微生物快速檢測法(DME)

微生物快速檢測法（DME）1、原理細(xì)菌和酵母菌都能在染色后通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)，本程序可以對淀粉糊漿中活菌/死菌微生物污染進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)2、儀器及試劑1、顯微鏡，40X物鏡下觀察2、天平3、微波爐4、三聯(lián)不銹鋼過濾器（包括三聯(lián)支架+真空泵）5、平口鑷子6、0.8um/25mm過濾膜7、載玻片8、蓋玻片9、異丙醇，100%10、吖啶橙染色劑11、浸油12、75%乙醇13、洗潔精14、無菌杯3、操作程序1取一潔凈的無菌杯（可重復(fù)使用，用洗潔精加自來水清洗干凈后，使用離子水沖洗至少三次）2稱取樣品（取13克加去離子水至103克）3使用微波爐將配置好的樣品微熱（使樣品充分溶解）4用去離子水將三聯(lián)過濾杯沖洗干凈。（開過濾器，開泵一關(guān)過濾器，關(guān)泵—開排氣閥，排氣抽真空）（注：后可加入75%乙醇5ml，放置1min后濾掉）5使用平口鑷子放置濾膜，亮面朝上，濾膜與過濾砂芯中間無縫隙6取出熱好的樣品，過濾，至103克樣品全部濾完7關(guān)過濾器，關(guān)泵，排氣8加入2.5ml吖啶橙染色劑，使其溢滿整個濾膜9染色一分鐘后，關(guān)排氣閥，開過濾器，開泵10使用異丙醇沖洗（至少2.0ml）11在等待染色的lmin時，取一載玻片加一滴浸油12在泵開啟的狀態(tài)下，用鑷子移下濾膜（有助于濾膜干燥，便于觀察）13在濾膜上再加一滴浸油，蓋上蓋玻片并用鑷子將蓋玻片壓實(shí)（便于觀察）14將放好濾膜的載玻片放在顯微鏡的40倍物鏡下觀察15細(xì)菌和酵母菌呈現(xiàn)桔色或綠色（細(xì)菌為針尖大小的亮點(diǎn)，酵母菌呈有規(guī)則的圓形或橢圓形，多為兩個呈三個連在一起）16取中間位置觀察20個視野，菌落總數(shù)/ml為20個視野的平均值*8617觀察時，應(yīng)注意濾膜四周的細(xì)菌，最好每個角落能觀察到注意：1每個檢測過程都在通風(fēng)櫥中進(jìn)行2此檢測方法檢測出的菌類為死菌和活菌的總數(shù)4、技術(shù)程序可以采用集中計(jì)算方法確定每毫升的菌數(shù)，需要確定顯微鏡的視野范圍，這個面積就是顯微鏡在給定放大倍數(shù)內(nèi)可觀察到的視野范圍的總面積。4.1在400倍放大顯微鏡下，測定視野直徑。4.2測得直徑后，視野面積便可由下式計(jì)算：視野面積=（直徑/2）2*3.144.3下一步是計(jì)算濾膜的面積。盡管濾器的直徑是25mm，但過濾使用的不是濾器的總面積。有水和一滴染色劑結(jié)合的50ml樣品應(yīng)該被過濾?？梢詼y量染色劑存留的濾器的面積，濾器直徑一旦被測量，濾器面積視野數(shù)量按下式計(jì)算：視野數(shù)/ml=（濾器面積/視野面積）/樣品的毫升數(shù)至少應(yīng)該計(jì)數(shù)20個視野，然后取視野平均值，計(jì)算每毫升的菌數(shù)按下式計(jì)算：菌數(shù)/ml=（每毫升的平均菌數(shù)）*（視野數(shù)/ml）5注意事項(xiàng)5.1樣品量為130克5.2快速檢測：可以使用20X的物鏡快速檢查存在的酵母菌和霉菌。5.3視野的報告：如果錢10個視野計(jì)算出每毫升計(jì)數(shù)大于2000，則這10個視野就足以報告此