動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理第一頁，共六十九頁，2022年，8月28日細(xì)胞與組織培養(yǎng)（體外培養(yǎng)）(cellandtissueculture)：

從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長。包括三個(gè)層面：器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)分別代表細(xì)胞水平、組織水平或器官水平的培養(yǎng)第二頁，共六十九頁，2022年，8月28日動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主要領(lǐng)域及意義動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生存條件主要講3方面問題：第三頁，共六十九頁，2022年，8月28日一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主要領(lǐng)域及意義

單克隆抗體與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)動(dòng)物胚胎孵育與畜牧業(yè)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè)動(dòng)物克隆的廣泛應(yīng)用第四頁，共六十九頁，2022年，8月28日1.單克隆抗體技術(shù)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)單克隆抗體技術(shù)步驟：*骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合

雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)。第五頁，共六十九頁，2022年，8月28日雜交瘤細(xì)胞的特性：*既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology)。

第六頁，共六十九頁，2022年，8月28日單克隆抗體的特性：*具有高度的特異性、靈敏性與準(zhǔn)確性應(yīng)用：臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷。生產(chǎn)各種免疫疫苗。用于某些腫瘤的治療。用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。

第七頁，共六十九頁，2022年，8月28日2.胚胎孵育與畜牧業(yè)農(nóng)畜動(dòng)物胚胎移植：利用胚胎技術(shù)大批量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胚胎，從而可以降低胚胎成本，擴(kuò)大移植胚的來源。體外受精：加快農(nóng)畜良種化。利用體外受精技術(shù)進(jìn)行核移植、性別控制和基因?qū)?，工廠化生產(chǎn)遺傳性狀穩(wěn)定、生產(chǎn)性能優(yōu)良的家畜。第八頁，共六十九頁，2022年，8月28日類型動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物

人疫苗小兒麻痹癥、狂犬、風(fēng)疹、腦炎、乙肝表面抗原、皰疹、某些癌癥動(dòng)物疫苗口蹄疫、雞瘟病、豬霍亂、馬腦炎、牛痢疾、犬瘟、草魚出血病酶

尿激酶、細(xì)胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶原激活劑、膠原酶、酪氨酸脫羧酶激素

促紅細(xì)胞生成素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、絨毛膜促性腺激素、促黃體激素、促濾泡激素、生長激素免疫調(diào)節(jié)因子白細(xì)胞活化因子、轉(zhuǎn)移抑制因子、胸腺素、白細(xì)胞介素、干擾素、血清胸腺因子、巨噬細(xì)胞毒力因子、β-細(xì)胞生長因子

3.動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)與現(xiàn)代醫(yī)藥治療性抗體抗體藥物第九頁，共六十九頁，2022年，8月28日4.動(dòng)物克隆技術(shù)有益應(yīng)用動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用前景：（1）保存優(yōu)良的動(dòng)物品種（2）拯救瀕臨滅絕的珍惜動(dòng)物（3）利用克隆動(dòng)物工廠生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物（4）利用克隆技術(shù)生產(chǎn)人體器官第十頁，共六十九頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、動(dòng)物細(xì)胞特性動(dòng)物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性培養(yǎng)條件下動(dòng)物細(xì)胞生長特性培養(yǎng)條件下動(dòng)物細(xì)胞生理特性第十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日1.動(dòng)物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性在活體內(nèi)，動(dòng)物細(xì)胞:分化的動(dòng)物細(xì)胞在功能上具有明確的分工，并具有明顯的形態(tài)學(xué)特征。

如肌肉細(xì)胞為紡錘形，以便于行使收縮伸展功能；神經(jīng)細(xì)胞具有很長的分支，很多的纖維，以便接受和傳遞刺激；紅細(xì)胞呈園盤狀，有利于和周圍環(huán)境交換氣體和在血管內(nèi)流動(dòng)；上皮細(xì)胞由于它要覆蓋于表面，常常相互擠壓成不規(guī)則形狀。增殖分化第十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日活體內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞按照分裂能力可以分為三大類：第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞，可以繼續(xù)不斷地分裂，如骨髓干細(xì)胞、各類前體細(xì)胞；第二類細(xì)胞群是永久失去分裂能力的細(xì)胞，如各類高度特化的細(xì)胞；第三類是靜止細(xì)胞群，即所謂的G0細(xì)胞，在正常情況下，它們不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，則重新進(jìn)入細(xì)胞分裂。如人的肝臟細(xì)胞等。第一類和第三類細(xì)胞在適當(dāng)條件下可進(jìn)行離體培養(yǎng)。第十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日2.培養(yǎng)條件下動(dòng)物細(xì)胞的生長特性離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可分為：

