第10章 紫外可見分光光度法

第10章

紫外-可見分光光度法河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李珺沬

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E-mail:smile0315@126.com10.1基本原理10.2紫外-可見吸收光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系10.3紫外-可見分光光度計10.4定性和定量分析方法10.5有機化合物分子結(jié)構(gòu)研究簡介光譜發(fā)展簡史1665年，牛頓，揭示太陽光是復(fù)合光1802年，渥拉斯登，發(fā)現(xiàn)太陽光譜中的暗線1815年，夫瑯和費，發(fā)現(xiàn)“夫瑯和費”線1859年，本生、基爾霍夫，物質(zhì)發(fā)射光波長與吸收光波長一致密勒，將光譜圖由可見光區(qū)擴展到紫外光區(qū)概述遠(yuǎn)紫外近紫外可見近紅外中紅外

遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5m2.5m~5.0m5.0m~1000m1.定義：研究物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)分子吸收光譜的分

析方法。（電子光譜）靈敏度：10-4~10-6g/mL準(zhǔn)確度：0.5%2.應(yīng)用：定性：鑒別不同官能團和化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的化合物；鑒別結(jié)構(gòu)相似的不同化合物。定量：單一組分的測定；多種混合組分不經(jīng)分離進行同時測定。10.1基本原理

10.1.1紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生及特征

1吸收峰：曲線上吸收最強的部位→最大吸收波（λmax）谷：峰與峰之間吸收最弱的部位→最小吸收波（λmin）肩峰：在吸收峰斜坡上的折點。末端吸收：在圖譜短波端只呈現(xiàn)強吸收而不成峰形的部位。強帶：εmax>104的吸收峰。弱帶：εmax<102的吸收峰。生色團與助色團生色團：有機化合物分子結(jié)構(gòu)中含有重鍵，能在紫外-可見光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子基團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如C＝C、C＝O、—NO2、偶氮基—N＝N—、乙炔基C≡C、腈基—C≡N、—C＝S等。

助色團：有一些含有非鍵電子的雜原子飽和基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X、—SR等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當(dāng)它們與生色團或飽和烴相連時，能使該生色團或飽和烴的吸收峰向長波方向移動，并使吸收強度增加，這樣的基團稱為助色團。紅移與藍移由于化合物結(jié)構(gòu)的改變或受溶劑的影響，使吸收峰向長波方向移動稱為紅移（長移），向短波方向移動稱為藍移(紫移)（短移）。增色效應(yīng)與減色效應(yīng)由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強度增加，稱為增（濃）色效應(yīng)，使吸收強度減小稱為減（淡）色效應(yīng)。

10.1.2Lambert-Beer定律(光吸收定律)吸光光度法的理論依據(jù)研究光吸收的最基本定律布格(Bouguer1729年)朗伯（1760年）定律：光吸收與溶液層厚度成正比比爾（1852年）定律：光吸收與溶液濃度成正比二者的結(jié)合稱為朗伯-比耳定律

1.Lambert-Beer定律：當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系。

數(shù)學(xué)表達：A＝-lgT=Ecl

A：吸光度，T：透光率，l：吸收池厚度，

c：溶液濃度，E：吸光系數(shù)注意：平行單色光均相介質(zhì)無發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)A=cl:摩爾吸光系數(shù)A=Eclc:mol/Lc:g/100mlA=cl

:百分吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)ε的討論吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；不隨濃度c和光程長度l的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；可作為定性鑒定的參數(shù)；同一吸收物質(zhì)在不同波長下的ε值不同。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。

εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達到的最大靈敏度。εmax越大，表明該物質(zhì)的吸光能力越強，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。

ε=104~105：強吸收；ε<102

：弱吸收。Lambert-Beer定律吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)，應(yīng)用于各種光度法的吸收測量。Lambert-Beer定律的加合性A=Aa+Ab+Ac+……10.1.3偏離Beer定律的因素標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對Lambert-Beer定律的偏離。1.化學(xué)因素Lambert-Beer定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10－2mol/L時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。故：Lambert-Beer定律只適用于稀溶液溶液中存在離解、締合、互變異構(gòu)、配合物形成等，使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

