工藝學-發(fā)酵相關知識補充-滅菌技術

第二章滅菌技術第一節(jié)培養(yǎng)基滅菌第二節(jié)空氣過濾除菌一、常用的滅菌方法(一)化學物質滅菌

1.原理：與微生物細胞中的某種成分產生化學反應，如使蛋白質變性、酶類失活、破壞細胞膜通透性而殺滅微生物

2.常用化學消毒劑甲醛（福爾馬林），主要是氣體殺菌，常用于染菌罐的處理和發(fā)酵廠房內部環(huán)境的定期消毒滅菌，10mL/M3。乙醇，70％，皮膚消毒用，濃度過高會在菌體表面形成膜，影響乙醇進入菌體。石炭酸，2％～5％溶液，用于器械和環(huán)境的噴霧消毒。來蘇爾，2％，較石炭酸刺激性小，用于皮膚消毒。新潔爾滅，由5％原液稀釋至0.25％水溶液采用殺菌作用，用于無菌室的噴霧消毒和皮膚，器械的表面消毒。漂白粉，配成10％的水溶液，用于環(huán)境及發(fā)酵車間內的下水道、地溝等污染地段的消毒。3.適用范圍：只適合于無菌室或實驗室的凈化消毒滅菌，或用于發(fā)酵車間的環(huán)境消毒滅菌，而不能用于發(fā)酵工業(yè)生產設備和物料的消毒滅菌。(二)干熱滅菌法1.利用火焰和熱空氣進行滅菌的方法。2.電熱烘箱，在150～170℃下維持1～2小時，細胞成分發(fā)生氧化、細胞蛋白質變性、電解質濃縮等效，其中導致微生物死亡的主要作用是氧化。適用于工業(yè)要求為滅菌后能保持干燥狀態(tài)物料的滅菌，棉塞，金屬制品，玻璃器皿等。3.灼燒，是一種最徹底的干熱滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、針、鉤，試管口，三角瓶口等少數對象的滅菌。種子罐（小型罐）接種時火焰保護開口接種。4.雖簡單有效，但不能用于發(fā)酵生產的消毒滅菌。表4-1干熱滅菌溫度和時間的關系

滅菌溫度/（℃）滅菌時間/（min）17060160120150150140180121過夜(三)濕熱滅菌法濕熱滅菌是直接用飽和蒸汽進行滅菌。（1）為何在相同溫度下濕熱比干熱滅菌效果好？①蛋白質凝固所需的溫度與其含水量有關，含水量愈大，發(fā)生凝固所需的溫度愈低。(蛋白質或酶的熱失活與水的關系，水引起酶分子中天冬酰胺、谷氨酰胺的脫氨基作用，天冬氨酸肽鍵的水解，二硫鍵的破壞，半胱氨酸的氧化及脯氨酸和甘氨酸的異構化）②溫熱滅菌過程中蒸氣放出大量潛熱，因而濕熱滅菌比干熱所要溫度低，如在同一溫度下，則濕熱滅菌所需時間比干熱短。③濕熱的穿透力比干熱大，使深部也能達到滅菌溫度。

發(fā)酵工業(yè)中處理大量培養(yǎng)基時廣泛采用濕熱滅菌。1.濕熱滅菌概述2.影響培養(yǎng)基滅菌的因素

（1）pH值的影響

pH值對微生物的耐熱性影響很大，pH為6.0～8.0時微生物最不易死亡，pH<6.0時氫離子易滲入微生物的細胞內。

（2）培養(yǎng)基成分

①油脂、糖類、蛋白質，尤其是蛋白質，凝固在菌體表面形成膜，會增加微生物的耐熱性，使滅菌困難。②高糖、高氮、高濃度的豐富培養(yǎng)基（培養(yǎng)基基礎料和中間補料）既要考慮營養(yǎng)不被破壞，又要考慮滅菌的難度，如玉米漿、麩質粉本身含有大量的蛋白質且寄生大量雜菌，尤其是芽孢桿菌。實消，加熱升溫40min,控制125℃，0.12MPa，保溫30min。③易揮發(fā)物料，如尿素，硫酸銨等，本身較純凈，高溫破壞本身成分，較低溫度，壓力和較短時間為宜。實消，加熱升溫20min,控制105℃～110℃，0.05MPa，保溫10min足夠。④一般葡萄糖，淀粉，無機鹽，較純凈，易于消透，實消，加熱升溫40min,控制120℃，0.10～0.12MPa，保溫20min。⑤高濃度的鹽類，色素則削弱其耐熱性，故較易滅菌。（3）培養(yǎng)基中的顆粒物質

