基因克隆載體

第三章基因克隆載體

(質粒載體)載體(P39)概念：攜帶外源DNA進入宿主細胞，并為其提供復制和功能基因表達調控系統(tǒng)的工具。功能1.運送外源基因高效轉入受體細胞

2.為外源基因提供復制能力或整合能力

3.為外源基因的擴增或表達提供條件載體在基因工程中的必要性目的外源DNA很難進入受體細胞目的外源DNA一般不帶復制子系統(tǒng)目的外源DNA一般不具備表達的調控系統(tǒng)載體應具備的條件（P38）

1.具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）2.具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3.具有多種單一的酶切位點（多克隆位點）

4.具有合適的選擇性標記

自我復制表達，外源基因的插入不影響其功能的發(fā)揮，易于從宿主細胞分離出來5.分子量盡可能小，以提高其載裝能力

目的基因能否有效導入受體，并在其中高效表達，很大程度上取決于所用的載體。質粒的基本生物學特征生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子常見于原核細菌和真菌中絕大多數的是DNA型（除了酵母的殺傷質粒（killerplasmid）是一種RNA質粒外）絕大多數具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA分子量范圍：1－300kb，多數在10kb某些藍藻、真菌和綠藻中也有發(fā)現質粒的存在形式：開環(huán)DNA分子(oc-DNA)線性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA)同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。共價閉合環(huán)狀DNA分子(ccc-DNA)質粒DNA的復制質?？截悢导匆粋€細胞內質粒的數量與染色體數量之比。每種質粒在相應的宿主細胞內保持相對穩(wěn)定的拷貝數。根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質粒可分為兩大復制類型：嚴謹型質粒：分子量大，低拷貝數，1－3拷貝松弛型質粒：分子量小，高拷貝數，10－60拷貝P38質粒的不相容性（P39）在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能在同一宿主細胞內穩(wěn)定的共存。不相容性質粒：不能共存于同一細胞內不同質粒相容性質粒：共存于同一細胞內不同質粒質粒的不相容性：分子機制兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時各受自己的拷貝數控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數恒定，因此在經過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內。任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性，不相容性的質粒組成不相容性群。兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數不同，其中拷貝數多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。一、質粒載體質?？寺≥d體是以質粒DNA分子為基礎構建而成的克隆載體。天然質粒的缺陷天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。（1）分子量大，拷貝數低第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子長9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。（2）篩選標志不理想ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。colicinE1能殺死不含ColE1質粒的菌，形成“噬菌斑”。

唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內部。因此可通過插入失活篩選。但細菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細胞…….3.2構建質?？寺≥d體的基本策略能在受體中進行有效的復制（有復制起始位點）。含多克隆位點含有供選擇克隆子的標記基因，如：常用的標記基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等DNA分子盡可能小和較高的拷貝數。根據特殊需要，組裝各種“元件”，構建不同用途的質粒克隆載體。理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。3.3質?？寺≥d體的構建(P39)選擇合適的出發(fā)質粒正確獲得構建質粒克隆載體的元件組裝合適的選擇標記基因選用合適的啟動子構建過程力求簡單出發(fā)質粒含有質?？寺≥d體必備的元件：復制起始位點選擇標記基因克隆位點啟動子和終止子出發(fā)質粒（親本質粒）親本質粒必須含有質?？寺≥d體必備的元件：復制起始位點選擇標記基因克隆位點啟動子和終止子組裝合適的選擇標記基因絕大多數質粒載體都是用抗菌素抗性標記不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。當帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能生長。

氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）合適的啟動子真核生物基因在原核生物中表達，改用原核生物或病毒（噬菌體）基因的啟動子。原核生物基因在真核生物中表達，仍用原核生物基因的啟動子。選用外界條件誘導的啟動子。(1)質?？寺≥d體pBR322pBR322是經人工改造的一種較為理想的大腸桿菌質粒載體，應用廣泛?，F在已經被許多更優(yōu)良的新型克隆載體所替代。(P40)pBR322質粒是按照標準的質粒載體命名法則命名的?！皃”表示它是一種質粒；“BR”則是分別取自該質粒的兩位主要構建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的頭一個字母，“322'’系指實驗室編號，以與其他質粒載體如pBR325，pBR327，pBR328等相區(qū)別。pBR322的結構pBR322的構建過程復制起始位點：源于ColE1衍生質粒pMB1。Apr基因：源于pSF124質粒轉座子Tn3。Tcr：源于pSC101質粒。pBR322的優(yōu)點具有較小的分子量，4363bp，可以克隆10kb以下的外源DNA。含有松弛型質粒ColE1的復制起始位點，可在E.coliHB101和E.coliC600等受體細胞進行高拷貝復制。具有兩種選擇標記基因Ampr和Tetr。插入失活其中有7種限制酶：EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII和NruI，它們的識別位點是位于四環(huán)素抗性基因內部，另外有2種限制酶：ClaI和HindIII的識別位點是存在于這個基因的啟動區(qū)內，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導致tetr基因的失活；還有3種限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨芐青霉素抗性基因（ampr）內具有單一的識別位點，在這個位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。這種因DNA插入而導致基因失活的現象，稱之為插入失活效應。當外源DNA片斷插入Tcr基因后，導致Tcr基因失活，變成只對Ap有抗性，即通過對抗生素的雙抗或單抗來篩選是否有外源片斷插入。篩選標記－插入失活（2）質?？寺≥d體pUC18/19UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎上改造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

(P41)pUC18/19與pBR322的主要差別是用乳糖操縱子的一個DNA片斷（466bp）替換了pBR322選擇標記Tcr基因。此DNA片斷含有乳糖操縱子的啟動子、調節(jié)因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。pUC18/19的結構復制起點：來自pBR322質粒。Ampr基因：來自pBR322質粒lacZ的啟動子：來自大腸桿菌lacZ’基因：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ

的氨基端片斷多克隆位點：10個連續(xù)的單酶切位點，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19的結構pUC18/19質粒載體的優(yōu)點①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便：Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利：具有多克隆位點（MCS），使有兩個不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④測序方便：pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉移到M13載體上測序。選擇原理Ampicillin抗性和lacZ的肽互補（藍白斑）相結合。

藍白斑篩選Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）是-半乳糖苷酶的作用底物-半乳糖苷酶作用于Xgal顯色反應-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質5-溴-4-氯靛藍誘導物：IPTGIPTG是乳糖的類似物。能誘導lac操縱子的啟動轉錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’肽都表達。從而互補。但載體MCS上插入外源DNA后，不能產生肽！lacZ的肽互補-肽（lacZ’基因編碼）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能。pUC質粒載體上的lacZ’編碼的肽與這個缺失突變的-半乳糖苷酶“互補”，使它能形成4聚體，又能分解Xgal，產生藍色物質。-互補pUC質粒結構中的lacZ’基因所編碼的-肽鏈（編碼β-半乳糖酶基因的氨基末端）可參與-互補作用。這種載體適合于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。雖然質粒和宿主編碼的片段各自均無活性，但它們共處一個細胞中時可融為一體，形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變株與帶有完整近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的不同突變株之間實現互補，這種互補現象叫做-互補。質?？寺≥d體引入與lacZ’互補的E.coli，在含IPTG和X－gal的誘導培養(yǎng)基中，菌落呈藍色。如果在MCS區(qū)插入一個外源片斷，就會使lacZ’基因失活，引入lacZ’互補的E.coli，肽不能生成，就無所謂互補，在含IPTG和X－gal的誘導培養(yǎng)基中X－gal不會被降解，菌落呈白色。IPTG誘導的結果：藍白斑篩選MCS無插入時，互補，藍菌斑。MCS有插入時，不互補，白菌斑（教材P94）通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。IPTG誘導的結果：1、具有更小的分子量和更高的拷貝數。2、適用于組織化學方法檢測重組體。

質?？寺≥d體引入lacZ’互補的E.coli，在含IPTG和X－gal的誘導培養(yǎng)基中，菌落呈藍色。如果在MCS區(qū)插入一個外源片斷，就會使lacZ’基因失活，引入

lacZ’互補的E.coli，在含IPTG和X－gal的誘導培養(yǎng)基中，菌落呈白色。（3）農桿菌Ti質粒表達載體的構建(P53)Ti（tumor-inducingplasmid）質粒：根癌農桿菌含有一種內源質粒，當農桿菌同植物接觸時，Ti質粒中有一段DNA，稱為T-DNA（transfer-DNA），能轉移并整合到植物基因組中，并導致冠癭瘤的形成。大小因種類而異，在200－250kb之間。章魚堿型農桿堿型農桿菌素型琥珀堿型Ti質粒分為4個功能區(qū)：

