中國人乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性的基因芯片檢測方法,醫(yī)學遺傳學論文

中國人乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性的基因芯片檢測方法,醫(yī)學遺傳學論文硝酸甘油作為治療心絞痛的基本藥物之一廣泛用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油的舒血管作用通過釋放一氧化氮(NO)所介導。乙醛脫氫酶2(ALDH2)具有硝酸酯酶活性，對硝酸甘油轉化產生NO起了關鍵作用，而ALDH2基因Glu504Lys多態(tài)性，會導致ALDH2硝酸酯酶活性顯著下降，使硝酸甘油無效概率明顯上升(14．9%vs42．4%)。文獻建議，AL-DH2504Lys等位基因攜帶患者慎用硝酸甘油。ALDH2(504Lys)等位基因在歐美人群中攜帶率極低，但在中國人群中攜帶率較高，部分人群攜帶率高達30%。因而，在中國人群中檢測ALDH2(Glu504Lys)基因多態(tài)性具有積極的現(xiàn)實意義。本文研究建立了ALDH2(Glu504Lys)基因多態(tài)性檢測方式方法，以知足臨床檢測需求。1儀器和試劑PCR儀［BioerTC-96/G/H(b)，杭州博日科技有限公司］;離心機(飛鴿TGL-16GB上海安亭科學儀器廠);紫外分光光度計(onedrop1000，上海諾晶生物有限公司);點樣儀(GSM417，Affymetrix);生物芯片全自動雜交儀(BR-526，上海百傲科技股份有限公司);生物芯片識讀儀(BE-2．0，上海百傲科技股份有限公司);基因芯片圖像分析軟件(Arraydoctor2．0，上海百傲科技股份有限公司);凝膠電泳儀(PowerBC-600BC，上海博彩生物科技有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BioshineGelx1520，上海鷗翔生物有限公司)。DNA提取試劑盒(BST01051，上海百傲科技股份有限公司);雜交顯色試劑盒(BST03021，上海百傲科技股份有限公司);醛基修飾的載玻片(BSM03011，上海百傲科技股份有限公司);應用PrimerPremier5．0軟件設計一對引物:5＇Biotin-AAGACTTT-GGGGCAATACAG3＇，3＇CTTCTCAGGCTTAAAATGGG5＇;質控寡核苷酸:5＇Biotin-ACATCCTCTGGATGATGT-GAGACCATGCGGAGCCCCTCCACG3＇，2條檢測探針:野生型5＇(T)16CAGGCATACACTGAAGTGAAAA3＇，突變型5＇(T)16GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT3＇，1條質控探針:5＇NH2-(T)16GGTCTCACATCATCCAGAGGATGT3＇(上海生工生物工程服務有限公司);Taq酶，10buffer［天根生化科技(北京)有限公司］;dNTP(上海生工生物工程服務有限公司);EDTA抗凝外周靜脈血樣本(上海市第一人民醫(yī)院贈送);膽紅素(CAS#35-65-4，上海源葉生物有限公司);膽固醇(CAS#57-88-5，99%，上海將來實業(yè)有限公司);三酰甘油(CAS#538-24-9，上海將來實業(yè)有限公司)。2、方式方法與結果2．1臨床樣本EDTA抗凝外周靜脈血樣本(上海市第一人民醫(yī)院、長征醫(yī)院、華東醫(yī)院)，不分病種、檢測目的、性別、年齡，只要知足雙向測序和芯片檢測對樣本量要求即可入選。2．2樣本處理對EDTA抗凝外周靜脈血樣樣本，用DNA純化試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)提取全基因組DNA。DNA濃度為10～60ngl－1，A260/A280的比值在1．5～2．0。取已純化的DNA3．