HIV分子流行病學(xué)及其應(yīng)用-何翔

HIV分子流行病學(xué)及其應(yīng)用廣東省疾病預(yù)防控制中心/廣東省公共衛(wèi)生研究院何翔分子流行病學(xué)2分子流行病學(xué)是一門采用分子生物學(xué)指標(biāo)和技術(shù)手段來進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查研究的科學(xué)，并涉及到多個(gè)新學(xué)科，包括生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和數(shù)學(xué)(計(jì)算科學(xué))就研究對(duì)象而言，傳統(tǒng)意義上的流行病學(xué)主要研究宿主，而分子生物學(xué)方法主要研究病原體分子流行病學(xué)的早期定義中，包括無(wú)機(jī)分子和有機(jī)分子(如糖分子、蛋白質(zhì)、抗體和核酸)，隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)在的分子流行病學(xué)更多的利用蛋白質(zhì)和核酸信息隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展、計(jì)算能力的提高及新出現(xiàn)的病毒，分子流行病學(xué)的應(yīng)用將更加廣泛HIV分子流行病學(xué)常用的方法3分子生物學(xué)技術(shù)與現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)研究方法相結(jié)合基因序列分析異源雙鏈泳動(dòng)分析（HMA)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP)核酸探針雜交/特異性引物檢測(cè)HIV分子流行病學(xué)研究的主要內(nèi)容4HIV的種類及分布HIV的起源和進(jìn)化分子流行病學(xué)調(diào)查：地區(qū)HIV流行毒株的種類及人群/地域分布特征鑒定和研究新重組病毒的發(fā)生和傳播研究影響不同地域流行HIV的流行病學(xué)因素HIV傳播網(wǎng)絡(luò)的追蹤(傳播鏈)進(jìn)化分析的基本概念5HIV-1：人類最大遺傳變異的病原體6迅速?gòu)?fù)制~10.3x109virionsperday高突變率~1substitutionpergenomeperround重組~7-30crossoverspergenomeperround高度相關(guān)但不一致病毒基因組:準(zhǔn)種(quasispecies)EVOLUTION/進(jìn)化靈長(zhǎng)類動(dòng)物的進(jìn)化系統(tǒng)進(jìn)化樹Node節(jié)點(diǎn)包括內(nèi)部節(jié)點(diǎn)和外部節(jié)點(diǎn)，外部節(jié)點(diǎn)又稱為OTU(OperationalTaxonomicUnit)，內(nèi)部節(jié)點(diǎn)又稱為HTU(HypotheticalTaxonomicUnit)Branch分支連接節(jié)點(diǎn)Cluster簇一組屬于同一分支的分類單元如果具有單一起源，即稱為簇Root根指的是進(jìn)化樹上最老的一個(gè)點(diǎn)或相信是距離分析的序列進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)的一組序列(outgrouprooting)Root根Node節(jié)點(diǎn)Branch分支Baldauf.2003.TRENDSinGenetics,19(6):345-351系統(tǒng)進(jìn)化分析的驗(yàn)證－瑞典HIV傳播鏈10*maximumlikelihoodanalysisunderaGTR(general-time-reversible)nucleotidesubstitutionmodelPNASUSA,93:10864,1996HIV的變異及分類11HIV的分類：型、組、亞型和重組亞型12型別

亞型組別亞亞型重組亞型HIV24961…………Gaoetal.,Nature,1999Santiagoetal.,Science,2002Corbet,JVirol,2000Foley&Korber

