膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測-4

斜面培養(yǎng)物4支，營養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張。器材準(zhǔn)備染色瓶6組，染色架8個。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

綜合性實(shí)驗(yàn)一膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測（四）斜面培養(yǎng)物的觀察革蘭染色法肉湯接種法顯微鏡油鏡的使用斜面培養(yǎng)物的觀察從普通平板上挑取的金黃色或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，金黃色或白色。從伊紅美藍(lán)平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、不透明或半透明。為了講解方便，以后的實(shí)驗(yàn)，仍然沿用初次分離得到菌落的顏色—紫黑或粉紅。從斜面上取菌時，一般只取半個小菌落大小的菌量；接種環(huán)或接種針在菌苔上輕刮一下即可。

膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測

實(shí)驗(yàn)流程(6次課12學(xué)時）①培養(yǎng)基的制備②細(xì)菌的分離培養(yǎng)③細(xì)菌的純培養(yǎng)④細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查⑤細(xì)菌的生化試驗(yàn)等⑥細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)、結(jié)果分析→實(shí)驗(yàn)論文撰寫細(xì)菌染色法單染色法：只用一種染料染色，能清楚觀察菌體大小、形態(tài)與排列，不能鑒別細(xì)菌。復(fù)染色法（鑒別染色）：采用兩種以上的不同染料進(jìn)行先后染色，可將細(xì)菌染成不同的顏色，以便鑒別細(xì)菌?？顾崛旧?用于檢查結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等抗酸性細(xì)菌(※一些一旦用某些方法染色后，能夠抵抗酸性酒精脫色的細(xì)菌)，陽性者為紅色。特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，極體染色（用于白喉?xiàng)U菌異染顆粒染色）。結(jié)核分枝桿菌抗酸染色麻風(fēng)分枝桿菌抗酸染色產(chǎn)氣莢膜梭菌莢膜Hiss染色破傷風(fēng)梭菌芽胞芽胞染色變形桿菌鞭毛Leifson染色

白喉棒狀桿菌異染顆粒Albert染色革蘭染色法GramStaining

革蘭染色法是丹麥內(nèi)科醫(yī)生ChristainGram于1884年創(chuàng)立的一種細(xì)菌染色方法，已有120多年的歷史，仍在廣泛使用，是細(xì)菌學(xué)中最為經(jīng)典的染色法。革蘭染色法原理的三種學(xué)說通透性學(xué)說：G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，酒精不易透入，反而可使細(xì)胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細(xì)胞外滲。G-菌細(xì)胞壁比較疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫—碘復(fù)合物容易被酒精脫出。等電學(xué)說：G+菌等電點(diǎn)(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色時染液的酸堿度在pH7.0左右，電離后陽性菌帶的負(fù)電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫色?；瘜W(xué)學(xué)說：G+菌細(xì)胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成分，一般認(rèn)為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與染料—媒染劑復(fù)合物結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易脫色。革蘭染色的意義鑒別細(xì)菌：把細(xì)菌分成G+和G-兩大類。選擇抗菌藥物：例如G+球菌對青霉素敏感,G-桿菌耐藥。了解細(xì)菌的致病機(jī)理：G+菌大多產(chǎn)生外毒素,G-菌產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭染色的步驟涂片→干燥→固定→染色涂片的制備Preparea

Smear

甲→金黃，紫黑。乙→白色，粉紅。丙→金黃，紫黑。丁→白色，粉紅?！?xì)菌合適

↑細(xì)菌較多①接種環(huán)取鹽水3ul×2滴,水滴間距小于2cm。②取菌苔少許（1mm小菌落半個）與鹽水混勻，涂成大于1cm2均勻涂膜。③涂畢→環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。固定Fixation手持載玻片一端，涂膜朝上，兩個涂膜快速通過火焰外層3次，時間2～3秒鐘。促使菌體蛋白質(zhì)凝固，固定在載玻片上，以免染色水洗的時候，細(xì)菌被水洗掉。

