簡便易行、成活率高的原代心肌細胞培養(yǎng)方法,人體解剖學論文

簡便易行、成活率高的原代心肌細胞培養(yǎng)方法,人體解剖學論文原代心肌細胞培養(yǎng)是一項重要的體外實驗技術，其為建造心血管疾病發(fā)生發(fā)展經過的模型及討論基因、蛋白質及信號通路的變化提供重要的基礎保障。除此之外，在體內心肌細胞的活動遭到神經、體液等多方因素的影響，限制對其病理變化的經過的研究。而體外培養(yǎng)的原代心肌細胞不僅具有心肌細胞固有的活性，而且還有不受神經、體液等因素的影響的可控制性。因而，原代心肌細胞培養(yǎng)的好壞，是影響實驗的結果的關鍵因素之一。本研究通過比擬不同消化時間對原代心肌細胞的影響，討論一套簡便易行、成活率高的原代心肌細胞培養(yǎng)方式方法。1材料與方式方法1.1實驗動物選擇出生1~2d的Wistar大鼠，清潔級，雌雄不限，由內蒙古大學動物研究中心提供，合格證編號：csxk〔蒙〕2002-0001.楊木小刨花墊窩，濕度45%~50%,溫度控制在21~27℃。1.2主要試劑及儀器DMEM高糖培養(yǎng)基〔含100U青霉素+鏈霉素雙抗〕、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶〔Worthington公司，美國〕、磷酸鹽緩沖液〔PBS〕、臺盼藍染色液；5-溴-2-脫氧尿苷〔Brdu〕、4%多聚甲醛、過氧化酶阻斷溶液、羊血清、-actin抗體〔兔抗大鼠〕、二氨基聯(lián)苯胺〔3,3-diaminobenzidine,DAB〕顯色試劑盒、SABC〔鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法〕免疫組化試劑盒、Mayors蘇木精、二甲苯、TritonX.100〔生工生物工程有限公司，中國〕、37℃恒溫浴鍋、醫(yī)用超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、恒溫離心機等。1.3實驗步驟①將大鼠浸沒在75%乙醇中消毒2次，左手固定乳鼠暴露胸部，右手持眼科剪沿其胸骨左側剪開，壓住肺葉，心臟收縮時可見其膨出。眼科鑷鈍性分離下心臟，放入有10mL10%DMEM培養(yǎng)基〔含雙抗〕的培養(yǎng)皿中。②在第1個培養(yǎng)皿中擠出心臟的積血并鈍性分離出1/2~2/3心室下半部分，依次在第2、3個平皿中洗滌后放入小燒杯中，用眼科剪快速將所有心臟剪成約1mm3小塊。③取5mL消化液放入小燒杯，并輕晃燒杯5~8次，棄去消化液。再次放入3mL消化液，用直頭吸管將燒杯中的混合物轉移到有膠塞的玻璃管中，并將其置于37℃水浴鍋中并不斷晃動8~10min,隨后棄去消化液。④取新消化液5mL參加到玻璃管中，37℃水浴并晃動8~10min.將組織消化液移入50mL離心管，在這里之前管中先放入20mL已溫育的含20%FBS的DMEM〔H+〕,并混勻終止消化。重復此步驟6~7次，直到組織快消化為白色絮狀物為止。⑤將收集的消化液800r/min的轉速離心5min,棄上清。向離心沉淀中參加含10%FBS的DMEM〔H+〕10mL混勻，用300目濾網過濾。將濾液放入培養(yǎng)瓶中，于37℃孵箱中孵育90min,差速貼壁90min后取出培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，將上層懸濁液混勻移入孔板中〔8min和10min接種濃度一樣〕,以每1mL培養(yǎng)基中參加10LBrdu,繼續(xù)溫箱培養(yǎng)，24h后更換10%FBSDMEM〔H+〕.⑥取出細胞爬片用PBS緩沖液洗滌2次，吸去PBS后參加適量4%多聚甲醛固定30min,蒸餾水洗滌2min2次，吸干，參加適量蘇木精染色液室溫下染色8min,流動水沖洗約10min后吸干，蒸餾水洗滌1次后浸入95%乙醇5s,吸干后參加適量伊紅染色液室溫下染色30min,70%乙醇洗滌2次，吸干后置室溫下晾干。1.4原代心肌細胞活力測定①臺盼藍染色法：取細胞懸濁液100L,參加100L臺盼藍溶液〔2〕,混勻。其鏡下表現為死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。