雙向電泳技術(shù)在作物雄性不育研究中的運用,農(nóng)藝學論文

雙向電泳技術(shù)在作物雄性不育研究中的運用,農(nóng)藝學論文近年來，隨著蛋白質(zhì)組概念的提出[1]，蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)越來越遭到大家的關(guān)注，該技術(shù)尤其是在作物雄性不育研究方面應用較多。蛋白質(zhì)組學的關(guān)鍵技術(shù)是雙向凝膠電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)，該技術(shù)通過雙向電泳對蛋白質(zhì)進行分離，實現(xiàn)對蛋白的定量研究，后期與質(zhì)譜鑒定相結(jié)合，實現(xiàn)蛋白的定性分析，最后還可利用數(shù)據(jù)庫對蛋白進行詳細的鑒定，確定蛋白的種類、功能等[2-3]。因而，結(jié)合雙向電泳技術(shù)，從蛋白質(zhì)組水平研究作物雄性不育機理，尋找與育性相關(guān)的蛋白質(zhì)，進而找到相應的不育基因，對研究作物雄性不育具有重要的理論和實踐意義。1蛋白質(zhì)組學研究方式方法蛋白質(zhì)組學研究的常規(guī)方式方法是提取全蛋白，經(jīng)雙向電泳分離構(gòu)成一個蛋白質(zhì)組的二維圖譜，通過計算機圖像分析得到各蛋白質(zhì)的等電點、分子量、表示出量等，再用質(zhì)譜分析進行蛋白質(zhì)鑒定，建立正常生理條件下蛋白質(zhì)圖譜和數(shù)據(jù)庫。在這里基礎(chǔ)上，能夠比擬分析不同條件下的蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化，如蛋白質(zhì)表示出量的變化、翻譯后的加工修飾、蛋白質(zhì)在亞細胞水平上定位的改變等，進而發(fā)現(xiàn)和鑒定出特定功能的蛋白質(zhì)及其基因[2，3]。蛋白質(zhì)組研究分析通常有3個步驟，第一步，運用雙向電泳技術(shù)分離樣品中的蛋白質(zhì)；第二步，應用質(zhì)譜技術(shù)或N端測序技術(shù)鑒定雙向電泳分離的蛋白質(zhì)；第三步，應用生物信息學技術(shù)儲存、處理比擬獲得的數(shù)據(jù)。1.1蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)1956年，Smithiea和Poulik發(fā)明了雙向電泳，1975年，OFarrell對其做了改良，并建立起了雙向凝膠電泳技術(shù)體系[4]，1975年Gasparic等合成了固相pH介質(zhì)[5]，通過近40年的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)已逐步成熟完善，但其基本原理并未改變，即根據(jù)蛋白質(zhì)等電點和分子量的差異，進行雙向電泳，第一向是等電聚焦〔isoelectricfocusing,IEF〕,第二向是聚丙烯酰胺凝膠電泳〔SDS〕,這樣各個蛋白質(zhì)根據(jù)等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上，從左到右是等電點的增加，從上到下是分子量的增加。雙向電泳一次能夠分辨出1000～2000個蛋白質(zhì)，有些甚至能夠分辨出5000～10000個斑點[6-9]，而且同時獲得該蛋白質(zhì)的等電點和分子量。固向化pH梯度〔ImmobilizedpHgradient,IPG〕的發(fā)明和完善，使雙向凝膠電泳的重復性和上樣量得到了改善，而與雙向凝膠電泳相結(jié)合的新型凝膠染色技術(shù)，如熒光染色的開發(fā)，使其分辨率大大增加。1.2質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學研究中最重要的技術(shù)突破之一，其原理是將樣品分子離子化，根據(jù)離子間質(zhì)荷比〔m/z〕的差異來分離并確定質(zhì)量。質(zhì)譜測定中首先將通過2-DE分離到的蛋白質(zhì)用特定的蛋白質(zhì)酶消化成肽段，然后用質(zhì)譜儀進行分析[2,3]?