HIVDatabasex50%35%~15-25%靈長(zhǎng)類慢病毒的遺傳多樣性HIV-1組別14(2009,NatureMedicine)HIV-1亞型,亞亞型,重組體15A1GBDCF1HKJF2A2CRF01_AECRF02_AGCRF03_ABCRF04_cpxCRF05_FDCRF06_cpxCRF09_cpxCRF08_BCCRF07_BCCRF10_CDCRF11_cpxCRF12_BFCRF13_cpxCRF14_BGCRF15_01BCRF16_A2DCRF17_A2D0.1015系統(tǒng)進(jìn)化樹分類的標(biāo)準(zhǔn)：亞型vs重組1616系統(tǒng)進(jìn)化樹分類的標(biāo)準(zhǔn):CRF17ChiangMaiBangkokRayongB_MNB_RL42B_RFD_ELID_NDKF_VI850F_F9363C_BR025C_ETH2220H_VI991H_CF056A_UG037E_TH253BE_OUR1332BE_KWAN207BE_R2399G_G6165G_HH8793J_SE9173_3J_SE9280-9.10BDHACRF01_AECRF15_01BGJCFFourrecombinantstrainsofidenticalstructurerecoveredfromwidelyseparatedlocationsinThailandestablishedCRF15in2003GP41GP1200102030405060708090100‘E’‘E’Bgagpolenv17系統(tǒng)進(jìn)化樹分類的標(biāo)準(zhǔn):URFKenya18ACDADADADADADADACACACAGKER2017KER2021KISII5003KSM4015KSM4017MSA4071KSM4028KNH1097MSA4080KISII5011KNH1043MSA4077CDInEastAfrica,illustratedbythisdatafromKenya,URFformasubstantialproportionofstrainsAURF18HIV亞型及變異19HIV的起源及傳入人群20HIV的起源：SIV的人畜共患感染（跨物種傳播）21非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類之間發(fā)生跨物種傳播的證據(jù)病毒基因結(jié)構(gòu)的相似性

Geneticsimilarityofviralgenomes

進(jìn)化關(guān)系的相近性

Closenessofphylogeneticrelationship

自然宿主的感染率

Infectionratesinnaturalhost

地理分布的一致性

Coincidenceofgeographicaldistribution

感染途徑的可能性

PlausiblepathwaysoftransmissionvpuissharedwithHIV-1andSIVCPZvpxisfoundonlyinHIV-2andSIVSM2122靈長(zhǎng)類慢病毒的進(jìn)化史對(duì)HIV-1而言，至少發(fā)生了4次跨物種傳播，形成了HIV-1的M組、N組、O組和P組；而HIV-2至少發(fā)生了3次跨物種傳播動(dòng)物跨種傳播從猿到人的證據(jù)23HIV-1M和N組起源于喀麥隆黑猩猩24提取RNA:所有免疫印跡測(cè)定陽(yáng)性;31/34env(390bp)和pol(890bp)RT-PCR擴(kuò)增;近期感染Science,313:523,20064/16全長(zhǎng)序列分析喀麥隆東南和中南棲息的黑猩猩分別是HIV-1M組和N組病毒的來源SIVcpz是HIV-1的祖先25Science,313:523,2006HIV-1M和N組起源于喀麥隆黑猩猩HIV-1O組可能起源于喀麥隆大猩猩26

檢測(cè)喀麥隆偏遠(yuǎn)原始森林區(qū)378黑猩猩和213大猩猩糞便標(biāo)本抗體

40/323P.t.troglodytes（+）；0/55P.t.vellerosus（-）；

6/213野生大猩猩（+）?。。IV-1gp41（重組免疫檢測(cè)），

HIV-1gp160/gp120，gp41和Pol（p66，p51）（WB）；

提取糞便RNA：所有抗體陽(yáng)性大猩猩標(biāo)本

RT-PCR：pol（890bp），env（390bp），env/nef（740bp）系統(tǒng)樹分析大猩猩病毒序列與HIV-1O組非常擬合Nature444:164,2006跨物種傳播是如何發(fā)生的？27沿著商業(yè)/伐木道路的獸肉交易獸肉交易的副產(chǎn)品：寵物猴煙熏肉非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的獸肉28HIV-1M組病毒進(jìn)入人類的時(shí)間Science288:1789-96,2000Nature455:661-4,2008提示HIV-1M組病毒的共同祖先株存在于1930sHIV-1:來源于黑猩猩和大猩猩的免疫缺陷病毒29SIVcpzPantroglodytesHIV-1中部非洲人群