0l作為擴增模板，參加上游引物(10pmoll－1)、下游引物(3．3pmoll－1)各1．0l，Taq酶(2．5Ul－1)1．0l，10buffer2．5l，dNTP(各2．5mmolL－1)2．5l，雙蒸水14l，反響總體積25l。PCR反響條件為:50℃5min;94℃5min;94℃25s，60℃25s，72℃30s，35cycles;72℃5min;PCR產物4℃保存。2．3ALDH2基因芯片的制備將探針用少量純水溶解制備高濃度溶液，分別用2點樣緩沖液配制各探針的點樣液，將各點樣液根據(jù)要求依次參加到384孔板中。使用醛基修飾基片作為ALDH2基因多態(tài)性檢測芯片制造的固相支持物。采用GSM-417生物芯片點樣儀，根據(jù)設計的陣列圖1的點陣排布，進行點樣。點樣后置于恒溫箱中固定，避光保存。點樣時，環(huán)境溫度在18-26℃，相對濕度為45%～65%。探針點樣濃度為:5molL－1。將點好的芯片置于室溫過夜固定。2．4雜交檢測在BaiOe-Hyb全自動雜交儀按表1設置反響程序，按表要求用量分裝雜交顯色試劑盒各試劑。汲取150l雜交液，分別參加包含上述兩個檢測位點的擴增產物各10L，混勻。并將各試劑放入指定位置內，運行程序，雜交顯色反響自動進行。雜交完成后，將芯片顯色區(qū)用蒸餾水稍微沖洗、烘干，將芯片放入BE-2．0生物芯片識度儀中進行掃描，獲得的芯片雜交結果圖像，用基因芯片圖像分析軟件(Arraydoctor2．0，上海百傲科技股份有限公司)提取各點的信號強度，輸入基因判型的閾值，由軟件進行數(shù)據(jù)分析，輸出芯片檢測的基因型結果。2．5ALDH2顯色基因芯片性能評價2．5．1芯片檢測靈敏度選取經測序驗證ALDH2基因型為Lys504Lys的樣本，提取基因組DNA，濃度調整為50ngl－1，進行梯度稀釋。將每個稀釋度DNA進行PCR擴增并與芯片雜交，以重復三次檢測判型結果均正確的最低DNA量為檢出限。經試驗確定檢出限為5ng基因組DNA。2．5．2芯片檢測準確度選取3種ALDH2基因型的濃度為50ngl－1基因組DNA，分別進行PCR擴增并與芯片雜交。結果3種基因型樣本檢測結果均正確。2．5．3芯片檢測特異性取魚精DNA稀釋至接近于正常人基因組DNA抽提濃度(20ngl－1)作為陰性對照進行PCR擴增并與芯片雜交。檢測結果為陰性。2．5．4芯片檢測重復性選取ALDH2基因型為Lys504Lys的濃度為25ngl－1基因組DNA，進行PCR擴增并與芯片雜交，每個樣本重復檢測10次。10次檢測結果基因型均一致。2．6ALDH2顯色基因芯片干擾實驗取2-8℃保存不超過5d的三種ALDH2基因型別(ALDH2Glu504Glu編號:H1;ALDH2Glu504Lys編號:H2;ALDH2Lys504Lys編號:H3)的EDTA抗凝外周全血樣本，每種樣本分成5份，1份不加干擾物作為空白對照(編號:空)，1份參加3000mgdl－1三酰甘油(編號:G)，1份參加250mgdl－1膽固醇(編號:Ch)，1份參加20mgdl－1膽紅素(編號:Bi)，1份完全溶血(編號:He)。根據(jù)血液基因組DNA提取方式方法提取上述樣本血液基因組DNA，經PCR擴增并與芯片雜交檢測基因型，每種樣本重復2次，H3基因型的樣本量較少，只操作1次。研究結果顯示，含有上述干擾物質的血樣，經DNA提取后，DNA的濃度和純度與正?？瞻籽獦酉啾?，沒有顯著差異，經PCR擴增及基因芯片雜交檢測，結果正常并與已經知道基因型一致。因而EDTA抗凝全血樣本中含有3000mgdl－1的三酰甘油，250mgdl－1的總膽固醇，20mgdl－1的膽紅素，對ALDH2基因芯片測定沒有影響，完全溶血的EDTA抗凝全血對測定也沒有影響。2．7ALDH2顯色基因芯片精致細密度實驗選擇3種ALDH2基因型已經知道(雙向測序)的樣本，每個樣本分成三份，分別送三個參加臨床實驗的實驗室用申報試劑盒測定。每個實驗室采用三個批號的試劑盒，每個批號試劑對每個樣品由同一實驗室的三名檢驗員各測定三次。根據(jù)正確測定結果占總測定結果的百分率計算試劑盒產品的批內，批間精致細密度和差異。