培養(yǎng)基中的顆粒物質大，滅菌困難，反之，滅菌容易。一般說來，含有顆粒對培養(yǎng)基滅菌影響不大，但在培養(yǎng)基混有較大顆粒，特別是存在凝結成團的膠體時，會影響滅菌效果，必須過濾除去。

（4）泡沫

泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，熱難以穿透過去殺滅微生物。加入消泡劑。（5）蒸汽的質量與壓力①濕飽和蒸汽。蒸汽中帶有一定的水份，混懸無數微細水滴，由蒸汽輸送管路中熱量損失造成，此時蒸汽熱含量較低，穿透能力較差，滅菌效果較差。②飽和蒸汽。蒸汽溫度與水的沸點想當，當蒸汽的壓力達到平衡時，蒸汽中不含有細微水滴，熱含量高（潛熱），穿透能力較大，滅菌效果較好。③過熱蒸汽。蒸汽中的液態(tài)的水完全蒸發(fā)后，再繼續(xù)加熱即成為過熱蒸汽。與干熱狀態(tài)相似，在壓力不變，溫度繼續(xù)上升的情況下，蒸汽溫度雖然比飽和蒸汽高，但穿透力差，滅菌效果不如飽和蒸汽。二、生產上培養(yǎng)基的滅菌方法1.概念：

將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設備一起滅菌的操作過程。

（一）分批滅菌（實罐滅菌，實消）2.分批滅菌的一般操作過程（1）培養(yǎng)基預熱

培養(yǎng)基先加熱到80～90℃，然后再導入蒸汽升溫到120～180℃。

①預熱的目的？②預熱的方法？（2）培養(yǎng)基滅菌

方法：將蒸汽從進氣口、排料口、取樣口直接導入罐內，所謂的“三路進氣”。使罐溫上升到120～130℃，罐壓維持在1×l05Pa(表壓)左右，并保溫30min。3.分批滅菌的注意事項（1）各路進口要蒸汽暢通，防止短路逆流，罐內液體翻動要劇烈，以使罐內物料達到均一的滅菌溫度。（2）排氣量不宜過大，以節(jié)約蒸汽用量。（3）滅菌將要結束時，應立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻水冷卻。（4）在引入無菌空氣前，罐內壓力必須低于空氣過濾器壓力。（5）要考慮物料體積對升溫過程的影響。（6）空罐的準備①發(fā)酵罐空罐嚴密度的檢查往往被忽略，但教訓深刻。②罐內、罐外設備的檢查攪拌傳動系統、罐內管路、冷卻設備蛇管和夾層罐外各管路、支管路、閥門的嚴密度及暢通情況

取樣閥門被菌絲焦化物堵塞倒罐的教訓。③死角的清除死角指的是在滅菌過程中蒸汽的高溫所達不到、消不透的角落。④空罐的預消有些廠家。（7）原材料中顆粒及雜物的干擾（8）攪拌在實罐滅菌中的作用（9）加熱和保溫

間接加熱升溫直接進汽（10）假壓力的形成與防止（11）泡沫的產生與消除（7）原材料中顆粒及雜物的干擾（8）攪拌在實罐滅菌中的作用（二）連續(xù)滅菌

1.概念：

將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐時進行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱之為連消。