黑猩猩至少發(fā)生四次獨(dú)立的傳播事件形成了HIV-1M,N,O，P組.Gorillagorilla

大猩猩HIV-2:來源于烏白眉猴的免疫缺陷病毒(SIVsm)30烏白眉猴關(guān)養(yǎng)的獼猴西部非洲人群艾滋病流行的起源和傳播31HIV亞型的地域分布3232HIV傳播和流行33HIV-1M組病毒是造成全球大流行的主要毒株，至今感染了約6000萬(wàn)人HIV-1O組病毒感染了約10,000人N和P組病毒感染人數(shù)遠(yuǎn)少于M組和O組HIV-2主要分布于西部非洲，全球HIV-1亞型分布34(AIDS2011,25:679-689)我國(guó)HIV亞型分布（1996-2002年）35我國(guó)HIV-1基因型的組成在調(diào)查中檢測(cè)到包括A，B，B’，C，G，01_AE，02_AG，06_cpx，07_BC和08_BC在內(nèi)的10種亞型和流行重組毒株；07_BC、01_AE、08_BC和B’毒株等4種基因型是我國(guó)主要流行的HIV-1毒株，占2006年報(bào)告感染者人數(shù)的92.8%；存在6種gag和env基因片段不一致的毒株，其中部分毒株在不同省份檢測(cè)到，可能已開始流行。36CRF07_BCCRF08_BCCRF01_AEB’我國(guó)不同人群中HIV亞型分布靜脈吸毒和異性傳播為2006年HIV感染者中最主要的傳播途徑，分別占報(bào)告HIV感染者總數(shù)的50.4%和34.7%；其他傳播途徑包括血源相關(guān)傳播（占3.8%，包括既往獻(xiàn)血和輸血）、男男同性戀（占2.1%）、母嬰傳播（占0.9%）、其他（占0.4%）和不詳（占7.8%）。IDU人群中以07、08和01為主，分別占48.5%、23.6%和21.2%；異性傳播中種類最多，包括檢測(cè)到的12種基因型，01、07、08和B’最多，分別占39.8%、21.9%、17.6%和11.6%；男男同性戀中以01_AE（55.8%）為主，超過以前調(diào)查中的歐美B（21.5%）；血源相關(guān)的感染者中以B’為主，占92.5%。37我國(guó)HIV-1基因型的分布38我國(guó)主要HIV基因型的地理分布39小結(jié)我國(guó)存在至少12種HIV-1基因型，其中四種為主要流行毒株病毒多樣性在我國(guó)不同人群和地區(qū)中形成了不同的流行特征不同地區(qū)病毒多樣性的差異導(dǎo)致病毒傳播驅(qū)動(dòng)模式的區(qū)別HIV基因型組成和感染者人群轉(zhuǎn)變說明了我國(guó)HIV傳播模式的變化未來我國(guó)HIV流行將呈現(xiàn)出更加復(fù)雜的狀況與早期結(jié)果比較，本次調(diào)查檢測(cè)到的HIV-1基因型種類、數(shù)量和分布地域均有所增加40我國(guó)主要的HIV基因型是如何起源、傳播和流行的？問題：41B’的起源和傳播42AIDS2012,26:877–884B’毒株的流行云南IDU流行的B’毒株與既往獻(xiàn)血員中流行的B’毒株存在差別，形成2個(gè)不同的進(jìn)化簇；既往獻(xiàn)血員人群中流行的B’毒株來源于云南，而云南B’亞型來源于緬甸；目前在我國(guó)多數(shù)省份獻(xiàn)血員人群中流行的B’毒株已通過異性傳播擴(kuò)散到其他人群；云南地區(qū)B’毒株的流行起始時(shí)間為1985年左右，我國(guó)中部地區(qū)獻(xiàn)血員人群中HIV-1的流行起始時(shí)間為1989年。43AIDS2012,26:877–884B’毒株在中國(guó)的傳播B’TH