取10L用細胞計數板計數，計數4個大格中的活細胞總數和染成藍色的細胞數。使用血球計數板在倒置顯微鏡下分別計數分離純化前和分離純化后的細胞成活率，分別計數3次，取其平均值。計算公式：細胞存活率〔%〕=活細胞總數/〔活細胞總數+死細胞總數〕100%②比擬8min和10min消化時間下原代心肌細胞的活力：在倒置顯微鏡下觀察胞搏動頻率，每次觀察10個細胞取平均值，對2種消化時間下原代心肌細胞搏動頻率進行比擬。1.5原代心肌細胞的鑒定制作細胞爬片，培養(yǎng)48h后取出，采用橫紋肌肌動蛋白〔-actin〕作免疫染色，進行心肌細胞的鑒定。-actin為一抗，同時用PBS作為一抗進行對照。取爬片，4%多聚甲醛室溫固定、0.1%Triton100室溫孵育穿透及滅活內源性過氧化物酶各30min后，滴加1∶100的-actin抗體〔兔IgG〕,4℃過夜，孵育二抗20min,最后DAB顯色，蘇木精輕度復染。封固后，顯微鏡下拍照。1.6建立心肌肥大模型原代心肌細胞孔板中參加血管緊張素II〔AngiotensinII,Angll〕,使其終濃度為10-5mmoI/L,構成心肌肥大模型〔即實驗組〕;對照組參加一樣體積的10%FBSDMEM〔H+〕培養(yǎng)液，作用48h后，采用RT-PCR技術觀察原代心肌細胞肥大標志性基因心房鈉尿肽〔atrialnatriureticpeptide,ANP〕mRNA表示出變化[1].培養(yǎng)的原代心肌細胞經胰蛋白酶消化懸浮后，在一樣相差顯微鏡下拍攝照片，用圖像處理系統(tǒng)測量細胞的截面面積。1.7統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數據采用均數標準差〔xs〕表示，2組間比擬采用獨立樣本t檢驗。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1細胞形態(tài)2.1.1倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)培養(yǎng)12h后，細胞部分貼壁，多呈圓形、梭形及三角形。培養(yǎng)24h后，細胞基本上全部貼壁，并呈有自發(fā)搏動，8min及10min消化時間的細胞形態(tài)未見明顯異常。培養(yǎng)48h后，8min消化時間的細胞少量伸出偽足，多呈三角形及多邊形，而10min消化時間的細胞大部分伸出偽足互相接觸交織成網，逐步構成細胞簇，立體感明顯，細胞搏動及收縮均較明顯而有力。2.1.2HE染色后光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)細胞核染成藍色，細胞質染成淡紅色，核膜較為清楚明晰。原代心肌細胞數量較多呈簇狀聚集，細胞呈多角形、伸出多量偽足，細胞核飽滿、大小均勻，細胞質豐富且著色均勻，見圖1a、b.心肌成纖維細胞細胞核染成藍色，細胞質染成淡紅色，細胞核膜較為清楚明晰，平坦，細胞體較大，細胞質透明而薄，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡，見圖1c.2.2心肌細胞活力檢測結果2.2.1臺盼藍染色結果分離純化前活細胞的平均存活率90%,消化8min組和10min組比擬未見明顯區(qū)別〔P0.05〕.分離純化后活細胞的平均存活率也90%,且10min組的平均存活率高于8min組，差異有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕,見表1.2.2.2原代心肌細胞搏動原代心肌細胞培養(yǎng)48h后，2種消化時間的細胞搏動均達40~50次/min;細胞培養(yǎng)5d后，發(fā)現8min消化時間的細胞搏動的數量及次數均明顯減少，而10min的細胞搏動未見明顯變化。2.3免疫組化結果原代心肌細胞呈陽性反響，細胞質呈深棕色，8min和10min消化時間的細胞陽性率均95%,而心肌成纖維細胞呈陰性反響，細胞質無棕色顆粒，見圖2.2.4細胞截面平均面積10min消化時間的原代心肌細胞ANP的CT值比擬，實驗組較對照組表示出顯著升高〔P0.05〕,而內參GADPH的CT值比擬，實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學意義〔P0.05〕.Angll作用原代心肌細胞48h后，實驗組較對照組細胞截面平均面積比擬明顯增加〔P0.05〕,而8min的原代心肌細胞截面面積和ANP值未見顯著變化〔P0.05〕.3討論原代心肌細胞培養(yǎng)為建立心肌模型提供有效的技術手段，并逐步趨于成熟。