貼壁依賴型(anchorage-dependent)非貼壁依賴型(anchorage-independent)兼性貼壁細(xì)胞第十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日1）貼壁依賴型簡(jiǎn)稱為貼壁細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型、多形性細(xì)胞型。

成纖維細(xì)胞型

細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，胞內(nèi)呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有園形核，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長短不同的突起。細(xì)胞群常連接成網(wǎng)，生長時(shí)呈放射狀或火焰狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)均屬這一類型。第十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日游走細(xì)胞型

在支持物上分散生長，不連接成片，細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快而方向不規(guī)則。在一定條件下，可轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞型。多形性細(xì)胞型

某些組織和細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，難以確定它們的穩(wěn)定形態(tài)，可統(tǒng)歸于多形細(xì)胞型。nervecell第十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日第十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日2）非貼壁依賴型

也稱懸浮型，這類細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞等均屬于此類，細(xì)胞一般呈圓形。

3）兼性貼壁細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，有些細(xì)胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國地鼠卵巢細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞等。

第十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日4.培養(yǎng)條件下動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)1）動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長動(dòng)物細(xì)胞分裂周期一般為12～48小時(shí)，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而有差異，即使是同一種屬，不同部位的細(xì)胞所需的時(shí)間也不同。此外，培養(yǎng)條件如溫度、pH、培養(yǎng)基的成分等，也會(huì)影響分裂周期的長短。第二十頁，共六十九頁，2022年，8月28日第二十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日2）接觸抑制(contactinhibition)現(xiàn)象除少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞外，大多數(shù)正常二倍體細(xì)胞的生長都需要在一定的基質(zhì)（如玻璃、塑料等）上貼附，伸展后才能增殖。當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片即每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱之為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。第二十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日3）有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)起始物--原代培養(yǎng)（primaryculture）經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細(xì)胞系(finitecellline)。有限細(xì)胞系即使培養(yǎng)條件均能滿足細(xì)胞繁殖生長，它們也只能在有限的時(shí)間內(nèi)生存，一般經(jīng)過30~50世代后細(xì)胞將逐漸死亡。第二十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日“代”：繼代次數(shù)和存活時(shí)間的長短因細(xì)胞來源的年齡和種族不同而有差異。年齡越大繼代次數(shù)越少。人胚成纖維細(xì)胞約可以培養(yǎng)50代，而成年人的成纖維細(xì)胞則不能繼代50次，同樣是成纖維細(xì)胞，取自雞胚的成纖維細(xì)胞可繼代培養(yǎng)30代，而小鼠的只能培養(yǎng)8代。

第二十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當(dāng)超過有限世代后，它們可能有兩種情況：一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細(xì)胞系或稱連續(xù)細(xì)胞系。有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)換期(crisis)，其轉(zhuǎn)換過程在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化(invitrotransformation)。永久細(xì)胞系有如下特征：細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長速率增加，倍增時(shí)間縮短；對(duì)血清的依賴性減??；貼壁依賴性降低；細(xì)胞異倍體和非整倍體增加，細(xì)胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。永久細(xì)胞系的建立是動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的前體。

第二十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日4）動(dòng)物細(xì)胞的環(huán)境敏感性動(dòng)物細(xì)胞與微生物和植物細(xì)胞相比，其培養(yǎng)難度要大一些，其主要原因是動(dòng)物細(xì)胞只有細(xì)胞膜，而沒有細(xì)胞壁的保護(hù)。動(dòng)物相比對(duì)培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，一切影響細(xì)胞膜變形的因素都會(huì)影響動(dòng)物細(xì)胞存活。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)營養(yǎng)條件的要求也十分復(fù)雜。

第二十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日三、動(dòng)物細(xì)胞的環(huán)境要求第二十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求1）無污染環(huán)境2）溫度