1983(1980-1985)B’YN1985(1982-1987)B’CN*1989(1987-1991)尚存的幾個(gè)疑問：B’是如何從泰國(guó)到達(dá)中國(guó)境內(nèi)的？緬甸是否是其傳播的一個(gè)環(huán)節(jié)？B’YN毒株是否僅在云南德宏州出現(xiàn)，未在其他地方流行？即B’YN和B’CN*的邊界問題。云南省內(nèi)B’CN*的起源及其與中部省份B’的相互關(guān)系？各省之間傳播的時(shí)序關(guān)系？各省不同人群間傳播的時(shí)序關(guān)系？性傳播在其中起到什么作用？44CRF01_AE的起源和傳播45GeographicsourceSamplingyearnRiskgroup

HeteroIDUMSMNAChina

102(27)58(21)20(4)186Beijing201013

13

Fujian2005-200722(12)20(11)1(1)

1Guangdong20071045

1Guangxi1997-200725(14)17(10)8(4)

Guizhou2007622

2Hunan20102

2Jiangsu20075(1)41(1)

Jilin201042

2

Liaoning200731

2

Sichuan2006211

Tianjin20071

1

Yunnan2002-2009972

Afghanistan20071(1)

1(1)Central

Africa19903(3)

3(3)Hong

Kong

20041(1)

1(1)Indonesia19931(1)

1(1)Japan19931(1)1(1)

Thailand

1993-200449(49)

49(49)UnitedStates1998-20003(3)

3(3)Vietnam1997-199833(33)17(17)16(16)

Total

194(119)76(39)36(22)1864(58)CRF01_AE的流行我國(guó)至少存在7個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化簇所有的CRF01_AE進(jìn)化簇均于20世紀(jì)90年代中期從東南亞傳入我國(guó)多個(gè)地區(qū)。46不同流行簇的地理分布47簇1、2和3主要在華南和西南省份的異性傳播和靜脈吸毒人群中流行簇4和5主要在北方的主要城市中的男男同性戀人群中流行簇6和7則分別在福建和云南的異性傳播人群中流行CRF01的傳入與出境旅游可能有一定關(guān)聯(lián)48CRF01_AE在中國(guó)的傳播CRF01_AE1985CRF01_AE1995s一些想法：早期樣本較少，造成CRF01_AE各流行簇如何形成的過程不清楚；目前的時(shí)間更多體現(xiàn)了各簇形成的時(shí)間，不排除傳入時(shí)間更早的情況就目前的結(jié)果看，80年代中期即有少量CRF01_AE進(jìn)入我國(guó)，只是到了90年代中期才隨著性傳播的快速流行形成各流行簇？是否可使用更短的序列研究起源？49AfricaCRF07_BC/CRF08_BC在中國(guó)的傳播50

JVirol2008,82:9206-9215CRF07_BC在亞洲的傳播51

JVirol2008,82:9206-9215CRF08_BC在亞洲的傳播52

JVirol2008,82:9206-9215小結(jié)我國(guó)HIV的基因類型和流行模式的多樣性越來越復(fù)雜B’、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC毒株均存在多個(gè)進(jìn)化簇的流行，其原因除了多個(gè)HIV病毒株從境外傳入我國(guó)，例如多個(gè)CRF01_AE毒株幾乎同時(shí)從東南亞傳入我國(guó)，也包括某個(gè)HIV病毒在局部的特定人群中流行與快速傳播，例如CRF08_BC在廣西不同地區(qū)形成進(jìn)化簇，而CRF07_BC和多個(gè)CRF01_AE毒株均在男男同性戀人群中形成單獨(dú)的進(jìn)化簇隨著我國(guó)HIV感染者中通過性傳播比例的持續(xù)增加，可以預(yù)期我國(guó)HIV流行毒株的種類和數(shù)量將進(jìn)一步增加，病毒的流行特征也將更加趨于復(fù)雜。復(fù)雜的HIV流行狀況將對(duì)我國(guó)的檢測(cè)試劑研發(fā)、抗病毒治療和與核酸檢測(cè)相關(guān)的新技術(shù)研究和應(yīng)用都帶來巨大的挑戰(zhàn)。53HIV傳播途徑的追蹤(傳播鏈)54系統(tǒng)進(jìn)化樹分析已被證明是提供HIV-1傳播史(鏈)證據(jù)的最有用的方法（流行病學(xué)目的和法律案件的分析）分子流行病學(xué)在犯罪引起感染分析的中應(yīng)用55