自1960年Harary等[2]初次成功的培養(yǎng)出Wister乳鼠的原代心肌細胞起，國內外很多學者對心肌細胞原代培養(yǎng)方式方法不斷地進行研究及改良，并獲得一定成果?，F有資料顯示，影響原代心肌細胞成活率及活性的主要因素有消化溫度、消化酶及消化時間。當前，消化酶的選擇主要有2種，即單獨使用胰酶[3-4]和胰酶+膠原酶合用[5-6].胰酶能分解組織間質的蛋白成分，膠原酶的作用是特異性地水解細胞間質中的膠原纖維，因胰酶作用較強易毀壞細胞膜，而膠原酶作用緩和，近年來主要采用胰酶和膠原酶合用來進行消化。在選用胰酶+膠原酶的實驗中多數采用其最適溫度37℃進行消化，或單獨應用胰酶4℃過夜[7],采用其較弱的活性充分分解心肌組織間質，之后在應用膠原酶進行消化，以減少對細胞膜的損傷，提高細胞的成活率和活性。原代細胞培養(yǎng)計數的步驟已趨于成熟，本研究在結合本身實驗室條件及環(huán)境下進行反復探索，得到了一套簡便易行并且能或得較高成活率、純度及活性的原代心肌細胞的培養(yǎng)方式方法。同時，在其他操作條件不變的情況下，討論不同消化時間如8min及10min對原代心肌細胞的成活率、活性的影響。在本實驗中，應用了當前有關原代心肌細胞培養(yǎng)實驗中相對成熟的步驟，如選擇出生3d內的乳鼠[8]及采用90min差速貼壁法和Brdu抑制法分離純化細胞[9-10]等。在消化酶方面，只采用作用較緩和的膠原酶在37℃進行消化，同時，采用短時間屢次消化的方式，防止膠原酶消化不徹底，進而增加細胞的產量。在消化時間方面，本研究采用8min和10min消化時間，通過比照發(fā)現，2組純度鑒定陽性率均到達95%以上，而8min組的細胞形態(tài)明顯滯后于10min組，且10min組的存活時間和存活率顯著高于8min組。本研究以為采用8min消化法獲得的細胞生存時間短可能的原因是由于膠原酶消化不徹底，細胞在震蕩中從組織中分離下來，可以能損傷細胞膜，所以導致成活率較10min低。另一方面，由于細胞數量少，接種到孔板中的細胞濃度低而影響到單個細胞的搏動及同步化搏動。最后，利用消化時間為10min心肌細胞成功的建立心肌肥大模型，AngII作用48h后心肌細胞即實驗組ANP和外表積與對照組相比表示出顯著升高和增加，而消化時間為8min的心肌細胞外表積和ANP值未見顯著變化。與其他原代心肌細胞培養(yǎng)實驗相比，本研究成功的從活性和實用性方面講明消化時間是其重要的影響因素。同時講明，該心肌細胞的培養(yǎng)方式方法能夠應用于基礎實驗的研究。應用本實驗方式方法獲取心肌細胞要注意下面幾個方面：①選擇有正常生育周期及哺乳周期的育齡期母鼠進行生育。因母鼠的狀態(tài)會直接影響幼鼠的成活率和生長狀態(tài)及心臟發(fā)育的狀態(tài)；②心肌細胞培養(yǎng)的經過中要遵守無菌操作的規(guī)則，用到的器械及玻璃制品要進行高壓滅菌。乳鼠也需要在75%乙醇中消毒2次，取心臟時應快速，以使取出的心臟仍有搏動。除此之外，還要避免剪破腹腔，防止污染；③丟棄第1次消化心肌組織的膠原酶，以去除組織中的血細胞及外表的纖維細胞；④37℃消化時應不斷搖擺使消化液與組織充分混勻；⑤經過反復驗證，在心肌細胞培養(yǎng)的最初24h內越少移動細胞，其生長狀態(tài)越好?！疽韵聻閰⒖嘉墨I】[1]張鳳，周廣海，王堯，等。心房鈉尿肽與心肌肥大的關系[J].中華高血壓雜志，2008,16〔8〕:763-766.[2]HararyI,FarleyB.Invitrostudiesofsingleisolatedbeatingheartcell[J].Science,1960,131〔3414〕:1674-1675.[3]孫月，徐洪，徐丁潔，等。新生鼠肺成纖維細胞原代培養(yǎng)方式方法的比擬與體外肌成纖維細胞分化模型的建立[J].醫(yī)學研究生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