基因工程制備胰島素2

基因工程制備胰島素一、 胰島素的定義胰島素是由胰島B細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。二、 目前臨床使用的胰島素來(lái)源1、 動(dòng)物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個(gè)氨基酸不同，牛胰島素中有3個(gè)氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體。2、 半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素。3、 重組人胰島素(現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素)：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。三、 目前，國(guó)際上生產(chǎn)醫(yī)用重組人胰島素(recombi—nanthumaninsulin,rhl)的方法。1、 用基因工程大腸桿菌escherichiacoli,E.CO—)分別發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素(humaninsulin,hi)的A、B鏈，然后經(jīng)化學(xué)再氧化法，使兩條鏈在一定條件下重新形成二硫鍵，得到hl。這一方法缺點(diǎn)較多，目前己較少使用；2、 用基因工程E.coli發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素原(hu—manpeoinsulin,hPI),后經(jīng)加工形成h"E.coli系統(tǒng)表達(dá)量高，但缺點(diǎn)是不利于表達(dá)hl這樣的小蛋白，產(chǎn)物易降解，故常采用融和蛋白形式將hPI連接在一個(gè)較大的蛋白質(zhì)后，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的后加工才能形成有活性的hi；3、通過(guò)基因工程酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)hPI,經(jīng)后加工形成hlO酵母系統(tǒng)下游后加工比細(xì)菌表這系統(tǒng)簡(jiǎn)單，但缺點(diǎn)是生產(chǎn)慢，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，旦重組蛋白分泌量少(150mg/L),產(chǎn)量低。因此，雖然rhl投放市場(chǎng)巳久，但人們一直在努力尋求和探索更加有效的表達(dá)系統(tǒng)和高效的表達(dá)策略12J,尤其是對(duì)CO一尻表達(dá)系統(tǒng)的研究更是越來(lái)越深入，用E.coli系統(tǒng)表達(dá)hPI的策略也越來(lái)越多。另一方面，在胰島素的基因工程生產(chǎn)中，下游處理非常復(fù)雜，復(fù)雜的卜,游處理極大地降低了胰島素的最終收率。本研究圍繞著提高重組目的蛋白表達(dá)量，簡(jiǎn)化卜游處理過(guò)程等方面進(jìn)行探索，建立了一套經(jīng)過(guò)優(yōu)化的高效完整的基因工程E.coli發(fā)酵表達(dá)(His)6ArgArg一人胰島素原[(His)6ArgArghumanproinsulinPPhPI],后加工成hl的制備工藝。四、基因工程制備胰島素1、提取目的基因：既從人的DNA中提取胰島素基因，可■使用限制性?xún)?nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。主要有如下4種方法：(1)鳥(niǎo)槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)附近基因進(jìn)行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，用DNA分子雜交，即DNA探針(2)人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒(méi)有內(nèi)含子。(3)從基因文庫(kù)中提取：也就是事先已經(jīng)提取完畢的拿來(lái)用(4)PCR擴(kuò)增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運(yùn)作2、提取質(zhì)粒：使用細(xì)胞工程/培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為環(huán)狀。主要有如下2種方法：(1)堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。（2）煮沸法3、基因重組：取出目的基因與質(zhì)粒，先利用同種限制性?xún)?nèi)切酶將質(zhì)粒切開(kāi)，再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”,形成一個(gè)能表達(dá)出胰島素的DNA質(zhì)粒。4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌：再大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì)，如CaCl2,這使細(xì)胞會(huì)吸收外源基因，此時(shí)將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會(huì)將重組質(zhì)粒吸收。將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入受體細(xì)胞，此時(shí)的細(xì)胞處于感受態(tài)（理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生理狀態(tài)）O5、胰島素的產(chǎn)生：再大腸桿菌內(nèi)，質(zhì)粒通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后，便產(chǎn)生出胰島素蛋白質(zhì)。通過(guò)大腸桿菌的大量繁衍，便可大量生產(chǎn)出胰島素。（注意：大腸桿菌產(chǎn)出的是多肽鏈，因?yàn)樵松餂](méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，不能進(jìn)行多肽的折疊、修飾等，還需人為進(jìn)行菌體外加工。）五、關(guān)于胰島素制備的一些問(wèn)題人體是這么產(chǎn)生胰島素的？第11對(duì)染色體短臂上胰島素基因區(qū)DNA向mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA從細(xì)胞核移向細(xì)胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)譯成由105個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原。