2.連續(xù)滅菌流程(1)配料（2）預熱預熱的目的可不預熱（3）加熱加熱的主要作用？溫度l26～132℃；停留時間20～30s

不同的加熱器料液進口（4）保溫殺滅微生物的主要過程

A.維持罐

B.罐式維持器避免返混，減少培養(yǎng)基成分破壞

噴淋冷卻器（5）降溫

A.噴淋冷卻器

B.螺旋板換熱器

C.板式換熱器

D.真空冷卻器板式換熱器連消塔式連續(xù)滅菌流程噴射加熱式連續(xù)滅菌流程板式換熱式連續(xù)滅菌流程

3.空罐滅菌空罐滅菌也稱空消。無論是種子罐、發(fā)酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當培養(yǎng)基（或物料）尚未進罐前對罐進行預先滅菌。滅菌后為避免罐壓急速下降造成負壓，要等到經過連續(xù)滅菌的無菌培養(yǎng)基輸入罐內后，才可以開冷卻水冷卻。為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時間較長，只有這樣才能殺死設備中各死角殘存的雜菌或芽孢。

4.發(fā)酵附屬設備及管路的滅菌

發(fā)酵附屬設備有總空氣過濾器、管道、計量罐、補料罐等。物料總管路的準備與滅菌管道滅菌的蒸汽壓力不應低于3.4×l05Pa(表壓)，滅菌時間為1h。新安裝的管道或長期未使用的管道滅菌時間可延長到1.5h，滅菌后以無菌空氣保壓，自然冷卻。分批滅菌和連續(xù)滅菌的比較連續(xù)滅菌的優(yōu)點：高溫瞬時，培養(yǎng)基受熱時間短，營養(yǎng)成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產率；發(fā)酵罐利用率高；采用板式換熱器時，可節(jié)約大量能量；適宜采用自動控制，勞動強度小連續(xù)滅菌不適宜的情況培養(yǎng)基中含有顆?；蜉^多泡沫容積較小的發(fā)酵罐其他滅菌方法1.巴氏消毒法（pasteurization）用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法。2.低溫維持法：在63℃下保持30分鐘可進行牛奶消毒；3.高溫瞬時法：用于牛奶消毒時只要在72℃下保持15秒鐘即可。4.丁達爾滅菌法或分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在80～100℃下蒸煮15～60分鐘，以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細胞，然后置室溫或37℃下保溫過夜，誘導殘留的芽孢發(fā)芽，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復3天，即可在較低溫度下達到徹底滅菌的效果。常規(guī)加壓滅菌法盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱至121℃（壓力為1kgf／cm2或15磅／英寸2），時間維持15～20分鐘，也可采用在較低的溫度（115℃，即0.7kgf／cm2或10磅／英寸2）下維持35分鐘的方法。（三）高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止

消除高溫有害影響的措施（1）對易破壞的含糖培養(yǎng)基進行滅菌時，應先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（2）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（3）對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進行低壓滅菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下滅菌15分鐘）；（4）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進行培養(yǎng)基的滅菌（5）過濾除菌過濾除菌法

是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。純生啤酒生產過程中，用微孔濾膜代替高溫瞬時殺菌和巴氏殺菌。采用微孔濾膜濾器除菌的關鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。過濾除菌的缺點是無法去除其中的病毒和噬菌體。固體培養(yǎng)基的滅菌

固體培養(yǎng)基的滅菌一般稱為蒸料，蒸料是目前固態(tài)發(fā)酵釀造醬油和食醋中用得最廣的一種方法。

蒸料的目的①粉碎后的淀粉質原料吸水后膨脹，借助于蒸煮時的高溫高壓作用，使植物組織和細胞破裂，細胞中淀粉釋放出來，淀粉由顆粒狀態(tài)轉變?yōu)槿苣z狀態(tài)（即原料中的淀粉達到糊化程度），并產生少量糖類供米曲霉生長利用。②使原料中的蛋白質達到適度變性，易于被米曲霉發(fā)育生長所利用，并為以后酶分解提供基礎。③對原料進行滅菌。第二節(jié)空氣除菌

空氣中微生物的分布

空氣中微生物的存在形式：一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上，空氣中微生物的含量一般為103～104個／米3。北方氣候寒冷干燥，空氣中的含菌量較多；離地面越高，含菌量越少，一般每升高10米，空氣中的含菌量就降低一個數量級；城市的空氣中含菌量較多，農村的空氣中含菌量較少，一般城市空氣中雜菌數為3000～8000個／米3