精致細密度實驗共獲得243個檢測結果。243個檢測結果與已經知道基因型均符合。以定性結果評價，批內批間均無差異。2．8ALDH2顯色基因芯片方式方法比對實驗將基因芯片檢測結果與雙向測序法檢測結果比擬，評價ALDH2顯色基因芯片方式方法臨床適用性。選擇三家醫(yī)療機構實驗室，共獲得1035份來自臨床檢驗的EDTA抗凝血樣。將選取的臨床病人檢測樣本一分為二，一份直接送交選定的基因測序機構對樣本基因組DNA中ALDH2基因的Glu504Lys位點進行雙向測序;一份進行芯片檢測。芯片檢測或測序不成功的樣本予以剔除。方式方法比對研究數(shù)據(jù)見表2，共獲得1026個基因芯片檢測結果和1012份雙向測序結果。樣本存在3種ALDH2基因型如此圖2所示。經統(tǒng)計有1009份樣本基因芯片檢測結果和基因測序結果均完好，比對分析，有1007份基因型檢測結果與測序結果完全一致，有2份樣本結果不一致，芯片檢測結果為ALDH2(G/G)型，測序結果為(G/L)型。經實驗分析，可能的原因是樣本DNA提取失敗，濃度低于檢出限所致。統(tǒng)計結果顯示，測試試劑盒臨床檢測的檢出率為:99．13%(1026/1035);正確率為:99．80%(1007/1009)。2．9ALDH2顯色基因芯片穩(wěn)定性實驗取制備好的ALDH2基因芯片24片及配套的PCR擴增及雜交顯色試劑，置于－20℃冰箱長期儲存，分別于0，1，3，6，12，18個月取出3片，用新鮮ED-TA抗凝血樣提取的濃度稀釋至8ngl－1的雜合DNA進行PCR擴增并與芯片雜交，結果與新制備的ALDH2基因芯片及配套的PCR擴增及雜交顯色試劑檢測結果比擬。實驗結果見表3，ALDH2顯色基因芯片及其配套試劑，在－20℃儲存18個月，檢測靈敏度沒有明顯變化，具有良好穩(wěn)定性。3、討論3．1芯片設計臨檢用基因芯片的設計包括探針構造的設計;質控探針的考慮;探針濃度的選擇;陣列排布的設計等。在探針構造設計上，為便于探針固定在醛基基片上，探針的5＇端進行氨基修飾;為保證探針與擴增產物雜交反響的充分性，減小反響的空間位阻，在探針與氨基之間還能夠包含一段5～25聚的聚脫氧胸苷酸。質控探針的設置應當以到達質量控制目的為原則。本研究基因芯片設置的質控探針能夠同時起到陽性質控探針和化學修飾探針的作用。該探針與檢測探針一樣只進行了5＇氨基修飾，在基片上的固定效果能夠反映探針修飾質量;同時該探針只與反響體系中外加的帶有生物素標記的靶標(質控寡核苷酸)發(fā)生特異性雜交反響，該反響只與雜交經過相關，故可用于監(jiān)控雜交經過的質量。鑒于芯片是用于人染色體基因檢測，能夠不設置陰性對照探針和內對照探針。使用本芯片時，需用陽性對照品和陰性對照品建立嚴格反響條件，并定期重復上述實驗來控制芯片雜交的特異性。對于芯片陣列的設計，必須考慮有助于克制點樣誤差、實驗偏差、軟件自動分析結果時可能出現(xiàn)誤判的各種可能。通常將陽性對照探針按一定規(guī)則排布，便于軟件自動對陣列的定位、尋點、采集信號。每個探針點的重復次數(shù)最好不少于3次，取平均值可克制點樣誤差。本研究每個探針重復6次，穿插排列，除有利于克制點樣誤差，還可發(fā)現(xiàn)由于實驗偏差導致的信號不均勻分布導致的誤判。3．2芯片性能評價基因芯片檢測技術操作簡便、可快速、準確、高通量的分析數(shù)以千計的基因組信息，非常合適于常規(guī)臨床檢驗。評價基因芯片性能的方式方法和指標必須與實際應用相對應。臨床檢驗關心的性能指標主要包括:準確性、靈敏性、特異性、重復性、抗干擾性、穩(wěn)定性等。評價上述指標時，應當使用真實的臨床樣本，而不建議使用質粒。質粒比基因組小很多，比擬純，試驗結果與真實樣本差異很大。在評價靈敏性時，宜選擇雜合型樣本。同等濃度下與純合子相比，雜合型樣本等位基因的拷貝數(shù)減半，對擴增的影響更大。評價重復性時，選擇中等濃度DNA更有代表性。3．3測定結果分析文獻報道，ALDH2504Lys等位基因在歐美人群中攜帶率極低，但在中國漢族人群中的攜帶率17%～