美國(guó)加州拉斐特胃腸道醫(yī)生，將來自于他的HIV感染病人的血液或血液制品注射給他的前女友；分析受害者和病人以及當(dāng)?shù)豀IV-1感染者的HIV-1RT和env序列；結(jié)論：受害者和病人的HIV-1RT和env序列極其相近，二者的HIV-1

RT序列中由AZT引起的耐藥突變序列也非常一致；罪犯被判為二級(jí)謀殺罪。美國(guó)第一次在法院使用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析由犯罪造成的HIV感染案例PNAS2002,99:14292-14297gp120RTMinimumevolutionbootstrap:100Parsimonybootstrap:96%Bayesianposterior:100100%100%病人受害者Lafayette對(duì)照AZTR序列0.00-1.45%0.15-1.52%2.61-6.75%AZTs序列0.44-1.23%1.60-2.61%3.19-6.53%563個(gè)MSMA,B,CHIV-1耐藥株5年內(nèi)傳播鏈RT耐藥突變位點(diǎn)繼續(xù)穩(wěn)定的傳播在1個(gè)MSM中持續(xù)至少4年MSMC血液HIV序列與MSMB精液HIV序列更相似

91年感染，92年AZT治療，95年死亡94年感染，97年與C有性關(guān)系，D4T/3TC，RTV/SQV/d4T治療98年2-9月被B感染確定傳播方向：WashingtonCases57polenv確定傳播方向：TexasCases58polenvCC01:02,03,04,06,07CC01:02,03,04,05,06,07序列信息與時(shí)間的相關(guān)分析59606162利比亞醫(yī)務(wù)人員傳播艾滋病毒事件63簡(jiǎn)單歷史回顧641998年3月：5名保加利亞護(hù)士和1名巴勒斯坦醫(yī)生進(jìn)入醫(yī)院1998年：利比亞第二大城市班加西的法塔赫醫(yī)院爆發(fā)426名兒童因輸血感染艾滋病，死亡50多人1999年：5名保加利亞護(hù)士和1名巴勒斯坦醫(yī)生被指控涉嫌用利比亞兒童做實(shí)驗(yàn)品，導(dǎo)致這些兒童全部感染艾滋病病毒2004年5月：當(dāng)?shù)胤ㄔ号刑幧姘傅?名醫(yī)護(hù)人員死刑2006年：迫于西方壓力，利比亞最高法院宣布重審2006年12月6日：Nature在線快速通道發(fā)表科學(xué)文章證明其無(wú)辜2006年12月19日：利比亞最高法院維持原判2007年7月17日：利比亞最高司法委員會(huì)將死刑改判為終身監(jiān)禁一周后，6名醫(yī)護(hù)人員被引渡回國(guó)后獲得赦免64流行病學(xué)證據(jù)65在2003年4月，在法庭的要求下，由2名國(guó)際HIV/AIDS科學(xué)家，LucMontagnier和VittorioColizzi組成班加西事件研究組對(duì)在班加西市HIV-1爆發(fā)事件進(jìn)行了科學(xué)調(diào)查。在提交的報(bào)告中他們提供了大量流行病學(xué)證據(jù)：在1997年以前該醫(yī)院即收治過HIV感染兒童；在1999年6名外國(guó)醫(yī)務(wù)人員離開后，該醫(yī)院繼續(xù)有3名兒童被感染；大量被感染兒童收治時(shí)間在1998年以前，且部分兒童到醫(yī)院后的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)時(shí)間少于1個(gè)月，說明感染時(shí)間可能在1997年甚至于更早。而分子流行病學(xué)的證據(jù)也表明，在該醫(yī)院引起爆發(fā)的HIV病毒與1997年或1999年在該院傳播的病毒極為相似，具有共同的起源；與非洲部分地區(qū)流行的HIV病毒株也很相似，推測(cè)該院爆發(fā)的HIV病毒來自于非洲亞撒哈拉地區(qū)。該報(bào)告結(jié)論：在該醫(yī)院中存在乙肝和丙肝病毒很高的感染率，HIV病毒爆發(fā)更象是醫(yī)院不規(guī)范的醫(yī)療活動(dòng)造成，在6名國(guó)外醫(yī)務(wù)人員到達(dá)以前，HIV-1和HCV已在該醫(yī)院流行。流行病學(xué)證據(jù)66HIV-1和HCV在1998年3月外國(guó)醫(yī)生來到之前在這家醫(yī)院及其市郊已經(jīng)流行44個(gè)HIV-1gag

