào):151210)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):151210)均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(稀釋劑,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào):141213);0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥,批號(hào):1501273201);pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂,批號(hào):151217)。以上培養(yǎng)基的批號(hào)均為配制批號(hào)。1.4菌種金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis[CMCC(B)63501]、白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC(F)98001]、黑曲霉Aspergillusniger[CMCC(F)98003]、大腸埃希菌Escherichiacoli[CMCC(B)44102]均為第3代,均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。2方式方法與結(jié)果2.1菌液制備根據(jù)中國(guó)藥典2021年版要求,接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,33℃培養(yǎng)24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,23℃培養(yǎng)24h。上述培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉注射液分別稀釋制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu和5000～10000cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上,23℃培養(yǎng)7d,參加含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液3mL,將孢子洗脫,過濾菌絲吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液分別稀釋制成每1mL含菌數(shù)為30～60cfu和3000～6000cfu的菌懸液。2.2計(jì)數(shù)方式方法適用性試驗(yàn)2.2.1計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查取2.1項(xiàng)下制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各1mL(30～100cfu),分別注入無菌平皿中,立即傾注TSA培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,混勻,凝固,置33℃培養(yǎng),華而不實(shí)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)3d,白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)5d,計(jì)數(shù);取制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1mL(30～100cfu),分別注入無菌平皿中,立即傾注SDA培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,混勻,凝固,置23℃培養(yǎng)5d,計(jì)數(shù);同時(shí),用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值在0.5～2范圍內(nèi),且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基的菌落一致,判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。測(cè)定結(jié)果見表1。表1培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果Tab.1Suitabilitymethodsformicrobialenumerationtests-culturemedia2.2.2供試液制備取本品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL,振搖至供試品分散均勻,制成1∶10的供試液,即為供試液A。取本品10g,加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL,振搖至供試品分散均勻,制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液20mL,加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80mL,即為1∶50的供試液,取1∶50的供試液10mL,加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90mL,即為1∶500的供試液。2.2.3平皿法(傾注法)2.2.3.1常規(guī)法采用常規(guī)平皿法篩查供試品有無抑制微生物生長(zhǎng)的作用和抑制的微生物種類。菌液對(duì)照組:取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL,參加制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL(細(xì)菌、酵母菌500～1000cfu,霉菌300～600cfu),混勻,使每1mL稀釋液中含菌量為30～100cfu。分別取此菌液1mL注皿,測(cè)定其每毫升的活菌數(shù)。試驗(yàn)組:取供試液A10mL和制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL,混勻,取1mL注皿,測(cè)定需氧菌總數(shù)。另取供試液A10mL和上述制備好的真菌菌液0.1mL,混勻,取1mL注皿,測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。供試品對(duì)照組:取2.2.2項(xiàng)下1∶10的供試液10mL,參加稀釋劑0.1mL,混勻,取1mL注皿,在相應(yīng)的條件下培養(yǎng),測(cè)定供試品本底的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。測(cè)定結(jié)果見表2。試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的數(shù)值與菌液對(duì)照組菌數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2.0內(nèi),由表2能夠看出,采用上述方式方法進(jìn)行本品的微生物計(jì)數(shù),金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合中國(guó)藥典2021年版四部通則1105的要求,講明該品種對(duì)微生物有抑制作用。2.2.3.2稀釋法和中和法聯(lián)用中國(guó)藥典2021年版規(guī)定消除供試品抑菌性的主要方式方法包括稀釋法、中和法、薄膜過濾法以及上述方式方法的聯(lián)用。為了便于操作,本試驗(yàn)僅改良了供試液的制備,選擇了稀釋法和中和法聯(lián)用,即將中和劑聚山梨酯80和大豆卵磷脂添加到稀釋液中,結(jié)合供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn),將供試品稀釋為1∶50和1∶500。試驗(yàn)組:取1∶500的供試液10mL和制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL,混勻,取1mL注皿,測(cè)定需氧菌總數(shù)。