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)溫度一般是25～28℃哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度一般是37℃。

總體上講，動(dòng)物細(xì)胞忍受低溫的能力比忍受高溫的能力強(qiáng)。如哺乳動(dòng)物細(xì)胞在45℃下只能存活1小時(shí)，但在25℃條件下仍然能慢速生長，并維持長時(shí)間不死，甚至在4℃下數(shù)小時(shí)后，再置于適宜溫度下細(xì)胞仍然可以正常生長。液氮凍存。第二十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日3）pH

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的pH一般在，低于6.8或高于7.6都不利于細(xì)胞生長，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)pH的要求因培養(yǎng)時(shí)間長短有關(guān)，一般原代細(xì)胞要求較嚴(yán)格，而永久細(xì)胞系對(duì)pH具有較強(qiáng)的忍耐性。

第二十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日4）氣體環(huán)境及溶氧一般細(xì)胞在培養(yǎng)初期要求較低的溶氧水平，而在對(duì)數(shù)生長期或培養(yǎng)后期，對(duì)溶氧水平要求增加，如果供氧不足，將導(dǎo)致細(xì)胞缺氧而死亡。除了氧氣供應(yīng)外，還應(yīng)注意培養(yǎng)基的氧氣和CO2的平衡。第三十頁，共六十九頁，2022年，8月28日5）滲透壓動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)滲透壓包括兩個(gè)方面的問題：培養(yǎng)基的滲透壓維持細(xì)胞體內(nèi)的滲透壓維持

大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)滲透壓的忍耐程度較強(qiáng)，只要培養(yǎng)基的滲透壓變化不是很劇烈，一般對(duì)培養(yǎng)物不會(huì)造成致命傷害。動(dòng)物細(xì)胞滲透壓的維持一般采用平衡鹽溶液。

第三十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)第三十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日基本概念和基本步驟:取材分離和組織消化細(xì)胞計(jì)數(shù)常用培養(yǎng)法細(xì)胞的常規(guī)檢查細(xì)胞系與克隆動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇第三十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日一、基本概念（generalconcept）：細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）：將動(dòng)物組織或細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，在模擬機(jī)體內(nèi)的生長環(huán)境條件下，使其在體外環(huán)境繼續(xù)生長增殖的過程。原代（初代）培養(yǎng)：指將機(jī)體取出的組織或細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過程。原代培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右，稱為原代細(xì)胞。傳代（繼代）培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。第三十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、取材、分離和組織消化(todrawthematerialsfromtissue，separation，digestion)（一）取材——獲取組織原則上各種動(dòng)物組織都可進(jìn)行體外培養(yǎng)，而實(shí)際上幼齡組織（尤其是胚胎組織）比老齡組織容易培養(yǎng)、分化程度低的比分化程度高的容易培養(yǎng)、腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材前要對(duì)所取組織的各種情況進(jìn)行詳細(xì)記錄；所用器皿用前嚴(yán)格消毒滅菌，取材時(shí)嚴(yán)格無菌操作。第三十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日取材方法:

處死動(dòng)物→取出組織塊，放入小燒杯中→用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎塊，補(bǔ)加3~5mlHanks液，用吸管輕輕吹打；→低速離心，棄去上清液，留下組織塊。（也可用手術(shù)刀片將組織塊切碎，優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞損傷較小，缺點(diǎn)是操作時(shí)間長，容易污染）→對(duì)某些軟組織碎組織塊，可放入注射器玻璃管中或1mm不銹鋼/尼龍網(wǎng)篩擠壓分離。第三十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）組織消化(tissuedigestion)

