探討高海拔地區(qū)應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒的最佳條件,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文

探討高海拔地區(qū)應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒的最佳條件,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文內(nèi)容摘要：目的討論在高海拔地區(qū)應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒的最佳條件。方式方法應(yīng)用RelaxGeneBloodDNASystem血液基因組DNA提取系統(tǒng),對109份血樣(每份血樣分為2組,實驗組和對照組)提取DNA,實驗組采用優(yōu)化條件提取DNA、對照組采用試劑盒講明書方式方法提取DNA。結(jié)果實驗組109份樣品中有13份DNA濃度在20-50ng/L之間,35份在51-80ng/L之間,61份樣品80ng/DNA濃度比例高于對照組(P0.05)。實驗組109份樣品中DNA純度OD260/OD280比值在1.7-1.9之內(nèi)的有105份,比值小于1.7的有3份,比值1.9的有1份,DNA純度比例高于對照組(P0.05)。結(jié)論在高海拔地區(qū)采用試劑盒提取血液基因組DNA,需要優(yōu)化提取條件,所得到的DNA濃度和純度均能知足下游實驗要求,且重復(fù)性好。本文關(guān)鍵詞語：高海拔;DNA提取;優(yōu)化;ThebloodgenomicDNAextractionkitwasoptimizedintheplateauregionFANDong-yanDUBao-zhongWANGPingTibetUniversityMedicalCollegeTheFirstHospitalofJilinUniversityAbstract：ObjectiveToexploretheoptimalconditionsforextractingtheDNAfrombloodgenomicDNAintheplateauarea.MethodsRelaxGeneBloodDNASystem,109plasmasamples(eachBloodsamplewasdividedinto2groups,experimentalgroupandcontrolgroup)toextractDNA,DNAextractedwiththeuseofoptimalconditionsandcontrolskitmanualmethodtoextractDNA.Results13ofthe109samplesoftheexperimentalgroupwerebetween20and50ng/L,35werebetween51-80ng/L,and61sampleswere80ng/L.TheconcentrationofDNAwashigherthanthecontrolgroup(P0.05).TheratiooftheDNApurityOD260/OD280intheexperimentalgroup109sampleswas105inthesample,andtheratiowaslessthan1.7.Theratiowaslessthan1.7,andtheratiowasgreaterthanthatofthecontrolgroup(P0.05).ConclusionUsesreagentboxextractionbloodgenometeamDNAinthehighelevationarea,needstooptimizetheextractioncondition,obtainstheDNAdensityandthepuritycansatisfythedownstreamexperimenttorequest,alsotheduplicationisgood.Keyword：plateauenvironment;DNAextraction;optimization;全血基因組DNA是科學(xué)研究、臨床疾病分析及親子鑒定等很多研究領(lǐng)域不可缺少的原材料。當(dāng)前,提取DNA的各類方式方法較多,除各實驗室有本身獨特的方式方法外,應(yīng)用最為廣泛的還屬商品化的血液基因組提取試劑盒,不僅使用方便成本低廉且液體量較少相對污染較低。西藏自治區(qū)地處我們國家西南邊疆,平均海拔在3000米以上,由于地勢高而構(gòu)成了特有的高原低壓低氧、嚴(yán)寒枯燥的環(huán)境。在高原環(huán)境中提取血液基因組可采用商品化的血液基因組提取試劑盒,但是假如根據(jù)試劑盒中講明書方式方法進接提取血液基因組其產(chǎn)量和純度很難知足后續(xù)研究的需要。本課題組經(jīng)太多次嘗試研究,探索出了一套血液基因組試劑盒提取DNA的優(yōu)化方式方法,該方式方法在高原環(huán)境下提取的DNA能夠獲得滿意的產(chǎn)量和純度。1材料與方式方法1.1實驗材料2021年5月西藏阜康醫(yī)院體檢的健康體檢者的血液樣品109份作為基因組DNA提取的材料。1.2主要試劑與儀器RelaxGeneBloodDNASystem血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)[天根生化科技(北京)有限公司],其產(chǎn)品組成:細(xì)胞裂解液CL2250ml,緩沖液FG120ml,洗脫緩沖液TB60ml,蛋白酶K1ml。其余試劑為分析純,水為雙蒸滅菌水。高速臺式離心機(Sigma);超微量紫外可見分光光度計(Thermo)。1.3實驗分組將109份血液樣品的每一份分為2組:實驗組(109份)和對照組(109份)。1.4實驗方式方法1.4.1對照組按300l抗凝血750l裂解液提取DNA,詳細(xì)的操作方式方法對照組采用RelaxGeneBloodDNASystem血液基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒講明書提取方式方法。