另取1∶50供試液10mL和上述制備好的真菌菌液0.1mL,混勻,取1mL注皿,測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。供試品對(duì)照組:取2.2.2項(xiàng)下1∶500和1∶50的供試液10mL,參加稀釋劑0.1mL,混勻,取1mL注皿,在相應(yīng)的條件下培養(yǎng),測(cè)定供試品本底的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。測(cè)定結(jié)果見表3。稀釋劑對(duì)照組:取含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL,參加制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL(細(xì)菌、酵母菌500～1000cfu,霉菌300～600cfu),混勻,使每1mL稀釋液中含菌量30～100cfu。分別取此菌液1mL注皿,測(cè)定其每毫升的活菌數(shù)。測(cè)定結(jié)果見表4。表2菌落總數(shù)微生物方式方法適用性試驗(yàn)結(jié)果(常規(guī)法)Tab.2Suitabilitymethodsformicrobialenumerationtests(generalmethods)表3菌落總數(shù)微生物方式方法適用性試驗(yàn)結(jié)果(稀釋法和中和法聯(lián)用)Tab.3Suitabilitymethodsformicrobialenumerationtests(acombinationofdilutemethodandneutralizingmethod)表4稀釋劑的有效性和對(duì)微生物毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4Efficacyandtoxicityformicroorganismsofneutralizingagents2.3控制菌檢查方式方法適用性試驗(yàn)2.3.1控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查麥康凱肉湯促生長(zhǎng)能力和抑制能力檢查:接種100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中,在42℃培養(yǎng)24h,結(jié)果見表5。接種100cfu的金黃色葡萄球菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中,在33℃培養(yǎng)24h。麥康凱瓊脂促生長(zhǎng)能力和指示特性檢查:用涂布法分別接種100cfu的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中,在33℃培養(yǎng)24h。2.3.2大腸埃希菌檢查供試品組:取1∶50供試液50mL,置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基500mL中,33℃培養(yǎng)24h。陰性對(duì)照組:取稀釋液50mL,置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基500mL中,33℃培養(yǎng)24h。陽(yáng)性對(duì)照組:取1∶50供試液50mL,置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基500mL中,參加100cfu的大腸埃希菌,33℃培養(yǎng)24h。分別取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL,加至麥康凱肉湯100mL中,42℃培養(yǎng)24h后,再分別劃線于麥康凱瓊脂平板上,33℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果見表6。表5控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果Tab.5Suitabilitymethodforthecontrolbacteria注:表中+表示有能力,-表示沒有能力,/表示不要求做。Note:+meansgrowing,-meansnotgrowing,and/meansnotrequired.表6大腸埃希菌微生物方式方法適用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.6SuitabilitymethodforthecontrolbacteriaEscherichiacoli注:1)取1︰10供試液10mL,置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中,常規(guī)方式方法檢測(cè)結(jié)果;2)取1︰50供試液50mL,置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基500mL中,培養(yǎng)基稀釋法檢測(cè)結(jié)果。Note:1)Theresultsof10mL1︰10testsolutionwasplacedin100mLSoybean-CaseinDigestBroth;2)theresultsof50mL1︰50testsolutionwasplacedin500mLSoybean-CaseinDigestBroth.3討論微生物限度檢查方式方法學(xué)適用性試驗(yàn)時(shí)采取常規(guī)平皿法,發(fā)現(xiàn)該藥品對(duì)微生物有較強(qiáng)的抑制作用,根據(jù)中國(guó)藥典2021年版的要求嘗試了幾種方式方法消除抑菌性,結(jié)合固體口服制劑的限度標(biāo)準(zhǔn),假如僅采用稀釋法,抑菌性不能消除,因而本實(shí)驗(yàn)結(jié)合使用了中和法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,地拉羅司別稱4-[3,5-二(2-羥基苯基)-1,2,4-三唑-1-基]苯甲酸,由于化學(xué)構(gòu)造的特性,決定其具有抑菌性。由于苯甲酸本身主要用于抗真菌及消毒防腐,在進(jìn)行計(jì)數(shù)方式方法適用性試驗(yàn)時(shí),采用常規(guī)方式方法和常規(guī)的稀釋劑(pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)無法去除抑菌作用,因而,考慮使用稀釋法和中和劑(3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)聯(lián)用的方式方法進(jìn)行計(jì)數(shù)方式方法適用性試驗(yàn)[8],結(jié)果各試驗(yàn)菌株回收率比值到達(dá)藥典要求的0.5～2.0之間。中國(guó)藥典2018年版細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方式方法驗(yàn)證,試驗(yàn)組采用將供試液和菌液同時(shí)加在培養(yǎng)基中,然后傾注培養(yǎng)基,而2021年版藥典是將一定濃度的菌液參加到供試液中混勻,再取一定量的混合液注入平皿中,操作上愈加接近藥物受微生物污染的真實(shí)狀態(tài),然后通過測(cè)定各試驗(yàn)菌株的回收率比值考察所采用的方式方法能否能夠消除藥物對(duì)微生物的影響,使得藥物中的微生物能夠真實(shí)地顯現(xiàn)出來。中國(guó)藥典2021年版參考美國(guó)藥典對(duì)微生物限度檢查方式方法進(jìn)行了國(guó)際協(xié)調(diào),將細(xì)菌計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)修改為需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù),計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基相應(yīng)的修訂為TSA和SDA,與原來的營(yíng)養(yǎng)瓊脂相比,TSA既能夠檢測(cè)細(xì)菌可以檢測(cè)霉菌和酵母菌,檢測(cè)愈加