用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。1、常用消化液適用范圍（1）胰蛋白酶：適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚 胎、羊膜、上皮、肝、腎、傳代細(xì)胞等。（2）膠原酶：適用于纖維組織、上皮組織、癌組織等。（3）其他酶：鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等，根據(jù)酶的作用特點(diǎn)及組織成分不同適當(dāng)選用（4）EDTA：最適于消化傳代細(xì)胞時(shí)，常與胰蛋白酶配合使用。 第三十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、組織消化操作方法(tissuedigestionmethodofoperation)（1）胰蛋白酶消化(trypsindigestion)①將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶中，加入30~50倍體積的0.25%胰蛋白酶；②37℃水浴內(nèi)消化30~60min，每5~10min搖動(dòng)一次。根據(jù)效果可中間更換消化液。（靜止10min，吸去2/3上清液，補(bǔ)加新鮮胰蛋白酶）③Hanks液漂洗兩次，每次2~3min；④800r/min離心5min，棄上清液，加入營養(yǎng)液。如有大塊，可用紗網(wǎng)過濾。如消化傳代細(xì)胞，可與EDTA混用。第三十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）膠原酶消化(collagenaseenzymaticdigestion)①培養(yǎng)瓶中放入1~5mm3大小的碎組織塊，加5ml2000u/ml的膠原酶溶液，使終濃度為200u/ml，pH6.5；②36.5℃水浴24~48h，視情況可適當(dāng)延長，無需搖動(dòng)。期間可更換酶液一次；③見組織塊已變軟，分散于瓶底時(shí)，輕微震蕩使散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。小心倒出培養(yǎng)液，瓶底可能附著一些巨噬細(xì)胞，借此可將其分開（單獨(dú)培養(yǎng)或棄之不用）；④800r/min離心5min，棄上清液，重懸于BSS液中，再重復(fù)離心一次；⑤加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用于接種。第三十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日三、細(xì)胞計(jì)數(shù)(cellcounting) ——計(jì)數(shù)懸浮液中細(xì)胞的形態(tài)及濃度，以判斷消化或稀釋程度（亦用于培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度的檢查）①染色：在干凈的離心管中加入9滴細(xì)胞懸液，再加入1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)，混勻，靜置2~3min；②充池：在計(jì)數(shù)板蓋片邊緣加入1~2滴染色的細(xì)胞懸液，使之完全充滿計(jì)數(shù)板與蓋玻片間的空間（無氣泡或溢出）第四十頁，共六十九頁，2022年，8月28日第四十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日③計(jì)數(shù)：在顯微鏡下記錄計(jì)數(shù)板四角四個(gè)大方格中的活細(xì)胞（不染色細(xì)胞）總數(shù)。一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。壓線細(xì)胞，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。④計(jì)算：

細(xì)胞懸液濃度（細(xì)胞個(gè)數(shù)/ml）=（4大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)注意：如細(xì)胞團(tuán)數(shù)超過10%，說明消化不充分。細(xì)胞接種濃度：3~10×105/ml第四十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日四、常用培養(yǎng)法(generalcultivation)（一）組織塊培養(yǎng)法(tissuepiececultivation)

將組織塊剪切成小塊，直接放入培養(yǎng)瓶中，貼附一段時(shí)間后，細(xì)胞從組織塊長出，最終形成單層細(xì)胞。第四十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日1、懸滴培養(yǎng)法(dropculture)——最簡(jiǎn)單、最原始的培養(yǎng)法懸滴培養(yǎng)法缺點(diǎn)：細(xì)胞生長空間狹小氣體不足，不能持續(xù)長時(shí)間生長培養(yǎng)基易液化，需要常更新培養(yǎng)基凹玻片折光，不便于觀察。第四十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法(rotatetubeculture)①組織塊或細(xì)胞可交替地接觸營養(yǎng)液和空氣，利于細(xì)胞生長；②培養(yǎng)管緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，使整個(gè)管內(nèi)壁全部長滿細(xì)胞，提高了細(xì)胞產(chǎn)量，適于較大量的組織培養(yǎng)和各種長期傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。缺點(diǎn)：不易在顯微鏡下觀察。3、灌注小室培養(yǎng)法(dabblebooth