基因序列和61個(gè)HCVE1/E2基因序列，進(jìn)行進(jìn)化分析確定爆發(fā)傳播史的真實(shí)時(shí)刻表使用所有與該醫(yī)院傳播毒株極其相似的參考序列和使用貝葉斯方法和最大似然性方法估計(jì)和評(píng)價(jià)種系發(fā)生醫(yī)院傳播株序列在CRF02_AG簇中形成了一個(gè)非常完整的單元簇，表示醫(yī)院爆發(fā)病毒來自于一個(gè)CRF02_AG種系該簇序列與3個(gè)西非參考序列接近，可以認(rèn)為醫(yī)院傳播株是從西非傳入利比亞系統(tǒng)樹分枝至醫(yī)院傳播株的長(zhǎng)度非常典型，因此醫(yī)院傳播株不是異常的分歧進(jìn)化病毒HIV-1自然傳人利比亞，與流動(dòng)人口有關(guān)Nature2006，444：65866分子流行病學(xué)證據(jù)證明六名醫(yī)務(wù)工作者無(wú)辜67三個(gè)進(jìn)化簇：11個(gè)HCV4a亞型（埃及流行株）；22個(gè)HCV4型（喀麥隆流行株）；24個(gè)HCV1a亞型全球流行株）67分子流行病學(xué)證據(jù)證明六名醫(yī)務(wù)工作者無(wú)辜68該醫(yī)院感染者中獲得的4個(gè)不同病毒（包括1株HIV和3株HCV）流行史分析結(jié)果表明，這4株病毒傳入該院的時(shí)間均在1998年3月以前，其傳入該院時(shí)間在1998年3月1日以后的概率幾乎為0。

HCV簇比HIV-1簇起始早，支持該醫(yī)院存在醫(yī)源性傳播的結(jié)論并表明該醫(yī)院存在長(zhǎng)期的傳染病控制問題在爆發(fā)中流行的HIV和HCV毒株在1998年3月以前已經(jīng)擴(kuò)散并流行，這表明在傳染鏈中的多個(gè)病毒傳播在外國(guó)醫(yī)務(wù)人員到達(dá)以前就已出現(xiàn)68--傳播途徑--地理信息--人口遷移--不同分區(qū)--道路、距離等序列信息與其他信息的相關(guān)性分析70GeneFlowofAvianInfluenzaVirus(AIV)RealphylogenyofAIVinNorthAmerica(PB2)TheoreticalphylogenyassumingalmostnogeneflowPacificflywayCentralflywayMississippiflywayAtlanticflywayAIVgeneflowLametal.Ecol.Lett.(2012)GeneFlowofAvianInfluenzaVirus(AIV)Virusmovementinsidethebody/orgranofapatientSalemi,etal.J.Virol.(2005)FrontallobeTemporallobeSpinalcordOccipital

lobeMeningesIliaclymphnodeSeminalvesiclesBrainLymphoidMaximumlikelihoodtreeofHIV-1envsequencesisolatedfromdifferentbrainandlymphoidtissuesatdifferenttimepointsVirusmovementinsidethebody/orgranofapatient追蹤HIV-1B亞型病毒株在歐洲的流行：使用系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生地理學(xué)方法研究對(duì)象：16個(gè)歐洲國(guó)家和以色列研究方法：用系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生地理學(xué)方法，推斷HIV-1B亞型在個(gè)國(guó)家的遷移史研究結(jié)果：歐洲大多數(shù)國(guó)家，HIV-1B亞型病毒是多途