空氣中的微生物以細菌和細菌芽胞較多，也有酵母，霉菌和病毒。無菌空氣的標準只要除去0.3～0.5μm的微粒，就可認為是無菌

發(fā)酵對空氣無菌程度的要求

好氣性發(fā)酵需要大量無菌空氣，空氣要作到絕對無菌很困難，也不經濟。發(fā)酵對無菌空氣的要求是：無菌，無灰塵，無雜質，無水，無油，正壓等幾項指標；發(fā)酵對無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌，造成損失即可。在工程設計中一般要求1000次使用周期中只允許有一個菌通過，即經過濾后空氣的無菌程度為N=10-3

一、空氣除菌的方法

（一）輻射殺菌（二）熱殺菌

（三）靜電除菌（四）過濾除菌（一）輻射滅菌法

最常用的是紫外線無菌室滅菌，無法滿足工業(yè)化生產的需求。（二）熱滅菌熱空氣進入培養(yǎng)系統之前，一般均需用壓縮機壓縮，提高壓力。空氣壓縮后溫度能達到200度以上，保持一定時間后，便可實行干熱殺菌。利用空氣壓縮時所產生的熱量進行滅菌的原理對制備大量無菌空氣有特別意義。實際應用中需考慮培養(yǎng)裝置與空氣壓縮機的相對位置，連接壓縮機與培養(yǎng)裝置的管道的滅菌以及管道長度等。（三）靜電除菌靜電除塵器可除去空氣中的水霧、油霧、塵埃，同時也除去微生物。原理：利用靜電引力來吸附帶電粒子而達到除塵滅菌目的。對于一些直徑小的微粒，所帶電荷小，不能被吸附而沉降。（四）介質過濾除菌

過濾介質按孔隙的大小可分成兩大類，一類是介質間孔隙大于微生物，故必須有一定厚度的介質濾層才能達到過濾除菌目的，稱為介質深層過濾除菌；而另一類介質的孔隙小于細菌，含細菌等微生物的空氣通過介質時，微生物就被截留于介質上而實現過濾除菌，稱之為絕對過濾。介質過濾除菌是使空氣通過經高溫滅菌的介質過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質層中，而達到除菌的目的。從可靠性，經濟適用與便于控制等方面考慮，目前仍以介質過濾法較好，也是大多數發(fā)酵廠廣泛采用的方法。二、介質深層過濾原理深層過濾所用的過濾介質—棉花的纖維直徑一般為16～20微米。充填系數為8%時，棉花纖維所形成網格的孔隙為20～50微米，微粒大小為(0.5-2微米)。微粒隨氣流通過濾層時，濾層纖維所形成的網格阻礙氣流前進，使氣流出現無數次改變運動速度和運動方向，繞過纖維前進；這些改變引起微粒以對濾層纖維產生慣性沖擊、阻攔、重力沉降、布朗擴散、靜電吸引等作用而把微粒滯留在纖維表面上。１．慣性碰撞截留空氣氣流流速大時，氣流中的微粒具有較大的慣性力。當微粒隨氣流以一定速度向纖維垂直運動因受纖維阻擋而急劇改變運動方向時，由于微粒具有的慣性作用使它們仍然沿原來方向前進碰撞到纖維表面，產生摩擦粘附而使微粒被截留在纖維表面，這種作用稱慣性碰撞截留。慣性沖擊捕集效率η-單纖維的慣性沖擊捕集效率