CrＯ42-+2H＋

=Cr2Ｏ72-+H2Ｏ溶液中CrＯ42-、Cr2Ｏ72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故：此時溶液pH對測定有重要影響。2.光學(xué)因素(1)非單色光E1=E2→A=EclE1<E2→吸光度增加→正偏差E1>E2→吸光度降低→負(fù)偏差譜帶寬度(2)雜散光不在譜帶寬度范圍內(nèi)(3)散射光和反射光

譜帶寬度范圍內(nèi)散射光：真溶液→空白對比補償渾濁溶液→A偏高反射光→A偏高(4)非平行光→A偏高3.透光率的測量誤差（1）暗噪聲光電檢測器或熱檢測器與放大電路等各部件的不確定性引起。（2）信號（散粒）噪聲分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應(yīng)的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。10.2紫外-可見吸收光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系10.2.1電子的躍遷類型躍遷類型有機化合物的紫外-可見吸收光譜，是其分子中外層價電子躍遷的結(jié)果：σ電子、π電子、n（p）電子。軌道：電子圍繞分子或原子運動的概率分布。分子軌道：當(dāng)兩個原子靠近而結(jié)合成分子時，兩個原子的原子軌道線性組合生成兩個分子軌道。一個分子軌道具有低能量——成鍵軌道一個分子軌道具有高能量——反鍵軌道分子中n電子的能級，基本上保持原來原子狀態(tài)的能級——非鍵軌道（比成鍵軌道能級高，比反鍵軌道能級低）

當(dāng)外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。有機化合物：σ→σ＊、π→π＊、n→σ＊、n→π＊、電荷遷移躍遷。無機化合物：電荷遷移躍遷、配位場躍遷。（1）σ→σ＊躍遷處于σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ＊反鍵軌道。

所需能量最大吸收光譜位于遠(yuǎn)紫外區(qū)(λ<150nm，真空紫外分光光度計檢測)。例如：甲烷：λmax125nm，乙烷：λmax135nm。（2）π→π＊躍遷處于π成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到π＊反鍵軌道。所需能量較小吸收光譜處于遠(yuǎn)紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)強吸收，摩爾吸光系數(shù)ε>104例如：不飽和烴、共軛烯烴和芳香烴類。乙烯：λmax165nm，ε>104。共軛向長波移動：丁二烯：λmax217nm，ε=21000

（3）n→π＊躍遷含有雜原子不飽和基團的化合物，其非鍵軌道中孤對電子吸收能量后，向π＊反鍵軌道躍遷。所需能量最低吸收波長：200~400nm弱吸收，ε=

10～100分子中孤對電子和π鍵同時存在時發(fā)生n→π＊躍遷例如：丙酮：λmax為279nm，ε=

22（溶劑環(huán)己烷)。（4）n→σ＊躍遷含N、O、S和鹵素等雜原子基團化合物，其雜原子中孤對電子吸收能量后向σ＊反鍵軌道躍遷。所需能量較大吸收光譜大部分在遠(yuǎn)紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察（吸收波長為~200nm）例如：一氯甲烷：λmax173nm，甲醇：λmax183nm，三甲基胺：λmax227nm。10.2.2吸收帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系R帶由n→π＊躍遷引起的吸收帶，是雜原子不飽和基團生色團的特征。n*躍遷引起C=O、—NO2、—NO、—N=N—λ~300nm弱帶（

<100），濃溶液極性溶劑，吸收峰短移K帶相當(dāng)于共軛雙鍵中π→π＊躍遷所產(chǎn)生的吸收峰。*躍遷引起強帶（

>104）隨共軛系統(tǒng)延長，*躍遷的吸收帶向長波方向移動，吸收強度增強B帶芳香族（包括雜芳香族）化合物特征吸收帶。*躍遷引起λ~256nm

~200在氣態(tài)或非極性溶劑中，苯及其許多同系物的B譜具有精細(xì)結(jié)構(gòu)（多重吸收帶）原因：振動躍遷在基態(tài)電子上的躍遷上的疊加蒸氣：孤立分子震動、轉(zhuǎn)動能級溶液：部分振動能力極性溶劑：不表現(xiàn)振動光譜，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失E帶芳香族（包括雜芳香族）化合物特征吸收帶。*躍遷引起E1帶出現(xiàn)在180nm（=4.7×104）E2帶出現(xiàn)在200nm（