cultivation)為大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)提供了參考原理。第四十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日4、卡氏瓶培養(yǎng)法卡氏瓶(carlsberg'sflask)（如下圖）：①將組織塊剪碎，BSS漂洗。②轉(zhuǎn)移到另一只培養(yǎng)皿，在解剖顯微鏡下去掉不需要的組織如脂肪、壞死組織等。將組織塊切成1mm3小塊。③用預(yù)先潤濕的滴管轉(zhuǎn)移到消毒離心管，靜置使組織小塊下沉，吸去上清。以新鮮BSS漂洗。重復(fù)2~3次。第四十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日④轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶（每個(gè)25ml的培養(yǎng)瓶可放置20~30塊組織小塊），吸去液體。加入1ml生長培養(yǎng)液，輕斜擺動(dòng)培養(yǎng)皿，使組織小塊均勻分布。蓋好瓶蓋，36.5℃培養(yǎng)18~24h。⑤待組織塊粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培養(yǎng)液；然后每周更新培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)3~5周，細(xì)胞不斷增長，肉眼或低倍鏡下觀察可見圍繞組織周圍生長猶如日暈，稱“生長暈”。⑥取出中央組織塊，用預(yù)先濕潤的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶。重復(fù)④~⑥操作。⑦在原生長暈培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)換入新鮮培養(yǎng)液。待生長暈細(xì)胞擴(kuò)展至約50%培養(yǎng)瓶底表面時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。第四十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）單層細(xì)胞培養(yǎng)法(monolayermethod)

組織塊經(jīng)胰酶消化分散成較小的細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，在合成培養(yǎng)液中附在瓶壁上長成單層，即形成所謂單層細(xì)胞培養(yǎng)。

1、原代培養(yǎng)(primaryculture)（初代培養(yǎng)）第四十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日第四十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、傳代培養(yǎng)(serialsubcultivation):傳代的理想時(shí)期：對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞80~90%或剛剛?cè)繀R合。方法：①消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶與EDTA混合液，蓋滿瓶底，作用2~5min；②檢查：如細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞質(zhì)回縮，則終止消化。③終止消化：吸出消化液；加入Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，洗去殘留的消化液。如單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。③細(xì)胞計(jì)數(shù)：用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落，制成懸液，計(jì)數(shù)并記錄其濃度；④重新稀釋接種培養(yǎng)。第五十頁，共六十九頁，2022年，8月28日根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，掌握細(xì)胞消化時(shí)間和選擇消化方法。第五十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日（三）組織塊單層細(xì)胞培養(yǎng)法(tissuemonolayermethod)

把組織剪成更小的小塊（0.5~1mm3），由于其體積很小，無需任何粘著劑即能直接附于瓶壁上。細(xì)胞自組織塊邊緣向外長出，最后連接成片，形成單層細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化了原代單層細(xì)胞的培養(yǎng)過程。是當(dāng)前各培養(yǎng)室常用的原代培養(yǎng)法。第五十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日方法：①取一定量組織置于小燒杯中，先用BSS漂洗2~3次去掉血污，然后反復(fù)剪成0.5~1mm3的小塊。②加入1~2ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使組織塊懸浮。③移入培養(yǎng)瓶，并在瓶壁上吹勻。翻轉(zhuǎn)，使有組織塊的瓶壁朝上，加入培養(yǎng)液，塞緊瓶口，置37℃溫箱培養(yǎng)1~2h；待組織牢固貼于瓶壁，再輕輕翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸泡組織小塊，靜止培養(yǎng)。為促進(jìn)細(xì)胞貼壁，也可先在瓶?jī)?nèi)壁涂一層血清。第五十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日第五十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日（四）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法(suspendedcellculture)

利用旋轉(zhuǎn)、振搖或攪拌的方法不讓細(xì)胞貼壁，使其在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。適用細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基＋5~10%血清＋0.1%甲基纖維素培養(yǎng)細(xì)胞密度：5~7×105cell/ml.特點(diǎn)：細(xì)胞增殖快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單，是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的理想模式。第五十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日（五）微載體培養(yǎng)法(microcarrierculture)載體：DEAE-交聯(lián)葡聚糖微粒、DEAE-纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、無機(jī)玻璃基質(zhì)微載體等微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞步驟：1、選擇合適的微載體類型——獲得最大量的細(xì)胞，以微載體能全部懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)為最好2、浸泡水化及消毒 用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液浸泡3h以上3、接種（根據(jù)細(xì)胞類型決定接種濃度）4、培養(yǎng)觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù)5、消化6、分離細(xì)胞或傳代培養(yǎng)第五十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（六）多孔載體培養(yǎng)(porositycarrierculture)優(yōu)點(diǎn)：增加細(xì)胞固定化穩(wěn)定性，比表面積大，保證細(xì)胞充分的生長空間，細(xì)胞生長在載體內(nèi)部，免受機(jī)械損傷。多孔載體被證明是用于大規(guī)模高密度細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)秀細(xì)胞生長支持物，具有逐步取代傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的趨勢(shì)。（七）中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)法(hollowfibercellculture)