；|(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜技術(shù)〔Matrix-assistedLaserDes-orptionIonization,MALDI〕和電噴霧質(zhì)譜技術(shù)〔Elec-trosprayIonization,ESI〕的發(fā)明，使得傳統(tǒng)的主要介于小分子物質(zhì)的有機質(zhì)譜技術(shù)獲得了突破性進展。這兩項技術(shù)具有高靈敏度高通量和高質(zhì)量的檢測范圍等特點，使得在pmol〔10-12〕甚至fmol〔10-15〕的水平上準確地分析分子量高達幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能[2]。1.3生物信息學數(shù)據(jù)庫由于Interent、大型服務器和廣泛的計算機的介入，蛋白質(zhì)組的研究效率和精到準確度大大提高[2]。對蛋白質(zhì)進行雙向凝膠-質(zhì)譜分析后，如需最終確定蛋白的種類，則需要查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[3]，當前已有MELANIE、PDGVEST等軟件，可自動迅速地完成2-DE凝膠圖像，進行圖形處理，斑點檢查與量化、背景過濾、2-DE的匹配與比擬，以及統(tǒng)計分析工作。這些1預測潛在的翻譯后調(diào)節(jié)方式和三維構(gòu)造[2,7,9]。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平和能力的標志。到當前為止，與蛋白質(zhì)有關(guān)的數(shù)據(jù)庫占生物學數(shù)據(jù)庫總數(shù)的半數(shù)以上，由此可見，生物信息學與蛋白質(zhì)組研究關(guān)系密切。2雙向電泳技術(shù)在作物雄性不育研究中的應用當前，雙向電泳技術(shù)已廣泛應用到作物雄性不育研究中，并找到了一些與育性相關(guān)的蛋白。水稻、小麥、大豆等作物的不育相關(guān)蛋白研究表示清楚，不育系與保持系的葉片之間的蛋白質(zhì)幾乎沒有差異,種子間僅有少量差異，而花藥之間有比擬大的差異,講明不育基因表示出具有時空性和器官特異性。即與育性有關(guān)的蛋白不在營養(yǎng)器官中表示出，而主要在花藥中表示出[10]。2.1雙向電泳技術(shù)在水稻雄性不育研究中的應用曹以誠等對光敏核不育水稻花藥蛋白雙向電泳表示清楚，處于14h長日照下的光敏核不育農(nóng)墾58S二核花粉期蛋白比處于9h短日照育性正常二核花粉期蛋白缺少一組蛋白，這組蛋白很可能與育性表示出有關(guān)[11]。王臺等對光周期敏感核不育水稻葉綠體的特異性蛋白研究發(fā)現(xiàn)，無論內(nèi)外環(huán)境怎樣，農(nóng)墾58S的葉綠體內(nèi)均有45kDa和61kDa的特異性蛋白質(zhì)，而農(nóng)墾58沒有，以為這兩種特異蛋白可能和育性轉(zhuǎn)換有關(guān)[12]。謝錦云等對溫敏核不育水稻的不育和可育花藥樣品進行雙向電泳分離、質(zhì)量指紋圖譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索，在不育到可育圖譜上，明顯上調(diào)的蛋白質(zhì)包括幾丁質(zhì)酶、酸性磷酸酶、谷蛋白前體等，明顯下調(diào)的蛋白有谷氨酸氨甲酞轉(zhuǎn)移酶等[13]。文李等對紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育水稻的不育系〔YTA〕和保持系〔YTT3〕單核花粉總蛋白質(zhì)進行分離，得到85個差異表示出蛋白質(zhì)，初步鑒定出9個蛋白質(zhì)點，這些蛋白的缺失或表示出量降低可能導致能量供給缺乏、淀粉合成受阻，因此花粉不能正常發(fā)育[14－15]。2.2雙向電泳技術(shù)在小麥雄性不育研究中的應用門淑珍等取小麥京411不育株〔Ms2〕和可育株處于減數(shù)分裂期的花藥進行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)不育花藥比可育花藥缺少相對分子量分別為15.8,17,17.8,38,81.3kD的幾個多肽，不育系花藥比可育花藥多一個相對分子量為16.2kD的酸性蛋白,其等電點約174.1kD〕的多肽上，可育花藥的蛋白斑點濃于不育花，講明可育花藥中這幾種蛋白的含量高于不育花藥[16]。