=7.0×105）當(dāng)苯環(huán)上有取代基時，苯的三個特征譜帶都會發(fā)生顯著的變化，其中影響較大的是E2帶和B帶。10.2.3影響吸收帶的因素位阻影響（1）結(jié)構(gòu)因素異構(gòu)現(xiàn)象跨環(huán)效應(yīng)在有些β-、γ-不飽和酮中，雖然雙鍵與酮基不產(chǎn)生共軛體系，但適當(dāng)?shù)亓Ⅲw排列，使羰基氧的孤電子對和雙鍵的電子發(fā)生作用，以致使相當(dāng)于n→π＊躍遷的R吸收帶向上波移動。同時其吸收強度增強?；鶊F的π軌道與一個雜原子的p軌道有效交疊時，也會出現(xiàn)跨環(huán)效應(yīng)（2）溶劑效應(yīng)改變?nèi)軇O性，引起吸收帶形狀的變化。非極性→極性，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，吸收帶變向平滑。改變?nèi)軇O性，吸收帶的最大吸收波長發(fā)生變化。

非極性→極性，π→π＊躍遷：長波移動；

n→π＊躍遷：短波移動。溶劑選擇：（1）溶劑應(yīng)能很好地溶解被測試樣，溶劑對溶質(zhì)應(yīng)該是惰性的。即所成溶液應(yīng)具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性。（2）在溶解度允許的范圍內(nèi)，盡量選擇極性較小的溶劑。（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)應(yīng)無明顯吸收。（3）pH的影響酸性、中性、堿性都有明顯影響10.3

紫外-可見分光光度計0.XXX光源單色器吸收池檢測器信號處理及顯示器I0It參比樣品未考慮吸收池和溶劑對光子的作用注意比較

A=lg(I0/It)＝lg(1/T)10.3.1主要部件1.光源

發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強度，穩(wěn)定，發(fā)光面積小，連續(xù)光譜。紫外區(qū)：氫燈，氘燈可見區(qū)：鎢燈，鹵鎢燈光源波長范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段氙燈氫燈鎢燈2.單色器將光源發(fā)出的連續(xù)光譜按波長順序色散，并從中分離出一定寬度譜帶的裝置。

①進口狹縫：光源的光由此進入單色器；②準(zhǔn)直鏡：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；④聚焦透鏡：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出口狹縫。棱鏡：玻璃350～3200nm，石英185～4000nm光柵：波長范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便3.吸收池（比色皿）厚度(光程)：0.5,1,2,3,5…cm材質(zhì)：光學(xué)玻璃吸收池——可見光區(qū)熔融石英吸收池——可見、紫外光區(qū)匹配4.檢測器10.3.2光學(xué)性能與類型1.光學(xué)性能波長范圍：195~820nm波長準(zhǔn)確度：顯示值與實際值之間的誤差≤±0.5nm波長重現(xiàn)（復(fù)）性：≤0.5nm透光率測量范圍：0~150%（T）吸光度測量范圍：-0.1730~+2.00（A）光度準(zhǔn)確度：透光率滿量程誤差≤±0.5%光度重復(fù)性：重復(fù)測量透光率的變動性≤±0.5%分辨率：單色器分辨兩條靠近的譜線的能力。雜散光：以測光信號較弱的波長處所含雜散光強度百分比為指標(biāo)。如：220nm處NaI≤±0.5%2.基本的光路類型（1）單光束分光光度計簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。（2）雙光束分光光度計自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價格較高。（3）二極管陣列檢測分光光度計由光源發(fā)出，色差聚光鏡聚焦后的多色光通過樣品池，再聚焦于多色儀的入口狹縫上。透過光經(jīng)全息柵表面色散并投射到二極管陣列檢測二極管陣列的電子系統(tǒng)。