模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管”——中空纖維來供給細(xì)胞生長的營養(yǎng)等條件細(xì)胞向三維空間生長繁殖，形成類似組織的多層細(xì)胞群體，細(xì)胞密度可達(dá)109個(gè)/ml。適用于細(xì)胞代謝產(chǎn)物和分泌物的生產(chǎn)。第五十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日五、細(xì)胞系與克隆株（celllineandclone）1、細(xì)胞系的建立

原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜，培養(yǎng)初期，生長的細(xì)胞類型多種多樣隨培養(yǎng)時(shí)間延長：一些細(xì)胞退化、死亡；另一些細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境而生長繁殖培養(yǎng)物逐步變均勻。傳代培養(yǎng)意義：不僅在于維持細(xì)胞不斷地生長，而且使培養(yǎng)物逐步演變?yōu)榫哂性鲋衬芰?、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即細(xì)胞系。細(xì)胞系：*指從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來的一群特征專一、類型均勻的細(xì)胞，可以長期連續(xù)傳代。第五十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）限定細(xì)胞系（有限細(xì)胞系） 壽命有限，一般為20~80代（2）連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系（無限細(xì)胞系） 細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，可連續(xù)培養(yǎng)和生長，壽命變?yōu)椤盁o限”2、克隆株（細(xì)胞株） 分離單一細(xì)胞并使其繁殖形成的細(xì)胞群稱為細(xì)胞株。單個(gè)細(xì)胞的生活能力很弱，必須采取特殊的培養(yǎng)措施適應(yīng)和同化過程：在細(xì)胞接種到新培養(yǎng)液的初期，細(xì)胞既從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)，也要向培養(yǎng)液排出一定物質(zhì)，其結(jié)果使得培養(yǎng)液更易被吸收和利用。

第五十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日適應(yīng)培養(yǎng)液

制備：選擇生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，無死細(xì)胞和碎片，所用細(xì)胞的種類應(yīng)與要克隆的細(xì)胞相同。吸出培養(yǎng)液，用G6濾器過濾貯于冰箱中備用。 制備適應(yīng)性培養(yǎng)基時(shí)注意：選用成分齊全的合成培養(yǎng)基，可不加抗生素。第六十頁，共六十九頁，2022年，8月28日細(xì)胞株的制備方法（3種）：（1）集落形成分離法平皿中接種稀釋細(xì)胞細(xì)胞貼壁繁殖成許多小群選擇一個(gè)最好的細(xì)胞群做標(biāo)記機(jī)械法刮除所有其他細(xì)胞群培養(yǎng)保留下來的細(xì)胞群.第六十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日克隆成功的關(guān)鍵：①接種細(xì)胞數(shù)量要合適、細(xì)胞要分散得好。太多則使細(xì)胞操作不便，以每個(gè)平皿50~100個(gè)細(xì)胞為宜。②選擇細(xì)胞克隆時(shí)，應(yīng)逐日觀察，能證明被選留的細(xì)胞群確系來自于單個(gè)細(xì)胞。刮除和洗滌一定要徹底。第六十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）瓊脂分離法（agarSeparation）瓊脂培養(yǎng)基的制備：

選擇質(zhì)量好的瓊脂，用三蒸水配成3%的溶液，分裝，滅菌。培養(yǎng)方法：向瓊脂平皿中接種稀釋細(xì)胞懸液（適應(yīng)培養(yǎng)基），培養(yǎng)后，標(biāo)記出保留細(xì)胞，在顯微鏡下切下保留細(xì)胞處瓊脂小塊，在BSS中輕輕漂洗后，用適應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第六十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日（3）多孔塑料板分離法（foamedplasticsSeparation） 將1ml含有7~8個(gè)細(xì)胞的懸液接種到多孔無毒塑料板中，每一塊板上有數(shù)十個(gè)圓形小穴。選擇僅有單個(gè)細(xì)胞的