范寶莉等在小麥T型細胞質(zhì)雄性不育系與保持系蛋白質(zhì)雙向電泳比擬研究中發(fā)如今花粉敗育的關(guān)鍵時期一二核小孢子期，小麥細胞質(zhì)雄性不育系有53kD/pI5.550kD/pI5.7,48kD/pI5.6和20kD/pI7.5共4種蛋白組分存在，而保持系中沒有[17]。劉衛(wèi)等對遺傳型不育系ms〔S〕-西農(nóng)1376、對應的保持系〔A〕-西農(nóng)1376和生理型〔化學殺雄劑SQ-1誘導〕雄性不育系ms〔A〕-西農(nóng)1376為材料,利用IEF/SDS凝膠電泳技術(shù),對發(fā)育到單核后期的花藥全蛋白特異性進行了比擬分析,得到320～350個清楚明晰的蛋白點，以為遺傳型和SQ-1誘導的生理型不育系蛋白質(zhì)圖譜與正常保持系在蛋白質(zhì)〔多肽〕表示出量上存在一定的差異,同時發(fā)現(xiàn)有幾種蛋白質(zhì)的表示出有明顯的特異性,兩個不育材料2D膠上共有幾個明顯的特異蛋白點,而在保持系中未發(fā)現(xiàn);兩個不育材料又分別具有自個的特異蛋白表示出,不育機理不同;不育系中某些蛋白的表示出遭到了抑制,并開啟了與花藥敗育有關(guān)的特定蛋白的表示出[18]。2.3雙向電泳技術(shù)在大豆雄性不育研究中的應用曾維英利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對大顯質(zhì)核互作雄性不育系NJCMS2A及其同型保持系NJCMS2B花藥進行蛋白質(zhì)組比擬分析,在二胞花粉期花藥2-DE圖譜上分別檢測到約217、214個蛋白點，兩系間有25個差異表示出蛋白點，華而不實13個在NJCMS2A中表示出，而在NJCMS2B中缺失，10個在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中表示出，2個在NJCMS2A中表示出量明顯下調(diào)。在NJCMS2A與NJCMS2B的單核小孢子期花藥2-DE圖譜上分別檢測到約193、192個蛋白點，兩系間有16個差異表達蛋白點，其中9個在NJCMS2A中表達而在NJCMS2B中缺失，7個在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中表示出[19,20]。3存在問題蛋白質(zhì)樣品制備的優(yōu)劣將直接影響2-DE結(jié)果，是試驗成敗的關(guān)鍵步驟之一。由于植物細胞含有很厚的細胞壁和多種次生代謝物質(zhì)，因而，蛋白的提取相比照較復雜。當前常用的蛋白質(zhì)提取和沉淀方式方法主要有尿素/硫脈法、TCA/丙酮、醋酸銨沉淀法、酚提取等方式方法，華而不實TCA-丙酮沉淀蛋白是利用雙向電泳技術(shù)分離植物蛋白質(zhì)最常用的方式方法。它的優(yōu)點在于在沉淀蛋白的同時，抑制了蛋白酶的活性，并去除一些干擾物質(zhì)。但2-DE還是有很多缺乏之處，它不易檢測出低拷貝的蛋白、極酸或極堿的蛋白質(zhì)、分子量極大或極小的蛋白質(zhì)以及難溶的蛋白質(zhì)，有時一個蛋白點含有不止一種蛋白，重復性仍然不理想等，需要進一步的改良。4瞻望蛋白質(zhì)組研究不僅能夠作為現(xiàn)有基因組功能研究的鑒定和補充，也為不育基因的研究開拓了新的道路。植物雄性不育的蛋白質(zhì)組學研究成果講明了雄性不育的育性轉(zhuǎn)換與某些特異蛋白相關(guān)，包括蛋白質(zhì)的表示出上調(diào)、下降、缺失或者一些蛋白的新增，也獲得了一些與雄性不育育性轉(zhuǎn)換相關(guān)的蛋白，并運用質(zhì)譜分析初步確定了蛋白，但對這些蛋白在作物雄性不育的育性轉(zhuǎn)換經(jīng)過中的作用機理還不清楚，因而，需要與轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果相結(jié)合，把蛋白質(zhì)與基因聯(lián)絡起來，能更好地揭示植物雄性不育的分子機理。以下為參考文獻[1]HerbertBR,MolloyMP,GooleyAA,etal.Improvedproteinsolubilityintwo-dimensionalelectrop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