涂片smear干燥dry革蘭染色方法步驟TheGramStainProcedure涂片→干燥→固定→↓結(jié)晶紫→初染1分鐘→水洗→↓盧戈碘液→媒染1分鐘→水洗→↓95％乙醇→脫色約20秒鐘→水洗→↓稀釋品紅→復(fù)染1分鐘→水洗→↓吸干,鏡檢?！锶【m量,涂片均勻,水洗輕緩,脫色適當(dāng)?！镉绊懜锾m染色的關(guān)鍵步驟是涂片和脫色。革蘭陽性菌Gram-Positive革蘭陰性菌Gram-NegativeG+鏈球菌G-雙球菌G+桿菌G+短桿菌G-弧菌G-螺菌液體培養(yǎng)基接種BrothTransfer—懸浮法SuspendingMethod甲→金黃,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉紅。標(biāo)記：組號，顏色37℃培養(yǎng)4小時4～5×108cfu/ml①接種環(huán)斜面取菌，在靠近培養(yǎng)基液面管壁上，上下研磨接種。②在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌。生物安全警告本次實(shí)驗(yàn)操作，可產(chǎn)生幾十至幾百個微生物氣溶膠顆粒。氣溶膠粒徑＞100um沉降很快,＜50um在0.4s內(nèi)擴(kuò)散開,＜5um通過呼吸道直接到達(dá)肺泡。Pike博士對實(shí)驗(yàn)室感染統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不明原因的感染高達(dá)82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴(kuò)散引起的。實(shí)驗(yàn)時應(yīng)坐著，在火焰周圍10～20厘米內(nèi)操作，保持安靜、有序，盡量少說話、少走動，以免感染病原菌。顯微鏡油鏡的使用P13將標(biāo)本放置、移動到光路上，用“黃色圈”的10×物鏡找到、看清楚標(biāo)本。將聚光器調(diào)到最高處。調(diào)整孔徑光闌,將與物鏡相對應(yīng)倍率調(diào)到正面（10×→100×）。在標(biāo)本觀察部位上滴加一滴香柏油。將“白色圈”100×物鏡放入光路，浸泡于香柏油中，可看到模糊物象。調(diào)整亮度及微調(diào)旋鈕，直到物象清晰為止→觀察物象，記錄結(jié)果→關(guān)閉電源。油鏡處理：擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（3:7）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。顯微鏡罩上防塵罩→橫放在實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)?！?/p>

(順德校區(qū)）實(shí)驗(yàn)臺兩側(cè)的電源插座，只能插入一個插頭，請選擇離你最近的電源插座?！ㄐ１静浚?shí)驗(yàn)臺中間，三個位的插座，中間那位插孔沒有電，不能使用，只能用兩側(cè)的插座。100倍浸油物鏡使用方法油鏡放入光路之前，一定要在標(biāo)本的觀察部位上加一滴浸油。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡進(jìn)入光路，用微調(diào)旋鈕對好焦距。如果浸油內(nèi)有氣泡，會影響觀察，可稍微旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡來回通過1～2次浸油，排除油內(nèi)氣泡。溫馨提示因染色場地受限，1～5組先涂片染色，后接種肉湯。6～10組先接種肉湯，后涂片染色。待染色和肉湯接種完畢，桌面收拾干凈，才可鏡檢，以免污染。鏡檢過的載玻片不必擦拭，直接投入玻片缸內(nèi)消毒、滅菌。革蘭染色法P15

甲→金黃，紫黑乙→金黃，紫黑丙→白色，粉紅丁→白色，粉紅肉湯接種法P10

甲→金黃乙→白色丙→紫黑丁→粉紅油鏡的使用P13

10×物鏡→看清標(biāo)本→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中→模糊物象→細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像→記錄結(jié)果→關(guān)閉電源→擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。聚光鏡孔徑光闌環(huán)上的物鏡倍率（10×或100×）轉(zhuǎn)到正面。思考題革蘭染色法的關(guān)鍵步驟是什么?為什么?染色時為什么通常要用新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物?如何使用油鏡?實(shí)驗(yàn)小結(jié)用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到金黃、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。葡萄球菌（電鏡）金黃、白色形態(tài)與染色（油鏡）酸葡萄金黃、白色菌落特征黃色白色葡萄球菌三個種的鑒別試驗(yàn)金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血漿凝固酶+--甘露醇發(fā)酵+--新生霉素敏感性SSRA蛋白+--α溶血素+--致病性強(qiáng)弱或無無注：敏感（SensitiveS）,耐藥（ResistantR）。用伊紅美藍(lán)平板,從糞便標(biāo)本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。桿菌（電鏡）紫黑、粉紅細(xì)菌的形態(tài)與染色（油鏡）紫黑