紫外-可見分光光度計補充：分光光度計的校正1.波長的校正F線（486.13nm）C線（656.28nm）可見光區(qū)紫外光區(qū)：苯蒸氣2.吸光度的校正硫酸銅、硫酸鈷銨、鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液3.吸收池的校正A:試樣溶液；B:參比溶液A:參比溶液；B:試樣溶液△A<1%AB10.4定性和定量分析方法10.4.1定性鑒別和純度檢測

定性鑒別的依據(jù)→吸收光譜的特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長）吸收峰的強度相應(yīng)的吸光系數(shù)1.定性鑒別（1）對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)

（2）對比吸光度（或吸光系數(shù)）的比值

例：VB12（3）對比吸收光譜的一致性

將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品配成相同濃度的溶液，在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對其一致性。10.4.2純度檢測化合物無吸收，雜質(zhì)有較強吸收，少量雜質(zhì)可被檢測化合物有強吸收，雜質(zhì)弱吸收或無吸收，化合物吸光系數(shù)降低雜質(zhì)吸收強于化合物吸收，吸光系數(shù)增大雜質(zhì)有吸收，可使化合物吸收光譜變形（1）雜質(zhì)檢查（2）雜質(zhì)的限量檢測通常用峰谷吸收度的比值控制雜質(zhì)限量10.4.2單組分樣品的定量方法選擇吸收峰處，提高靈敏度，減少測量誤差選擇無其他物質(zhì)干擾，較高的吸收峰不選擇末端吸收溶劑不干擾被測組分的測定組分測定波長大于溶劑的截止波長1.吸光系數(shù)法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在測定條件相同條件下，分別測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-c

關(guān)系圖。在相同條件下，測出樣品溶液吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出樣品溶液的濃度。例如：蘆丁含量測定0.710mg/25mL3.對照法10.4.3計算分光光度法簡介測量依據(jù)——吸光度的加和性：兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）

在處測定組分a,在處測組分b兩組分吸收光譜部分重疊

：測A1→b組分不干擾→可按單組分定量測兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測定1.解線性方程組法過程：2.雙波長法3.導(dǎo)數(shù)光譜法10.4.4光電比色法1.顯色反應(yīng)及其條件顯色反應(yīng)：在可見分光光度法中，將試樣組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)。顯色劑：與被測組分化合生成有色物質(zhì)的試劑。

1）顯色反應(yīng)的要求：①被測物與生成有色物有確定的定量關(guān)系；②反應(yīng)產(chǎn)物有足夠穩(wěn)定性；③反應(yīng)產(chǎn)物與試劑顏色有明顯差別④反應(yīng)產(chǎn)物摩爾吸光系數(shù)足夠大，靈敏度高；⑤選擇性好。2）反應(yīng)條件的影響①溶劑與試劑用量、性質(zhì)吸光度A與顯色劑用量cR的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。②酸堿度在相同實驗條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應(yīng)的pH范圍。緩沖溶液保持溶液pH③時間實驗確定④溫度及其他3）反應(yīng)條件的控制2.測定方法各種類型的紫外可見分光光度計和相應(yīng)的各種測定方法。10.5有機化合物分子結(jié)構(gòu)研究簡介10.5.1有機化合物的紫外吸收光譜1.飽和碳?xì)浠衔镏荒墚a(chǎn)生σ→σ*躍遷，吸收峰在真空紫外區(qū)2.含孤立助色團和生色團的飽和有機化合物當(dāng)飽和單鍵碳?xì)浠衔镏械臍湓颖谎?、氮、鹵素、硫等雜原子取代時，產(chǎn)生n→σ*躍遷、吸收峰向長波方向移動。通過共軛作用，形成大π鍵，吸收峰向長波方向移動(紅移)，吸收強度也明顯增加。3.共軛烯烴均含有羰基，存在n、σ、π三種電子，能實現(xiàn)n→π*躍遷(270～300nm，ε=10~20)，n→σ*躍遷(180nm左右)和π→π*躍遷(150nm左右)。

4.α，β-不飽和羰基化合物α,β不飽和醛酮：

乙烯基π→π*躍遷吸收帶紅移至220～260nm，ε=104左右；羰基R帶紅移至310～350nm，ε＜1005.芳香族化合物(1)苯和取代苯苯：E1、E2、B吸收帶：π→π*躍遷極性溶劑中，B帶