實驗組按300l抗凝血900l裂解液提取DNA,采用RelaxGeneBloodDNASystem血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)試劑盒,對實驗條件和方式方法進行優(yōu)化和改進,其方式方法是:1)將抗凝血樣(2ml血液/管)從-80℃冰箱中,室溫融化,利用移液器在樣品管中把血樣充分混勻,取300l血樣置于尖底離心管中并向管中參加750l細(xì)胞裂解液CL,顛倒混勻10次。重復(fù)2次。2)離心12000rpm1min、棄上清,將離心管倒置于干凈吸水濾紙上5min,此時確保管底沉淀在管中。3)按100∶1配制FG與蛋白酶K混合液,現(xiàn)用現(xiàn)配。將混合液根據(jù)200l/管的量參加到已棄上清并倒置5min的EP管內(nèi),立即渦旋混勻至無團塊。4)65℃水浴過夜(20h),最初的2h內(nèi)每10-15min顛倒混勻2-3次,并用手指彈勻,水浴后可見溶液的顏色從紅色變?yōu)辄S綠色。5)參加異丙醇150l,渦旋混勻至絲狀或簇狀DNA為止。6)離心12000rpm5min、棄上清將EP管倒置于干凈的吸水濾紙上、確保沉淀在EP管中、參加150l70%乙醇、渦旋振蕩5s、離心12000rpm2min棄清,再次重復(fù)參加150l70%乙醇、離心棄上清后將EP管倒置于干凈的吸水濾紙上,15min。6)參加100lTB緩沖液,室溫過夜(24h)。1.4.2DNA濃度、純度的檢測采用紫外線分光光度法[3]。1.5統(tǒng)計學(xué)方式方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以s表示,組間比擬采用t檢驗;各構(gòu)成比的比擬采用2檢驗。以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1DNA不同濃度比例比擬實驗組109份樣品中DNA濃度沒有20ng/l,有13份DNA濃度在20-50ng/l之間,35份DNA濃度在51-80ng/l之間,61份樣品DNA濃度80ng/DNA濃度比例高于對照組見表1。表1實驗組與對照組DNA不同濃度比例比擬(ng/L)*P0.05與對照組比擬2.2DNA不同純度比例比擬實驗組109份樣品中DNA純度OD260/OD280比值在1.7-1.9之內(nèi)的有105份,比值小于1.7的有3份,比值1.9的有1份,DNA純度比例高于對照組見表2。表2實驗組與對照組DNA不同純度比例比擬(OD260/OD280)*P0.05與對照組比擬3討論臨床醫(yī)學(xué)疾病研究、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等流行病學(xué)的調(diào)查研究都離不開高純度、高分子量的血液基因組(DNA)[1-3]。現(xiàn)今,DNA的提取方式方法較多,也有多種品牌的提取試劑盒可供選擇使用。但青藏高原平均海拔較高,假如使用常規(guī)化學(xué)方式方法提取DNA因使用有機溶劑量較多不但運輸不便而且也會對環(huán)境造成污染。最恰當(dāng)?shù)姆绞椒椒ň褪抢醚夯蚪MDNA提取試劑盒提取DNA,不但操作簡便而且有機溶劑的使用量也非常小,并可將獲得的DNA直接用于下游實驗[4]。西藏地區(qū)地處高原大氣壓低于平原地區(qū)且枯燥低溫對DNA的提取有一定的影響,本課題組在平原地區(qū)采用天根RelaxGeneBloodDNASystem血液基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒提取DNA,根據(jù)講明書方式方法操作,獲得的DNA的濃度和純度均能知足下游實驗的需求,但在西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室(拉薩市平均海拔3600米)采用講明書方式方法提取DNA時無論是純度還是濃度均無法知足下游實驗要求所以經(jīng)太多次實驗總結(jié)提出了天根DNA提取系統(tǒng)在高原地區(qū)使用的改進方案:(1)在300微升抗凝血中參加細(xì)胞裂解液CL由原來的750l改為800(2)參加蛋白酶KFG混合液后65℃水浴由原來的10min改為過夜(20h);(3)將講明書上的參加200lTB緩沖液改為100l,65℃水浴1h改為過夜(24h)。在高原環(huán)境提取DNA的經(jīng)過中,首先將-80℃保存的抗凝血室溫融化后根據(jù)改進方案細(xì)胞裂解液使用量為血液的3倍,顛倒混勻10次使DNA分離出來[5,6];參加蛋白酶K和FG混合液后水浴20h,樣品溶液透明,推斷由于環(huán)境因素導(dǎo)致裂解時間延長;參加TB洗脫液后水浴24h后采用紫外分光光度法檢測DNA濃度和純度。根據(jù)文獻報道DNA純度判定標(biāo)準(zhǔn):純DNA,其OD260/OD280比值范圍應(yīng)為1.7-1.9;OD260/OD280比值1.9,表示清楚有RNA污染;OD260/OD280比值1.6,表示清楚有蛋白質(zhì)等污染[7]。實驗組109份樣品中35份DNA濃度在51-80ng/l之間,61份樣品DNA濃度80ng/DNA純度OD260/OD280比值在1.7-1.9之內(nèi)的有105份,比值小于1.7的有3份,比值1.9的有1份,DNA濃度和純度比例均高于對照組。采用改進方式方法在高原地區(qū)提取的DNA無論是完好性還是濃度純度均能保證后續(xù)實驗研究的需要同時合適臨床研究及檢測應(yīng)用。以下為參考文獻[1]王秀娟,肖瑞,張傳領(lǐng),等.血液基因組DNA試劑盒提取條件的優(yōu)化[J].疾病監(jiān)測與控制雜志,2021,12(9):855.[2]韓芬霞,楊麗芬.全血DNA提取方式方法的改良及PCR檢測[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,40(8):56.[3]余凱琳,鄧正棟,嚴(yán)濟.血液基因組DNA提取方式方法改進[J].南昌大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2020,54(10):9.[4]袁茂勇,郭斌,宋歡,等.DNA定量分析在宮頸病變篩查中應(yīng)用價值的研究[J].