各種染色方法與及應(yīng)用

染色方法革蘭氏染色瑞-吉染色細(xì)胞化學(xué)染色免疫組化染色革蘭氏染色與細(xì)胞壁C.Gram（革蘭）于1884年發(fā)明的一種鑒別不同類型細(xì)菌的染色方法。革蘭氏染色

革蘭氏染色1、用堿性染料結(jié)晶紫對(duì)菌液涂片進(jìn)行初染2、用碘溶液進(jìn)行媒染，其作用是提高染料和細(xì)胞間的相互作用從而使二者結(jié)合得更牢固。3、用乙醇或丙酮沖洗進(jìn)行脫色。在經(jīng)歷脫色后仍將結(jié)晶紫保留在細(xì)胞內(nèi)的為革蘭氏陽性細(xì)菌，而革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)晶紫被洗掉，細(xì)胞呈無色。4、用一種與結(jié)晶紫具有不同顏色的堿性染料對(duì)涂片進(jìn)行復(fù)染。例如復(fù)紅，它使原來無色的革蘭氏陰性細(xì)菌最后呈現(xiàn)桃紅到紅色，而革蘭氏陽性細(xì)菌繼續(xù)保持深紫色

細(xì)胞化學(xué)染色，是一種以形態(tài)為基礎(chǔ)，結(jié)合運(yùn)用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)對(duì)血細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分作定位、定性及半定量分析的方法。用于研究血細(xì)胞生理、病理和化學(xué)結(jié)構(gòu)；臨床上為某些血液病的診斷、鑒別診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測和發(fā)病機(jī)制的探討，提供重要依據(jù)。細(xì)胞化學(xué)染色血細(xì)胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。血細(xì)胞化學(xué)染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質(zhì)等。（一）固定固定有物理法與化學(xué)法，物理法為干燥和火焰固定，化學(xué)法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。血細(xì)胞化學(xué)染色流程（二）顯示

1、偶氮偶聯(lián)法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，再與重氮鹽結(jié)合引起偶氮偶聯(lián)，使其形成不溶性的偶氮色素，以此證明酶的存在。

2、聯(lián)苯胺法：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色的聯(lián)苯胺形成藍(lán)色沉淀。3、普魯士藍(lán)法：細(xì)胞內(nèi)、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成藍(lán)色亞鐵氰化鐵沉淀。4、雪夫反應(yīng)：過碘酸氧化細(xì)胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成乙醛基，醛基與雪夫試劑作用，使無色品紅形成紅色沉淀。5、金屬沉著法其他尚有物理學(xué)方法，如脂溶性染料染色（顯示脂質(zhì)）、熒光顯示、放射自顯影以及體外活體染色亦常用于臨床血液細(xì)胞學(xué)診斷。（三）細(xì)胞化學(xué)定量粗略估量，以染色反應(yīng)的強(qiáng)弱，受色的深淺，人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽性。百分法，只能反映細(xì)胞陽性率，不能反映受色強(qiáng)弱。積分法，是常用的半定量法，將等級(jí)估量與百分率相結(jié)合它既反映了細(xì)胞陽性率的高低，又反映了細(xì)胞受色的強(qiáng)弱。下面介紹幾種常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法，這些方法學(xué)在白血病的鑒別診斷上具有重要意義。一、過氧化物酶染色（POX）

【原理】

粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞漿內(nèi)的髓過氧化物酶（POXorMPO）分解過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色聯(lián)苯胺，后者進(jìn)一步變成棕色化合物沉著于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。M1-POX(+)×過氧化物酶染色臨床意義

主要用于鑒別急性白血病類型，急性髓細(xì)胞白血病多呈陽性反應(yīng)，以M3和M2型反應(yīng)最強(qiáng)，MI和M5型反應(yīng)較弱，故有助于區(qū)別M3和M5型。急性淋巴細(xì)胞白血病呈POX陰性反應(yīng)，故為急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo)。二、過碘酸一雪夫（PAS)染色

【原理】

胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（periodicacid）氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫(Schiff)試劑中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色染料而沉積于胞漿中。該反應(yīng)稱為過碘酸一雪夫(PAS)陽性反應(yīng)。L1PAS(+)AML-M6PAS(+)

【臨床意義】（1）M6與巨幼貧的鑒別

M6的幼紅細(xì)胞PAS可呈強(qiáng)陽性，積分明顯增高，巨貧、再障、溶貧時(shí)PAS反應(yīng)為陰性。（2）急性白血病的類型鑒別

ALL，PAS呈大塊狀陽性，也可是陰性，AML為陰性，急性單核細(xì)胞白血病時(shí)原單核細(xì)胞及幼單核細(xì)胞PAS陽性，積分增高，陽性顆粒小而多，呈彌散分布。三、骨髓鐵染色

【原理】正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細(xì)胞中，骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)反應(yīng)，形成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位，從而反映骨髓中鐵的儲(chǔ)存量。細(xì)胞外鐵細(xì)胞內(nèi)鐵環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞【臨床意義】骨髓鐵染色是診斷缺鐵性貧血及指導(dǎo)鐵劑治療的重要方法；也是診斷鐵粒幼細(xì)胞貧血的有效方法。【基本原理】免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。免疫組(織)化(學(xué))1.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性2.加封閉液：3.加入一抗（保存液稀釋）4.加入二抗（即免疫組化試劑盒里的）5.顯色6.封片

免疫組化步驟免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

1、特異性強(qiáng)2、敏感性高3、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合34流式細(xì)胞術(shù)35

流式細(xì)胞術(shù)（FLOWCYTOMETRY）是利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)的物理、化學(xué)特性。它借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)與血球計(jì)數(shù)原理,同時(shí)利用熒光染料,激光技術(shù),單抗技術(shù)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,大大提高了檢測速度與統(tǒng)計(jì)精確性,而且從同一個(gè)細(xì)胞中可以同時(shí)測得多種參數(shù),為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗(yàn)學(xué)發(fā)展提供了一個(gè)全新的視角和強(qiáng)有力的手段。

流式細(xì)胞術(shù)36FC50037常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670免疫熒光紅TO488 525RNA染色綠38PNH(陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿)39HbF(胎兒血紅蛋白)檢測40血小板計(jì)數(shù)新標(biāo)準(zhǔn)(雙平臺(tái)法)R=