T－DNA區(qū)：是根癌農桿菌侵染植物細胞時從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，含有編碼植物激素和冠癭堿的基因

Vir區(qū)：Vir

區(qū)上的基因能激活T-DNA轉移，使根癌農桿菌表現出毒性

Con區(qū)：該區(qū)段上存在與細菌間接合轉移的有關基因，調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移

Ori區(qū)：Ori區(qū)上的基因調控Ti質粒的自我復制。T－DNA區(qū)Ti質粒進入植物細胞的只是一小部分，約25kb。能轉移到植物細胞內的DNA片斷稱為T－DNA（transfer-DNA）T－DNA左右兩端邊界各有一個25bp長的正向重復序列(左邊界，右邊界)，在不同Ti質粒中高度保守。

邊界序列對T－DNA轉移和整合不可缺少；已證實只要保留兩端邊界序列，雖然中間序列不同程度被外源片斷所替換，仍可轉移整合到植物基因組中－Ti質粒遺傳轉化的理論依據。

T－DNA進入植物細胞后，能以單拷貝或多拷貝形式隨機整合到染色體DNA上。且T－DNA上的基因能被植物轉錄系統(tǒng)識別，進行轉錄。在T－DNA已鑒定出多種基因章魚堿合成基因（ocs）或胭脂堿合成基因（nos）或其他胭脂堿合成基因。細胞分裂素合成基因位點Shi和控制植物生長素合成的基因位點Roi。在兩種基因表達產物的共同作用下，破壞植物內源激素的平衡，干擾植物細胞的正常分裂，引發(fā)植物產生腫瘤。Vir區(qū)Ti質粒T－DNA上游的一組基因，表達產物可激活T－DNA向植物細胞轉移，引發(fā)腫瘤，顯示致病性。Con區(qū)含有與農桿菌之間接合轉移有關的基因，受宿主合成的冠癭堿激活，使Ti質粒在細菌間轉移。Ori區(qū)調控Ti質粒的自我復制乙酰丁香酮/羥基乙酰丁香酮植物根部損傷部位會分泌出酚類物質乙酰丁香酮/羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質能誘導Ti質粒上的vir基因以及根癌農桿菌染色體上的一個操縱子表達。vir基因產物將Ti質粒上的T-DNA單鏈切下，而根癌農桿菌染色體上的操縱子表達產物則與單鏈T-DNA結合形成復合物，轉化植物根部細胞。Ti質粒介導轉化的過程①根癌農桿菌對植物細胞的識別和附著②根癌農桿菌對植物信號物質的感受③根癌農桿菌Ti質粒上的vir基因以及染色體上操縱子的活化④vir區(qū)基因被激活，virD基因編碼的核酸內切酶分別將T-DNA的RB序列和LB序列切出單鏈切口，釋放出T-DNA的單鏈線性拷貝，T-DNA復合體的產生⑤T-DNA復合體在RB序列的引導下定向地穿過農桿菌的細胞膜、細胞壁、進入植物細胞壁并整合到植物的染色體基因組中Ti質粒介導轉化植物細胞示意圖天然的基因工程研究發(fā)現只有邊界序列對DNA的轉移是必需的，而邊界序列之間的T-DNA并不參與轉化過程，因而可以用外源基因將其替換。天然的基因工程1、Ti質粒是一種天然的質粒表達載體，外源基因組裝在T－DNA上，有可能引入植物細胞。2、轉基因的細胞只能分裂，而不能分化成植株，不能達到選育轉基因植物的目的。3、通過改造T－DNA，構建了一系列Ti質粒表達載體。Ti質粒本身存在的缺陷轉化細胞在生長過程中會產生植物激素，從而破壞受體激素的平衡，阻礙轉化細胞的再生，因此需將參與合成植物生長素和細胞分裂素的基因剔除冠癭堿合成基因對轉基因植物意義不大，因此也可刪除Ti質粒分子量過大（200～800kb），小一些利于操作，因此可除去不必要的大片段DNA需加入大腸桿菌復制起始位點，以利于在大腸桿菌中的操作和保存pCAMBIA1300圖譜潮霉素抗性基因左邊界右邊界復制起點卡那霉素抗性基因(4)穿梭質粒載體人工構建的、具有兩種不同復制起點和選擇標記、可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體。

常用的穿梭質粒載體大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體大