前胰島素原經(jīng)過(guò)蛋白水解作用除其前肽，生成86個(gè)氨基酸組成的長(zhǎng)肽鏈胰島素原(Proinsulin)O胰島素原隨細(xì)胞漿中的微泡進(jìn)入高爾基體，連接上二硫鍵，經(jīng)蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三個(gè)精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒(méi)有作用的C肽，形成a鏈和鏈的胰島素，分泌到B細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)中。大腸桿菌沒(méi)有高爾基體等細(xì)胞器，基因工程如何利用大腸桿菌合成胰島素？《微生物學(xué)教程》(周德慶)1978年美國(guó)的2個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作，通過(guò)基因工程使E.coli合成了人胰島素。在實(shí)驗(yàn)室中將人胰島素基因A、B鏈的人工合成基因分別組合到E.coli的不同質(zhì)粒上，然后再移至菌體內(nèi)，著種重組質(zhì)粒在E.coli細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而使帶有A、B鏈基因的工程菌株分別產(chǎn)生人胰島素A、B鏈，然后再用人工的方法，在體外通過(guò)二硫鍵使這2條鏈連接成有活性的人胰島素。所以大腸桿菌產(chǎn)生的胰島素，需要用人工的方法，在體外通過(guò)二硫鍵使這2條鏈連接成有活性的人胰島素。大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞器只有線粒體，但它有相關(guān)的酶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。和藍(lán)藻進(jìn)行光合作用一樣，藍(lán)藻也沒(méi)有葉綠體，但它可以合成相關(guān)的酶。因此，只需要細(xì)胞質(zhì)就可以了！1、合成胰島素需要高爾基體和線粒體是對(duì)人或真核生物而言2、原核生物的生長(zhǎng)和發(fā)育也需要蛋白質(zhì)，從哪里來(lái)的呢？當(dāng)然是自身合成，這說(shuō)明原核生物合成蛋白質(zhì)只需要線粒體和一些酶，當(dāng)然還有能量人體產(chǎn)生胰島素首先是一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄成一個(gè)mRNA,再翻譯為一條肽鏈，這條肽鏈再加工，就形成了由二硫鍵連接的2條肽鏈。通過(guò)基因工程在E.coli產(chǎn)生胰島素是先分別形成A、B鏈的2個(gè)基因，轉(zhuǎn)錄形成2個(gè)mRNA,翻譯成2條肽鏈，在E.coli外通過(guò)二硫鍵使這2條鏈連接成有活性的人胰島素。六、胰島素的研究歷史胰島素的發(fā)現(xiàn)是20世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)界最為重大的成就之一。同時(shí)胰島素的問(wèn)世也引起了許多科學(xué)家的興趣。他們對(duì)胰島素的生產(chǎn)、生物合成、化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)制等進(jìn)行了一系列的研究并獲得了多個(gè)里程碑式的成果。動(dòng)物胰島素的生產(chǎn)起始于加拿大的ConnaughtLaboratories，大量生產(chǎn)主要在美國(guó)的禮來(lái)(EliLilly)公司。1923年末商品胰島素己廣泛應(yīng)用于臨床。我國(guó)動(dòng)物胰島素的生產(chǎn)起步也不晚。解放前，上海的楊氏藥廠己能生產(chǎn)結(jié)晶豬胰島素。解放后，國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)廠家主要是上海生化藥廠和徐州生化藥廠。為了使胰島素能就地取材，就地生產(chǎn)，最好不用減壓蒸發(fā)去乙醇。為此，南京和上海分別試用了離子交換法和鋅沉淀法。1978年美國(guó)的2個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作，通過(guò)基因工程使E.coli合成了人胰島素。在實(shí)驗(yàn)室中將人胰島素基因A、B鏈的人工合成基因分別組合到E.coli的不同質(zhì)粒上，然后再移至菌體內(nèi)，著種重組質(zhì)粒在E.coli細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而使帶有A、B鏈基因的工程菌株分別產(chǎn)生人胰島素A、B鏈，然后再用人工的方法，在體外通過(guò)二硫鍵使這2條鏈連接成有活性的人胰島素。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在科學(xué)家己經(jīng)改為用酵母菌、昆蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)胞、或哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等真核細(xì)胞作為表達(dá)載體，而少用大腸桿菌。重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)為利用微生物生產(chǎn)人胰島素鋪平了道路。1979年，美國(guó)Genentech公司的Goedell等報(bào)道了化學(xué)合成的人胰島素基因在大腸桿菌中的表達(dá)。1982年，美國(guó)禮來(lái)公司生產(chǎn)的重組人胰島素Humulin上市。為改進(jìn)重組人胰島素的生產(chǎn)，丹麥的諾和諾德(NovoNordisk)公司用釀酒酵母真核細(xì)胞表達(dá)一種胰島素單鏈前體，在前體中B1至B29通過(guò)甘甘賴(lài)三肽和A1至A21相連接。近年來(lái)，國(guó)產(chǎn)的重組人胰島素相繼問(wèn)世。通化東寶公司于1998年獲準(zhǔn)生產(chǎn)人胰島素注射液，商品名甘舒霖。深圳科興公司的蘇泌嘛和徐州萬(wàn)邦公司的萬(wàn)邦林也于2002年和2003年獲得生產(chǎn)批文。雖然重組人胰島素己在臨床上廣泛應(yīng)用，但是由于胰島素分子容易聚合，在濃度較高的胰島素注射液中主要以二體和六體的形式存在。為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)蛋白質(zhì)工程開(kāi)發(fā)出的單體速效胰島素也應(yīng)運(yùn)而生。首先，美國(guó)的禮來(lái)公司開(kāi)發(fā)了單體胰島素Humalog其中B28位的脯氨酸和B29位的賴(lài)氨酸互換。隨后，丹麥的諾和諾德公司也開(kāi)發(fā)了單體胰島素Novorapid其中B28位的脯氨酸突變成天冬氨酸。1972年，前蘇聯(lián)的生物化學(xué)雜志上報(bào)道了胰島素用胃蛋白酶水解去除B26至B30的肽段后可以得到保留胰島素活性的去五肽胰島素。由于胰島素對(duì)治療糖尿病的重要作用，關(guān)于胰島素的品種、劑型、生產(chǎn)方法等的報(bào)道口新月異、層出不窮。七、胰島素的展望胰島素是由胰產(chǎn)生的一種蛋白。它在人體新陳代謝中起著重要作用，如果體內(nèi)不足就會(huì)引發(fā)糖尿病，因此胰島素是治療糖尿病的特效藥。這種病發(fā)病率很高，困擾著上千萬(wàn)人。過(guò)去從豬、