藥物檢驗工-12高效液相色譜法

液相色譜法

液相色譜法：以液體為流動相的色譜法稱～。1經(jīng)典液相色譜：固定相顆粒較大且不均勻

常壓下輸送流動相柱效較低

分析周期長現(xiàn)代液相色譜：固定相顆粒小且均勻

高壓下輸送流動相柱效較高分析周期短經(jīng)典液相色譜包括：

柱色譜和平面色譜高效液相色譜法HPLC第一節(jié)概述highperformanceliquidchromatography以氣相色譜理論為基礎，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)基礎上建立的一種液相色譜法HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相柱效低（H↑，n↓）分析周期長無法在線檢測，靈敏度差2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動相柱效高（H↓，n↑）分析時間大大縮短可以在線檢測，靈敏度高二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、熱穩(wěn)定性差、離子型等樣品不可檢測占有機物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┤⒏咝б合嗌V儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置固定相和流動相1、固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，ODS柱——HPLC約80%問題）2、流動相：流動相極性>固定相極性底劑（水）+與水混溶的極性調(diào)節(jié)劑

常用甲醇－水、乙腈－水等3、分離機理：疏溶劑理論為代表(了解)溶質(zhì)的保留機理是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力流動相洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）——類似GC的等溫度洗脫；以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）具有方法簡便、重復性好、色譜柱易再生等優(yōu)點。對于成分復雜的樣品，往往不能兼顧某些性質(zhì)相差很大組分的分離要求2）梯度洗脫：——類似GC的程序升溫在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例，即不斷改變其極性（兩個泵）。適于分析極性差別較大的復雜組分

縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度有時引起基線漂移、重復性較差2023/2/1峰的鑒別：1．苯；2．氯苯；3．對二氯苯4．1，2，3三氯苯；

5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；

7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；

9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脫兩種洗脫方式的比較（b）等度洗脫溶劑系統(tǒng)選擇的一般原則RBPC流動相極性越強，洗脫能力越弱。（1）溶劑種類：水+甲醇、水+乙腈（2）溶劑比例：水的比例增加，使k增大（3）溶劑pH：影響弱酸、弱減的離解流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小選擇流動相時應注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑（色譜純）作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相的pH介于2~8一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵（常用）：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞往復泵雙泵：為了克服流量的脈動。有串聯(lián)式和并聯(lián)式高效液相色譜儀輸液泵應具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴。進樣閥二、進樣系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)色譜柱（column）由柱管（不銹鋼管）和固定相組成分析柱（直徑4~6mm如4.6mm，柱長10~30cm）、制備柱柱效評價：色譜系統(tǒng)適應性試驗R≥1.5，n（符合規(guī)定），fs（0.95~1.05）柱再生：維護、保養(yǎng)、柱子的沖洗（了解）

保護柱

一般在分析柱前裝上較短的保護柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護較昂貴的分析柱，延長使用壽命。

柱恒溫器

對色譜柱嚴格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。四、檢測器

1、紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質(zhì)

檢測原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應信號（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應用廣（分析、制備）。局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應小于檢測波長。專屬型、濃度型檢測器續(xù)前紫外檢測器類型：1）固定波長檢測器：254nm2）可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈），200—400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計相似3）光電二極管陣列檢測器(DAD)：在獲得色譜圖的同時，還可以獲得個組分的光譜圖。即獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度2.紅外吸收檢測器與一般光吸收檢測器光路設計相似，其吸收池窗口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過吸收池的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測器可提供分子結(jié)構(gòu)信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動相溶劑都有紅外吸收及窗口材料限制，其應用有限。

高靈敏度、高選擇性對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應.3.熒光檢測器(FluorescenceDetector，F(xiàn)D)除紫外檢測器之外應用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；4.示差折光檢測器（DifferentialRefrativeIndexDetector,RI）5.蒸發(fā)光散射檢測器(EvaporationLightScatteringDetector,ELSD)ELSD的響應不依賴與樣品的光學特性，可以檢測沒有紫外吸收的有機物質(zhì)，如人參皂苷、黃芪甲苷等。任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響。（1）用惰性氣體霧化脫洗液（2）流動相在加熱管（漂移管）中蒸發(fā)（3）樣品顆粒散射光后得到檢測。6.電化學檢測器

基于電化學原理和物質(zhì)的電化學性質(zhì)進行檢測，主要有安培、極譜及電導等幾種類型，適用于測定具有電化學氧化還原性質(zhì)及電導的化合物，如含硝基、氨基等有機化合物及無機陰、陽離子等。1.氟塑料池體,2.工作電極,3.氟塑料或聚酯墊片,4.接參比電極，至廢液，5.接色譜柱。流動相

泵色譜柱檢測器

泵輸液分離檢測

記錄AEGBCDF進樣閥進樣1、排氣2、進樣閥3、跑基線4、開始進樣，并進行測試5、測試完畢，清洗進樣閥和整個HPLC儀器6、流量調(diào)小，先關(guān)排液閥，再關(guān)泵7、先關(guān)計算機，再關(guān)液相色譜HPLC基本流程圖定性分析和定量分析主要影響因素：時間強度數(shù)據(jù)分析及影響因素流動相和色譜柱2023/2/1第八節(jié)定性、定量分析方法（同GC法）一、定性分析方法

1.色譜鑒定法——保留時間

2.化學鑒定法

3.色譜-光譜聯(lián)用鑒定法（1）非在線色譜光譜聯(lián)用法（2）色譜-光譜聯(lián)用儀2023/2/1二、定量分析方法——同GC（自己看）

1.外標法：應用較為廣泛

2.內(nèi)標法：內(nèi)標法分為工作曲線法、內(nèi)標對比法等。

內(nèi)標對比法：不需知校正因子，又具有內(nèi)標法的定量準確度與進樣量無關(guān)的特點，方法簡便實用。在藥物分析中分析結(jié)果（含量）常用標示量％表示：§6-2定量方法1.定量依據(jù)m＝fi·Aifi定量校正因子Ai色譜峰峰面積（信號）m1+m2+m3+…+mi+…mn（1）歸一化法試樣中的成分都能出峰則有：Wi=mim=mi×100%2.測量方法：f1A1+f2A2+…+fiAi+…fnAnWi=mim=fiAi×100%即若f差別不大，則有A1+A2+…+Ai+…AnWi=Ai×100%也可以用峰高代替峰面積進行計算

fx

Axmsmx

fsAs所以ms

fsAsmxfxAx已知內(nèi)標標準樣品的濃度為cs，設未知樣品的濃度為cx，上機測定得到的峰面積分別為As

，Ax

標準物質(zhì)ms=fsAs未知物質(zhì)mx=fxAx==（不同物質(zhì)f不同）用標準物質(zhì)測出fx和fs,然后求得cx（2）內(nèi)標法01二月202333內(nèi)標物的選擇內(nèi)標物峰與試樣中所有成分的峰完全分離。內(nèi)標物峰與目標成分峰保留時間不應差太遠。內(nèi)標物具有與分析目標成分類似的化學性質(zhì)。

理化性質(zhì)與待測物相近色譜響應與待測物相近與待測物有良好的分離，但不能相距太遠與待測物的峰面積比為0.7-1.3最好，因此要根據(jù)待測物的濃度確定內(nèi)標物的添加量例