b-纖維能滯留微粒的寬度區(qū)間(m)df-纖維直徑（m）

截留區(qū)域b的大小決定于微粒運動的慣性力，所以，對于特定的微粒，氣流速度愈大，慣性力大，截留效果也愈好。此外，慣性碰撞截面作用也與纖維直徑有關，纖維愈細，捕集效果愈好。慣性碰撞截面在介質除塵中起主要作用?？諝饬魉賄0稱為慣性碰撞的臨界速度。臨界速度隨纖維直徑和微粒直徑而變化。２攔截滯留當氣流速度下降到臨界速度以下時，微粒就不能因慣性碰撞而滯留于纖維上，捕集效率顯著下降。但實踐證明，隨著氣流速度的繼續(xù)下降，纖維對微粒的捕集效率不再下降，反而又有所回升.當氣流在滯流狀態(tài)下夾帶微粒慢慢靠近介質時，主導氣流流向受纖維所阻而改變流動方向，繞過纖維前進，并在纖維的周邊形成一層邊界滯流區(qū)，區(qū)內的氣流速度更慢。滯留區(qū)的微粒漸漸靠近和接觸纖維而被粘附滯流，稱為攔截滯留作用。截留作用的捕集效率決定于微粒直徑和纖維直徑之比，又與空氣流速成反比，當氣流速度低時截留才起作用?？諝饬魉儆?，纖維直徑愈細，阻攔截留作用愈大。但是在介質過濾的除塵除菌中，阻攔截留并不起主要作用。當氣流速度更小時，直徑細小的細菌在氣流中能產生一種不規(guī)則的直線運動，稱為布朗擴散運動。當細菌與纖維介質接觸時就附著于纖維表面而被捕集。布朗擴散的運動距離很短，在較大的氣流速度或較大的纖維間隙中布朗擴散作用很小，可忽略不計。但在很小的氣流速度或較小的纖維間隙中布朗擴散作用大大增加了微粒與纖維的接觸滯留機會。布朗擴散作用捕集效率與微粒和纖維直徑有關，并與流速成反比，在氣流速度小時，它是介質過濾除菌的重要作用之一。只有在氣流速度較低時才較顯著。3.布朗擴散運動４、重力沉降作用機理重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。就單一的重力沉降情況下，大顆粒比小顆粒作用顯著，對于小顆粒只有在氣流速度很慢時才起作用。一般它是與攔截作用相配合的，即在纖維的邊界滯留區(qū)內，微粒的沉降作用提高了攔截滯留的捕集效率。

５、靜電吸附作用機理干空氣對非導體的物質相對運動磨擦時，會產生誘導電荷，纖維和樹脂處理過的纖維，尤其是一些合成纖維更為顯著。懸浮在空氣中的微生物微粒大多帶有不同的電荷，如枯草桿菌孢子20%帶正電荷，20%帶負電荷，15%中性，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。總之，通過實踐認識到，當空氣流過介質表面時，上述五種機理—慣性撞擊、截留、擴散、重力沉降和靜電吸附同時都起作用，不過氣流速度不同，起主要作用的機理也就不同。當氣流速度很大時，除菌效率隨空氣流速的增加而增加，此時，慣性撞擊起主要作用；當氣流速度較小時，除菌效率隨氣流速度的增加而降低，此時，擴散起主要作用；當氣流速度中等時，可能是截留和重力沉降起主要作用。如果空氣流速巨大，除菌效率反而下降，則是由于已被捕集的微粒又返回到氣流中。三、過濾介質與過濾器１、棉花２、玻璃纖維３、活性炭４、超細玻璃纖維紙５、石棉濾板６、燒結材料過濾介質７、新型過濾介質（一）過濾介質影響介質過濾效率的因素介質過濾效率與介質纖維直徑關系很大，在其他條件相同時，介質纖維直徑越小，過濾效率越高。對于相同介質，過濾效率與介質濾層厚度、介質填充密度和空氣流量有關。1.纖維介質深層過濾器過濾器的有效過濾介質厚度L的決定，通常在實驗數據的基礎上，按對數穿透定律進行計算。填充物按下面順序安裝：孔板→鐵絲網→麻布→棉花→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→鐵絲網→孔板。（二）過濾器2.平板式纖維紙過濾器3.管式過濾器過濾器失效壓縮空氣進入過濾器后便引起活性炭顆粒之間相互頂撞與摩擦，久而成為粉末(灰化)，活性炭的體積也逐漸變小，于是過濾器內的空間逐漸增大，到達-定程度時，便會發(fā)生棉花成90°翻身現象。這樣空氣便會未經過濾而進入罐內，引起染菌。棉花經過多次加熱滅菌后，顏色逐漸變深，靠近過濾器壁的棉花，因經受夾層蒸汽的烤干，受熱更為劇烈，更容易變